Thermosensitive chitosan-based hydrogels for extrusion-based bioprinting and injectable scaffold for articular tissue engineering

La bio-impression est une forme avancée de fabrication additive qui permet de créer des structures 3D vivantes (contenant des cellules) et de créer des modèles 3D de tissus ou, à plus long terme, des tissus implantables pour remplacer les tissus ou organes malades ou endommagés. La bio-impression connaît une croissance rapide mais doit faire face à plusieurs défis. L'un d'entre eux consiste à trouver des matériaux extrudables contenant des cellules (appelée bioencres) qui combinent toutes les propriétés requises. Les hydrogels de chitosan thermosensibles qui forment des solutions à température ambiante mais gélifient rapidement à la température du corps sont d’intéressants candidats comme bioencre mais à ce jour il n'y a pas encore eu de résultats convaincants démontrant leur potentiel. De plus, les méthodes rhéologiques permettant de prédire leur imprimabilité font toujours défaut. L'objectif général de ce doctorat était d'étudier et optimiser les hydrogels thermosensibles à base de chitosan fabriqué avec un mélange de deux bases faibles, (bêta-glycérophosphate et hydrogénocarbonate de sodium) pour la bio-impression par extrusion, notamment pour l'ingénierie des tissus articulaires. Nous avons tout d’abord développé une approche rhéologique pour évaluer leur potentiel en tant que bioencres. Les cinétiques de gélification à température ambiante et du corps ont été caractérisées. Puis les essais de viscosité et de récupération ont été adaptés pour prendre en compte l’absence de stabilité des gels. La fidélité de forme et les propriétés mécaniques des structures imprimées ont également été caractérisées en fonction du taux de cisaillement appliqué et les résultats corrélés avec les données rhéologiques. Nous avons démontré qu'il était possible d'imprimer une structure avec une fidélité et une maniabilité adéquate; cependant, une concentration élevée de chitosan (3%p/v) est nécessaire, ce qui entraîne un taux de mortalité élevé des cellules, tandis que réduire la concentration à 2%p/v entraîne une très mauvaise fidélité de la forme. Nous avons surmonté ces limites en utilisant une approche basée sur la bio-impression FRESH (Freeform reversible embedding of suspended hydrogel). Un bain de support chaud a été conçu afin de soutenir les structures bioprintées et d'améliorer la thermoréticulation du chitosan pendant l'impression. Cette approche augmente drastiquement la fidélité et les propriétés mécaniques des structures imprimées avec une concentration de chitosane (2% p/v) adaptée à l'encapsulation de cellules. ii Enfin, nous avons étudié l'impact du chargement de particules de bioverre osteoconducteurs dans ces hydrogels thermosensibles, en vue de leur utilisation pour la fabrication de tissus osseux minéralisés. Les propriétés mécaniques et la cytocompatibilité in vitro étant affectées de manière négative par l'ajout de bioglass, notre stratégie a consisté à concentrer le bioverre sous forme de microbilles, puis incorporer ces microbilles dans l'hydrogel à base de chitosan chargé de cellules. Cette nouvelle stratégie a permis d'améliorer considérablement les propriétés mécaniques et la viabilité des cellules. Cet hydrogel bioactif hybride n’est pas utilisable comme bioencre, mais il est injectable et pourrait être utilisé comme matrice injectable pour la régénération de défauts osseux. Cependant, il reste encore beaucoup d’optimisation à faire pour la bio-impression de tissus de gradient complexes.Bioprinting is an advanced method that enables to engineer living 3D structures mimicking the tissue complexity found in-vivo. It allows to create 3D tissues to study drugs/biological mechanisms, also, in longer-term, implantable tissue to replace diseased/damaged body tissues/organs. Bioprinting is growing rapidly but faces several challenges. One of them is to find ideal bioinks which combine all the required properties. Hydrogels are generally used since cells require an aqueous environment. But it is very challenging to stack hydrogels into a 3D structure because hydrogels are weak by nature and cannot support the structure without collapsing. Among the potential candidates are thermosensitive chitosan hydrogels which form solutions at room temperature but rapidly gel at body temperature. However, their potential in bioprinting has not been yet studied. Moreover, comprehensive rheological methods to predict their printability are still missing. The general objective of this Ph.D. was to study and optimize the thermosensitive chitosan-based hydrogels for extrusion-based bioprinting and injectable scaffold for articular tissue engineering. The first objective was to develop a rheological approach to study printability of these time- and temperature-dependent hydrogels and assess their potential as bioinks. Chitosan-based physical hydrogels prepared by combining chitosan acidic solution with weak bases like beta-glycerophosphate and sodium-hydrogen-carbonate were studied. Gelation kinetics, shear-thinning viscosity as a function of shear rate corresponding to that applied during printing, and recovery tests were performed. The resolution and mechanical properties were characterized as a function of applied shear rate and results were correlated with rheological data. This work allowed us to determine the best chitosan hydrogel formulation for 3Dprinting and compare it with conventionally used bioink, alginate/gelatin. This methodology can also be useful for other temperature- and time-dependent materials. We demonstrated that printing structures with adequate fidelity and handability using chitosan-based hydrogels was feasible; however, a high concentration (3%w/v) was required, leading to high mortality rate of encapsulated cells. Decreasing chitosan concentration resulted in poor shape fidelity. The second objective was therefore to develop a method using Freeform reversible embedding of suspended hydrogel (FRESH) bioprinting to overcome these limitations. A warm support bath was designed to support chitosan-based bioprinted structures and enhance chitosan thermo-crosslinking during printing. This approach iv drastically increases the fidelity and mechanical properties of structures printed with low concentration chitosan (2%w/v) suitable for cell encapsulation. Lastly, we studied the impact of loading bioglass particles into such thermosensitive hydrogels for potential bone-mineralized tissue repair, which could promote bone ingrowth through osteoconductivity. The mechanical properties and in-vitro cytocompatibility are affected adversely by bioglass addition. A new strategy was implemented to encapsulate bioglass within chitosan-based microbeads, then incorporate these microbeads in the cell-laden chitosan-based hydrogel. This strategy improved mechanical properties and cell viability. This hybrid hydrogel could be used to form an injectable cell-loaded scaffold. The bioactive microbeads were freezable, increasing their potential for clinical applications. We demonstrated the potential of the thermosensitive chitosan-based hydrogels for bioprinting, especially with the FRESH approach. This opens interesting avenues toward tissue engineering. However, much works still remain to be done before bioprinting complex gradient tissues

