Der Einfluß von LXR auf die Entwicklung der diabetischen Nephropathie

Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselkrankheit mit weltweit zunehmender Prävalenz. Etwa ein Drittel der Betroffenen entwickelt eine renale Manifestation im Sinne einer diabetischen Nephropathie. Es wird vermutet, dass Veränderungen im Fettstoffwechsel sowie die Akkumulation von Lipiden in der Niere zu einer beschleunigten Progression der diabetischen Nephropathie beitragen. In dieser Promotionsarbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Leber – X – Rezeptor (LXR), ein Schlüsselregulator des Fettstoffwechsels und des Immunsystems, den Ausprägungsgrad einer diabetischen Nephropathie verringern kann. Um dies zu prüfen, wurde an zwei Tiermodellen, hyperglykämische sowie hyperlipidämische Mäuse mit einer Defizienz des LDL – Rezeptors (LDLR-/-) oder der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS-/-), der Effekt der Aktivierung von LXR durch den synthetischen Liganden GW3965 untersucht. Die Behandlung der diabetischen und hyperlipidämischen Versuchstiere mit GW3965 reduzierte die renale Lipidakkumulation und verbesserte die Nierenfunktion sowie die Nierenmorphologie. Regulatorische Gene, welche am reversen Cholesterintransports beteiligt sind (ABCA1, ABCG1), wurden hochreguliert, während die Expression proinflammatorischer und profibrotischer Zytokine (TNFα, TGFβ) gehemmt wurde. Des Weiteren wurden Parameter für Lipid – assoziierten oxidativen und nitrosativen Stress (Xanthin – Oxidoreduktase, 3 – Nitrotyrosin) durch LXR – Aktivierung mittels GW3965 reduziert. Durch ergänzende in vitro – Versuche konnten die Ergebnisse aus dem Tierversuch bestätigt werden. In HK-2 Zellen bewirkte die Behandlung mit GW3965 ebenfalls die Hochregulierung von Genen des reversen Cholesterintransports und verminderte die Bildung von Lipidtröpfchen bei Stimulation mit oxidiertem LDL. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von LXR durch GW3965 die mitochondriale Aktivität und die Bildung reaktiver Sauerstoffradikale reduziert. Dies erlaubt einen Einblick in den Mechanismus der Bildung renaler Läsionen, die durch Akkumulation von Lipiden hervorgerufen werden, und welcher mittels LXR umfassend reguliert werden kann. Die Ergebnisse veranschaulichen die umfassenden regulatorischen Effekte von LXR bei der Vermeidung von Nierenschäden bei Diabetes mellitus. Die Aktivierung von LXR verbesserte in signifikantem Maße die Lipid – akzellerierte diabetische Nephropathie in Mäusen. Synthetische Liganden für LXR sind vielversprechende therapeutische Substanzen bei der Prävention renaler Beteiligung bei diabetischen Patienten und sind im Fokus aktueller Forschung

Isolierung und Charakterisierung von mRamp, einem neuen Retinoid-induzierten Homolog in der Maus

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Mikroskopische und molekularbiologische Analyse des chloroplastidären Ribonukleoproteins CP29A während der Kältestressantwort in Arabidopsis thaliana

Das plastidäre Genexpressionssystem höherer Pflanzen ist hochkomplex und differiert beträchtlich von dem prokaryotischer Vorfahren. Jeder einzelne Schritt der RNA-Prozessierung und Translation ist abhängig von nukleär kodierten, posttranslational in den Chloroplasten importierten Proteinen, insbesondere RNA-Bindeproteinen, wie den chloroplastidären Ribonukleoproteinen (cpRNP). Ein wichtiger und im Fokus dieser Arbeit stehender Vertreter ist CP29A, welcher ein breites Bindespektrum aufweist und in vivo mit einer Vielzahl von Transkripten interagiert. Frühere Studien belegen dennoch, dass ein Knockout von CP29A unter Standardkultivierungsbedingungen nicht in einem makroskopisch vom Wildtyp differierenden Phänotyp resultiert. Unter Kältestress hingegen ist CP29A für die Entwicklung photosynthetisch aktiver Chloroplasten essenziell. Zur tiefergehenden Charakterisierung der molekularen Funktion von CP29A wurde in der vorliegenden Arbeit eine genomweite Transkriptomanalyse der cp29a-Mutante durchgeführt. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass CP29A bereits unter Standardkultivierungsbedingungen das Spleißen vieler plastidärer Introns unterstützt. Kälteinduziert weist das phänotypisch auffällige Gewebe der cp29a-Mutante eine globale Beeinträchtigung der Genexpression sowie massive Defekte der plastidären mRNA-Prozessierung auf. Da die Funktionalität von Proteinen substanziell von ihrer Lokalisation abhängig ist, wurden antikörperbasierte mikroskopische Lokalisationsstudien durchgeführt. Diese dokumentieren, dass CP29A kältestressinduziert zu dynamischen Granula lokalisiert, welche separiert von den plastidären Nukleoiden vorliegen und mit einem häufig in stressinduzierten Granula detektierten Protein kolokalisieren.The plastid gene expression system in higher plants is highly complex and differs significantly from the gene expression system of the prokaryotic ancestors. Each individual step of RNA-processing and translation is dependent on nuclear-encoded RNA-binding proteins, such as chloroplast ribonucleoproteins (cpRNP), which are imported post-translationally into the chloroplast. An important representative is CP29A, which has a broad binding spectrum and interacts with a large number of transcripts in vivo. Earlier studies show that, while a knockout of CP29A under standard-cultivation-conditions does not result in a macroscopically different phenotype, under cold stress conditions CP29A is essential for the development of photosynthetically active chloroplasts. For a more detailed characterization of the molecular function of CP29A, a genome-wide transcriptome analysis of the cp29a mutant was carried out. It could be shown for the first time that CP29A already supports the splicing of many chloroplast introns under standard-cultivation-conditions. Cold-induced the phenotypically noticeable mutant tissue shows a global impairment of gene expression and massive defects in plastid mRNA processing. Since the functionality of proteins is substantially dependent on their localization, antibody-based microscopic localization studies were carried out. They reveal that cold stress-induced CP29A localizes to dynamic granules, which are separate from the plastid nucleoids and colocalize with a protein commonly detected in stress-induced granules