3D bioprinting of pancreatic islets

Hintergrund/Ziel: Um Langzeitkomplikationen bei Diabetes mellitus Typ 1 (T1D) zu verhindern, können Spenderinseln transplantiert werden, was allerdings lebenslange rigorose Immunsuppression erfordert. Durch Verkapselung der Inselzellen kann die Immunsuppression umgangen werden, aber Upscaling ist schwierig. Ziel dieser Arbeit war es, eine Strategie für das Plotting skalierbarer, semipermeabler, makroporöser Scaffolds mit einem großen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis zu entwickeln, um lebensfähige und funktionsfähige Pankreasinseln zu Plotten. Methoden: Die für diese Arbeit verwendete Hydrogelmischung bestand aus 3 % Alginat mit 9 % Methylcellulose (MC) als Verdickungsmittel, um eine plottbare Paste herzustellen. Die existierende Mischung musste für die Verwendung von hochaufgereinigtem, d. h. nicht immunogenem ('clinical-grade') Alginat anstelle des zuvor verwendeten zellverträglichen, aber weniger streng aufgereinigten ('research-grade') Alginates adaptiert werden. Für die Charakterisierung der zellfreien Mischung wurden immer Vergleiche zwischen Pasten gezogen, die mit den beiden verschiedenen Alginaten hergestellt wurden. Die Stabilität wurde über rheologische Messungen und die Freisetzung von Ionen und MC bestimmt. Die Permeabilität für Glukose und Insulin wurde mittels Aufnahme- und Freisetzungs-Assays sowie in einem für diese Arbeit entwickelten Diffusionskammersystem analysiert. Da sich Alginatgele als ausreichend permeabel erwiesen haben und eingekapselte Inseln ihre Funktionalität behalten, wurde die Permeabilität von Alginat- und Alg/MC-Gelen verglichen. In früheren Veröffentlichung wurde Alg/MC bereits als kompatibel mit dem Plotting von Einzelzellen beschrieben. Um die Kompatibilität mit endokrinen Zellen zu testen, wurde die β Zelllinie INS-1 verwendet und in Alg/MC Pasten, die mit unterschiedlich sterilisierter MC hergestellt worden waren, getestet. Für pankreatische Inseln, die als Zellcluster empfindlicher auf Scherstress reagieren als Einzelzellen, wurde erfolgreich ein Workflow für das Einbringen in die hochviskose Mischung entwickelt. Dabei wurden die Inseln mit einem Spatel vorsichtig in das Material gefaltet und mit einer Nadel mit einem Innendurchmesser von 840 µm geplottet. Das Plotten pankreatischer Inseln wurde sowohl mit adulten Inseln aus der Ratte als auch mit neonatalen insel-ähnlichen Clustern aus dem Schwein (NICC) durchgeführt und auf Verteilung, Überleben, Apoptose und das Vorhandensein von Hormonen mit Färbungen getestet. Die Funktionalität wurde über Glukose-stimulierter Insulinsekretion (GSIR) analysiert, wobei Inseln Insulin in Reaktion auf hypoglykämische (3,3 mM Glukose) oder hyperglykämische (16,4 mM Glukose) Bedingungen freisetzen, welches im Überstand nachgewiesen wurde. Ergebnisse: Pasten, die mit den verschiedenen Alginaten hergestellt wurden, zeigten eine vergleichbare Viskosität, die für die Herstellung stabiler Strukturen geeignet ist. Clinical-grade Scaffolds hatten eine leicht geringere Vernetzungsdichte, was auf Unterschiede im M:G-Verhältnis zurückgeführt wurde. Mit 70 mM SrCl2 vernetzte Scaffolds blieben in RPMI+ über 21 Tage stabil. Die anhaltende Freisetzung von Vernetzungsionen über den Kultivierungszeitraum war unabhängig vom Alginattyp, aber abhängig von der Art des verwendeten Mediums. Innerhalb der ionisch vernetzten Scaffolds liegt die umgekehrt thermisch gelierende MC bei 37°C mit hoher Wahrscheinlichkeit teilweise geliert vor. Die Freisetzung von nicht gelierter MC konnte in Abhängigkeit der Temperatur gezeigt werden und wurde in allen getesteten Scaffold-varianten in unterschiedlicher Menge beobachtet. Bei Permeabilitätsanalysen folgte die im Kammersystem beobachtete allgemeine Kinetik der Diffusion dem normalen Verlauf der Diffusion durch Hydrogele. Die Permeabilität für Glukose war zwischen den Materialien vergleichbar, d.h. es konnte weder ein Einfluss des Alginat-Typs und der Vernetzungsdichte, noch des Vorhandenseins bzw. der Freisetzung von MC über die Zeit nachgewiesen werden. Die Permeabilität für Insulin muss aufgrund der Bindung an die Diffusionskammer und der mangelnden Stabilität der Gelscheiben in weiteren Experimenten verifiziert werden. Eine vorläufige Schlussfolgerung aus den hier vorgestellten Ergebnissen ist eine leicht verringerte Permeabilität in Alg/MC-Gelen im Vergleich zu reinen Alginatgelen. INS-1 wurden erfolgreich in Alg/MC geplottet. Die Überlebensrate direkt nach dem Plotten war in Anbetracht der Raten immortalisierter mesenchymaler Stammzellen vergleichsweise gering, INS-1 erholten sich jedoch innerhalb einer Woche und proliferierten innerhalb der Scaffolds zu großen metabolisch aktiven Zellclustern. Dies war abhängig von der Sterilisationsmethode: Die Verwendung autoklavierter sowie UV-sterilisierter MC resultierte in Pasten die das Überleben unterstützten. Im Gegensatz dazu führte die Verwendung von mit überkritischem CO2 sterilisierter MC nicht zur Entwicklung von Zellclustern. Metabolisch aktive, Insulin enthaltende Ratteninseln lagen innerhalb der Scaffolds gleichmäßig verteilt vor. Vergleichbar mit Kontrollinseln in Suspensionskultur betrug die Viabilität geplotteter Inseln über einen Zeitraum von 14 Tagen 70-80 %. Der DNA-Gehalt der Scaffolds reduzierte sich über insgesamt 21 Tage stark. In allen über 7 Tage analysierten Inseln war eine begrenzte Menge apoptotischer Kerne vorhanden. In den Kontrollinseln waren diese bevorzugt zentral, in den geplotteten Inseln bevorzugt peripher lokalisiert. Die Anzahl der apoptotischen Kerne unterschied sich zwischen den Kontrollinseln und den geplotteten Inseln nicht signifikant. Insgesamt blieben die Morphologie und die Viabilität der Inseln während des Einbringens in die Mischung und beim Plotten erhalten. Die pankreatischen Hormone Insulin und Glukagon wurden in der Kontrolle und der geplotteten Inseln in angemessener Verteilung und Lokalisation nachgewiesen. Die Stimulation der Ratteninseln wurde über insgesamt 7 Isolationen verifiziert und zeigte eine geringere ab-solute Insulinsekretion aus den geplotteten Inseln als aus den Kontrollinseln, aber an Tag 4 und 7 der Kultur einen vergleichbaren aus dem GSIR berechneten Stimulationsindex (SI). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Insulinsekretion bei sukzessiv variierender Stimulation mit Glukose dem Verlauf der Glukosekonzentration folgt. Dies zeigt, dass die geplotteten Inseln die externe Glukosekonzentration nachweislich wahrnehmen und entsprechend reagieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die absolute Insulinsekretion aus den geplotteten Inseln zwar geringer war als die der Kontrollinseln, die relative Funktionalität in den geplotteten Scaffolds jedoch erhalten blieb. Zur Validierung der Ergebnisse von adulten Ratteninseln wurden in einer vorläufigen Studie die potentiell klinisch translatierbaren, aber empfindlicheren, NICC verwendet. Metabolisch aktive, Insulin enthaltende NICC, lagen innerhalb der Scaffolds gleichmäßig verteilt vor. Die Viabilität der NICC war mit etwa 60 % vergleichsweise gering, aber vergleichbar mit der der Kontroll-NICC und änderte sich über einen Kultivierungszeitraum von 21 Tagen nicht signifikant. In allen geplotteten NICC konnten lebendige Zellen nachgewiesen werden, während eine geringe Anzahl Kontroll-NICC in der Lebendfärbung fast kein Signal zeigten. Die Anzahl der apoptotischen Kerne nahm im Verlauf von 7 Tagen bei den geplotteten, nicht aber bei den Kontroll-NICC signifikant zu. Die pankreatischen Hormone Insulin, Glukagon und Somatostatin wurden in einer geringen Anzahl von zufällig innerhalb der Cluster verteilten Zellen über einen Zeitraum von 7 Tagen nachgewiesen. Die Funktionalität wurde weder durch das Einbringen in das Material noch durch das Plotten beeinflusst. Unter Verwendung eines GLP-1-Analogons zur Amplifikation der Reaktion zeigten geplottete und Kontroll-NICC eine vergleichbare Funktionalität. Der SI nahm im Laufe der Kultivierungszeit jedoch ab und lag nach 14 bzw. 21 Tagen Kultur in geplotteten und Kontrollproben unter 2. Schlussfolgerungen: Die adaptierte Alg/MC-Mischung zeigte ausreichende Stabilität und Permeabilität für das Plotten pankreatischer Inseln. In einer Proof-of-Concept-Studie mit adulten Ratteninseln wurde gezeigt, dass die hier adaptierte Alg/MC-Mischung generell für das Plotting lebendiger und funktionaler pankreatischer Inseln geeignet ist. Vorläufige Ergebnisse, die mit einer geringen Anzahl von Wiederholungen und Proben erstellt wurden, deuten darauf hin, dass Alg/MC auch ein grundlegend geeignetes Material für das Plotten von NICC ist. Die weitere Charakterisierung und insbesondere die weitere Materialadaption zur Unterstützung des Überlebens und der Ausreifung von NICC in vitro werden in einer Folgestudie vorgenommen werden.:Table of contents Abbreviations 1 1 Motivation 3 2 Introduction and state of the art 5 2.1 Pancreatic islets and diabetes mellitus type 1 5 2.1.1 Anatomy and function of the pancreas and pancreatic islets 5 2.1.2 Insulin biosynthesis, release and function 7 2.1.3 Diabetes mellitus type 1 (T1D) 9 2.1.4 Current treatment options for T1D 11 2.2 Surgical replacement of β-cells 13 2.2.1 Islet transplantation 13 2.2.2 Xenotransplantation 15 2.2.3 Encapsulation of islets 17 2.3 3D bioprinting in medical research 22 2.3.1 Extrusion-based 3D bioprinting 22 2.3.2 Bioplotting of islets 24 3 Materials & Methods 26 3.1 Cell culture 26 3.1.1 Cell lines 26 3.1.2 Primary islets from rat 26 3.1.3 Neonatal porcine islet-like cell clusters 27 3.2 Material preparation and characterisation 27 3.2.1 Hydrogel preparation 27 3.2.2 3D plotting of cell-free hydrogels for material characterisation 28 3.2.3 Rheological characterisation 28 3.2.4 Quantification of ion release 29 3.2.5 Determination of methylcellulose content 29 3.2.6 Preparation of cell-free hydrogel discs 29 3.2.7 Permeability measurements 30 3.3 Plotting and characterisation of cell-laden constructs 32 3.3.1 Incorporation of cells & scaffold preparation 32 3.3.2 Staining methods for the characterisation of (embedded) cells 32 3.3.3 Functional analysis of islets: Glucose stimulated insulin release (GSIR) 34 3.4 Statistics 35 4 Results 36 4.1 Adaptation & characterisation of cell-free Alg/MC 36 4.1.1 Paste viscosity and scaffold stability 36 4.1.2 Scaffold composition during incubation under cell culture conditions 38 4.1.3 Permeability for glucose & insulin 42 4.2 Adaptation & characterisation of islet cell incorporation into the Alg/MC blend 58 4.2.1 Sterilisation of MC: influence on β-cell survival and behaviour 58 4.2.2 Incorporation of pancreatic islets into the highly viscous Alg/MC blend 61 4.2.3 Needle diameter for the plotting of pancreatic islets 64 4.3 Plotting of adult murine pancreatic islets 66 4.3.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 66 4.3.2 Functionality of bioplotted murine islets 74 4.4 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC) 80 4.4.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted NICC 80 4.4.2 Functionality of bioplotted NICC 87 5 Discussion 92 5.1 Cell-free Alg/MC 93 5.1.1 Gel viscosity and crosslinking of alginate 93 5.1.2 Release of MC 99 5.1.3 Permeability for glucose & insulin 106 5.2 Cell incorporation into Alg/MC 118 5.2.1 Incorporation of β-cells 118 5.2.2 Incorporation of pancreatic islets 119 5.3 Plotting of adult murine pancreatic islets 121 5.3.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 121 5.3.2 Functionality of bioplotted murine islets 124 5.4 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC) 127 5.4.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 127 5.4.2 Functionality of bioplotted NICC 130 Summary 134 Zusammenfassung 137 References 140 Addendum 172 A.1 Supplementary data for the results 172 Supplementary data for “4.1.1. Paste viscosity and scaffold stability” 172 Supplementary data for “4.1.2 Scaffold composition during incubation under cell culture conditions” 173 Supplementary data for “4.1.3 Permeability for glucose & insulin” 175 Supplementary data for “4.2.1 Sterilisation of MC: influence on β-cell survival and beha-viour” 178 Supplementary data for “4.3.2 Functionality of bioplotted murine islets” 182 Supplementary data for “4.4.2 Functionality of bioplotted NICC” 187 A.2 Supplementary data for the discussion 189 Supplementary data for “5.1.1. Gel viscosity and crosslinking of alginate” 189 Supplementary data for “5.1.2. MC release” 191 Supplementary data for “5.1.3 Permeability for glucose & insulin” 195 Supplementary data for “5.2.1 Incorporation of β-cells” 197 Supplementary data for “5.4.1 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC)” 198 List of figures 196 List of tables 197 List of publications 198 Acknowledgements 20

Compact laser-assisted tools for high-resolution additive manufacturing

Micro-additive manufacturing has become an enabling technology in biomedical research as it allows for instance creating functional microstructures or studying cellular interactions at the microscale. Among the various manufacturing techniques laser-actuation offers a versatile control means for microprinting applications since it both enables jetting liquids and curing photoresists to form three-dimensional microstructures. In the first part of this thesis, the potential of laser-actuation for embedded three-dimensional printing was studied. In conventional embedded three-dimensional printing, soft microstructures are built by directly depositing ink filaments with a microextruder into a gel-like support material. As microextruders produce continuous ink filaments, they do not allow optimally mimicking the complex three-dimensional micro-architectures of tissues. Thus, to improve the resolution of three-dimensional embedded printing, laser-induced forward transfer, a high-velocity liquid jetting technique, was employed to achieve depth-controlled liquid delivery within a gel-like support substrate. Interestingly, controlling the deposition depth of liquid droplets adds a degree of freedom to laser-induced forward transfer, turning this conventional two-dimensional patterning technique into a direct three-dimensional printing technique. In the second part of this thesis, the potential of laser-actuation to build a compact laser- assisted toolkit for high-resolution manufacturing was further studied. The fabrication of advanced functional parts with multi-material and multi-resolution features stills remains challenging. Existing microfabrication techniques rely on complex and bulky devices, which prevent processing parts with several manufacturing tools on a single platform due to space constraints. Hence, to enable multiprocess additive manufacturing, miniaturized laser-assisted drop-on-demand and direct writing tools were developed in this thesis. In the first component of this compact toolkit, a laser-induced flow focusing phenomenon was studied to generate viscous micro-droplets through a 300-µm glass microcapillary, thus paving the way for a compact drop-on-demand device operating on a wider range of printable liquids than standard inkjet printers. The second component of the miniaturized toolkit is based on oxygen-inhibited single-photon photopolymerization. This non-linear photopolymerization process was investigated and then implemented through a 70-µm multimode fiber to demonstrate three-dimensional microfabrication through an endoscope-like tool. This curing probe provides a compact and affordable alternative to conventional direct laser writing devices, which rely on two-photon absorption, a non-linear absorption phenomenon that entails using femtosecond lasers. Such a miniature additive manufacturing toolkit could also open up possibilities for the fabrication of microstructures in areas otherwise inaccessible, for instance in in vivo applications

Development of a novel 3D nanofibre co-culture model for characterisation of neural cell degeneration

Neurodegenerative diseases are prolonged and progressive. In general, they affect individuals in the latter stages of their lives. The pathology of neural cell degeneration is widely researched, and most current therapeutic strategies aim to delay its progression by either promoting neuronal regeneration, resurrecting the lost brain function with stimulation electrodes or by cell replacement therapies. Neuronal and glial cells are researched to better understand the physiological condition and to find a cure for degenerative diseases. In current in vitro techniques, cells dissociated from their natural three-dimensional (3D) tissue and cultured on flat surfaces present a significant drawback in drug discovery and cell therapy research. Communication and various signal transduction between neuronal and glial cells in the in vivo system are purely based on a dynamic convoluted systematic network constructed and expanded in a 3D manner. Recently, electrospun 3D nanofibre scaffolds have gained attention among researchers for their ability to mimic the natural 3D microenvironment that cells inhabit. Developing an in vitro system which emulates the in vivo 3D habitat of neural cells has been a significant challenge. This thesis reports on the advantages of using novel 3D suspended nanofibre membrane technology to create better models for both drug discovery and therapeutic implants. In this study, we focused on developing a suitable sterile nanofibre porous membrane using Polyacrylonitrile (PAN), and Jeffamine® ED-2003 modified polyacrylonitrile (PJ) to provide favourable conditions for neuronal and glial proliferation, differentiation and survival. The study was designed, engineered and optimised three different state-of-the-art fully suspended nanofibre models that are highly multi-functional and suitable for investigating several diseases and chronic conditions. We have characterised the growth and survival of human SH-SY5Y neuroblastoma, human U-87MG glioblastoma, human ReNcell CX neural progenitor and primary neural cells from E18 rat hippocampal tissue on both PAN and PJ nanofibre scaffolds. Our investigations and chronic studies have shown extended survival of cells on a scaffold in comparison to these cells cultured on the base of cell adherent tissue culture plates (TCP). Differentiation cell culture trials have demonstrated that both PAN and PJ are capable of supporting cell differentiation and immunofluorescence and western blot analysis has shown elevated levels of key differentiation marker proteins on the cells cultured on the suspended scaffolds compared to TCP. Our findings indicate that the new 3D suspended nanofibre scaffolds support improved growth, survival and differentiation of both cell populations as well as increasing the sensitivity of the cells to Toxins when compared to the sensitivity of cells growth of the base of TCPs. Moreover, chronic exposures to Toxins using the novel co-culture scaffold model has shown prolonged neuronal survival in the presence of astrocytes. Together, our findings suggest the potential for the 3D nanofibre approach to improve in vitro therapeutic studies and our co-culture system, which creates a better mimic, should lead to a reduced number of animals used for pharmaceutical development and in the screening of compounds to find neuroprotective compounds to prevent degeneration of neural cells

Investigation of molecular effects of the soy-derived phytoestrogen genistein on cardiomyocytes by proteomic analysis

2011 Fall.Includes bibliographical references.The soy-derived phytoestrogen genistein (GEN) has received attention for its potential to benefit the cardiovascular system by providing protection to cardiomyocytes against pathophysiological stresses. Although GEN is a well-known estrogen receptor (ER) agonist and a non-specific tyrosine kinase inhibitor, current understanding of the complex cellular and molecular effects of GEN in cardiomyocytes is still incomplete. The overall goal of this dissertation is to use high throughput proteomics methodologies to better understand the molecular action of GEN in cardiomyocytes and to identify proteins and pathways that respond to GEN treatment. The first study of this project focused on the concentration-dependent proteome changes in cultured HL-1 cardiomyocytes due to GEN treatments. Proteins from HL-1 cardiomyocytes treated with 1 μM and 50 μM GEN were prefractionated into hydrophilic and hydrophobic protein fractions and were analyzed by two-dimensional electrophoresis followed by protein identification using tandem mass spectrometry (MS). In total, 25 and 62 differential expressed proteins were identified in response to 1 μM and 50 μM of GEN treatment, respectively. These results suggest that 1 μM GEN enhanced the expression of heat shock proteins and anti-apoptotic proteins, while 50 μM GEN down-regulated glycolytic and antioxidant enzymes, potentially making cardiomyocytes more susceptible to energy depletion and apoptosis. The second study, employing a two-dimensional liquid chromatography and tandem MS shotgun proteomics workflow, was carried out to dissect the cellular functions changed in cardiomyocytes by ER-dependent or ER-independent actions of GEN. In this study, primary cardiomyocytes isolated from male adult SD rats were treated with 10 μM GEN without or with 10 μM ER antagonist ICI 182,780 (ERA) before proteomics comparison. A total of 14 and 15 proteins were found differentially expressed in response to the GEN, and the GEN+ERA treatment, respectively. Cellular functions such as glucose and fatty acid metabolism and cardioprotection were found to be modulated by GEN in an ER-dependent fashion, while proteins involved with steroidogenesis and estrogen signaling were identified as novel effectors of GEN via ER-independent actions. In this study, a consensus-iterative searching strategy was also developed to enhance the sensitivity of the shotgun proteomic approach. In the last study, an attempt to explore the response to a GEN stimulus in the signaling pathways, we developed a phosphopeptide enrichment method to assist the detection of protein phosphorylation in a complex peptide mixture. The quantitative performance of a sequential immobilized metal affinity chromatography (SIMAC) protocol was evaluated. We further conducted a preliminary application of this protocol in a large-scale, quantitative, label-free phosphoproteomics study to explore the alterations of protein phosphorylation patterns due to ER-independent GEN action in the SD rat cardiomyocytes. This project demonstrates the usefulness of proteomics methodologies to screen novel molecular targets influenced by GEN in cardiomyocytes. This is also the first investigation of the complex cellular impact of this soy-derived phytoestrogen in cardiomyocytes via a systems biology perspective

The Viscous

Slime, goo, gunge, gloop, gels, sols, globules, jellies, emulsions, greases, soaps, syrups, glues, lubricants, liquid crystals, moulds, plasmas, and protoplasms – the viscous is not one thing, but rather a quality of resistance and flow, of stickiness and slipperiness. It is a state of matter that oozes into the gaps of our everyday existence, across age groups, between cultures and disciplines.Since the large-scale extraction of petroleum in the 19th century the viscous has witnessed a proliferation in the variety of its forms. Mechanized industry required lubricants and oil distillation produced waste products that were refined to form Vaseline. From this age, new viscous forms and technologies emerged, products from plastic (and plastic explosives) to cosmetics, glycerine, asphalt, sexual lubrication, hydro- and aero- gels, even anti-climb paint.Based on unique and wide-ranging research, The Viscous is the first major investigation of viscous encounter and possibility over the course of the last century, not simply as a material state, but also an imaginative event. We enter into a story of matter at its most wayward, deviant, hesitant, and resistant.From asphalt lakes to industrial molasses tanks, from liquid crystals squirming in our screens to milk fetishes, The Viscous discloses gooeyness as a peculiarly modern phase of matter. "Everything oozes," as Beckett’s Estragon famously proclaims in Waiting for Godot. Viscous dynamics are exposed as not only hugely various in a post industrial age, but particularly useful ways of thinking, feeling, writing, and making in a time of ecological anxiety

Learning plan networks in conversational video games

Thesis (S.M.)--Massachusetts Institute of Technology, School of Architecture and Planning, Program in Media Arts and Sciences, 2007.Includes bibliographical references (p. 121-123).We look forward to a future where robots collaborate with humans in the home and workplace, and virtual agents collaborate with humans in games and training simulations. A representation of common ground for everyday scenarios is essential for these agents if they are to be effective collaborators and communicators. Effective collaborators can infer a partner's goals and predict future actions. Effective communicators can infer the meaning of utterances based on semantic context. This thesis introduces a computational cognitive model of common ground called a Plan Network. A Plan Network is a statistical model that provides representations of social roles, object affordances, and expected patterns of behavior and language. I describe a methodology for unsupervised learning of a Plan Network using a multiplayer video game, visualization of this network, and evaluation of the learned model with respect to human judgment of typical behavior. Specifically, I describe learning the Restaurant Plan Network from data collected from over 5,000 players of an online game called The Restaurant Game.by Jeffrey David Orkin.S.M

BloomCasting for publish/subscribe networks

Publish/subscribe has been proposed as a way of addressing information as the primary named entity in the network. In this thesis, we develop and explore a network architecture based on publish/subscribe primitives, based on our work on PSIRP project. Our work is divided into two areas: rendezvous and Bloomcasting, i.e. fast Bloom filter-based forwarding architecture for source-specific multicast. Taken together these are combined as a publish/subscribe architecture, where publisher and subscriber matching is done by the rendezvous and Bloom filter-based forwarding fabric is used for multicasting the published content. Our work on the inter-domain rendezvous shows that a combination of policy routing at edges and an overlay based on hierarchical distributed hash tables can overcome problems related to incremental deployment while keeping the stretch of queries small and that it can solve some policy related problems that arise from using distributed hash tables in inter-domain setting. Bloom filters can cause false positives. We show that false positives can cause network anomalies, when Bloom filters are used for packet forwarding. We found three such anomalies: packet storms, packet loops, and flow duplication. They can severely disrupt the network infrastructure and be used for denial-of-service attacks against the network or target services. These security and reliability problems can be solved by using the combination of three techniques. Cryptographically computed edge pair-labels ensure that an attacker cannot construct Bloom filter-based path identifiers for chosen path. Varying the Bloom filter parameters locally at each router prevents packet storms and using bit permutations on the Bloom filter locally at each router prevent accidental and malicious loops and flow duplications.Yksi Internetin puutteista on se, ettei ole mitään kaikille sovelluksille yhteistä tapaa nimetä informaatiota. Julkaisija/tilaaja-malli on yksi ehdotus, jolla Internet-arkkitehtuuria voisi muuttaa tämän puutteen korvaamiseksi. Väitöskirjassani kehitän julkaisija/tilaaja-malliin pohjautuvan verkkoarkkitehtuurin, joka pohjautuu työlleni PSRIP-projektissa. Arkkitehtuuri koostuu kohtaamisjärjestelmästä, joka yhdistää julkaisijat ja tilaajat, ja Bloom-suodattimiin pohjautuvasta monen vastaanottajan viestintäkanavasta, jolla julkaistu sisältö toimitetaan tilaajille. Internetin kattavalla kohtaamisjärjestelmällä on korkeat vaatimukset. Tutkin kahta erilaista menetelmää: paikallisiin reitityspolitiikoihin pohjautuvaa järjestelmää ja toinen hajautettuihin hajautustauluihin pohjautuvaa järjestelmää. Ensimmäisen haasteena on skaalautuvuus erityisesti silloin, kun kaikki Internetin verkot eivät osallistu järjestelmän ylläpitoon. Jälkimmäinen on ongelmallinen, sillä siihen pohjautuvat järjestelmät eivät voi taata, mitä reittiä julkaisu ja tilaus -viestit kulkevat järjestelmässä. Näin viesti saattaa kulkea myös julkaisijan tai tilaajan kilpailijan verkon kautta. Ehdotan väitöskirjassani menetelmää, joka yhdistää reunoilla politiikkaan pohjautuvan julkaisu/tilaaja reitityksen ja verkon keskellä yhdistää nämä erilliset saarekkeet hierarkista hajautettua hajautustaulua hyödyntäen. Julkaisujen toimittamiseen tilaajille käytän Bloom-suodattimiin pohjautuvaa järjestelmää. Osoitan väitöskirjassani, että Bloom-suodattimien käyttö pakettien reitittämiseen voi aiheuttaa verkossa merkittäviä vikatilanteita, esimerkiksi pakettiräjähdyksen, silmukan, tai samaan vuohon kuuluvien pakettien moninkertaistumisen. Nämä ongelmat aiheuttavat verkolle turvallisuus- ja luotettavuusongelmia, jotka voidaan ratkaista kolmen tekniikan yhdistelmällä. Ensinnäkin, Bloom-suodattimiin laitettavat polun osia merkitsevät nimet lasketaan kryptografiaa hyödyntäen, ettei hyökkääjä kykene laskemaan Bloom-suodatinta haluamalleen polulle ilman verkon apua. Toisekseen, reitittimet määrittävät Bloom suodatinparametrit paikallisesti siten, ettei pakkettiräjähdyksiä tapahdu. Kolmannekseen, kukin reititin uudelleen järjestelee Bloom-suodattimen bitit varmistaen, ettei suodatin ole enää sama, jos paketti kulkee esimerkiksi silmukan läpi ja palaa samalle takaisin samalle reitittimelle.

The Second International Symposium on Tilapia in Aquaculture

Proceedings of the symposium held in 1987 in Bangkok, Thailand, by tilapia scientists to discuss strategies for future research and development in the tilapia industry worldwide. Contains 82 full papers, 17 poster abstracts and author and species indexes. The full papers were presented under 7 sessions: culture systems, management and production; pathology; genetics and reproduction; nutrition, physiology; biology and ecology; and economics and socioeconomics.Tilapia culture, Conferences