Die Rolle des Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha (PDGF-Rα) in der Genese pathologischer Veränderungen durch die mechanische Beatmung der neugeborenen Lunge

Die Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist die häufigste Form der chronischen Lungenerkrankung des Frühgeborenen und aufgrund ihrer Langzeitfolgen von großer klinischer Relevanz. Die Inzidenz ist trotz der verbesserten Intensivbehandlung von Frühgeborenen nicht zurückgegangen. Die mechanische Beatmung mit sauerstoffreichem Gas (MV-O2) gilt als Hauptrisikofaktor der BPD. Die wesentlichen histologischen Merkmale der BPD sind die Störung der Alveolo- und Vaskulogenese. Vorangegangene Studien schreiben der Dysregulation von Wachstumsfaktoren wie des Platelet Derived Growth Factor A (PDGF-A) und dessen korrespondierenden Rezeptors PDGF-Rα eine Rolle in der Pathophysiologie der BPD zu. Ein kausaler Zusammenhang zwischen einer reduzierten PDGF-Rα Signaltransduktion und einer Störung der alveolären Septierung im Rahmen der BPD konnte bisher jedoch nicht schlüssig gezeigt werden. Unsere Studie untersuchte daher die Rolle der reduzierten PDGF-Rα Expression als ursächlichen Treiber der Entwicklung BPD-charakteristischer Veränderungen am Modell der neugeborenen Maus in einem etablierten präklinischen, experimentellen Modell der Erkrankung. Hierzu wurden neonatale PDGF-Rα+/+ und transgene PDGF-Rα+/- Mäuse für 8 Stunden (h) mit Sauerstoff (inspiratorische Sauerstofffraktion (FiO2) 0,4) behandelt oder einer mechanischen Beatmung mit 40% Sauerstoff unterzogen. Die histologische Beurteilung umfasste die Quantifizierung der Alveolengröße und -zahl, sowie Septen- und Mikrogefäßzahl sowie die qualitative und quantitative Erfassung der Elastinfasern und des Vorläuferproteins Tropoelastin. Die Beurteilung der Wachstumsfaktorexpression fokussierte sich auf die PDGF-A und Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) Signaltransduktion. Darüber hinaus wurden ergänzende Untersuchungen zur Apoptoserate und Inflammation unter MV-O2 vorgenommen. Unsere Studie zeigte, dass die charakteristischen histopathologischen Merkmale der BPD wie die Störung der Alveolo- und Vaskulogenese unter dem Einfluss einer postnatalen Schädigung durch MV-O2 durch eine PDGF-Rα Haploinsuffizienz induziert werden können. Die Lungen von beatmeten PDGF-Rα+/- Mäusen zeigten im Vergleich zu Wildtyp (WT) Mäusen eine reduzierte Zahl und veränderte Lokalisation der PDGF-Rα positiven Zellen, eine veränderte Elastinfaseranordnung, eine signifikant geringere Zahl simplifizierter Alveolen oder ihrer Vorstufen und eine signifikant erhöhte Apoptoserate von Endothelzellen, die mit einer signifikant reduzierten Mikrogefäßzahl und reduzierten pulmonalen Expression des endothelialen Wachstumsfaktors VEGF-A und seines Rezeptors Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGF-R2) in den heterozygoten Tieren assoziiert war. Die Ergebnisse indizieren, dass die Produktion von VEGF-A PDGF-abhängig gesteuert wird und PDGF-Rα positive Myofibroblasten (MFB) neben ihrer Rolle im Prozess der sekundären Septierung eine Rolle für die Gefäßentwicklung spielen. Auf experimenteller Ebene werden weitere in vivo und in vitro Studien die zentrale Rolle der PDGF-Rα abhängigen Signaltransduktion und die Rolle des MFB in der Pathogenese der neonatalen chronischen Lungenerkrankung klären und die Interaktion weiterer Signalwege aufdecken. Um einen Behandlungsansatz für die neonatale Lunge abzuleiten, könnte in Folgestudien untersucht werden, ob die Optimierung der PDGF-Rα Signaltransduktion durch die Behandlung neonataler PDGF-Rα+/- Mäuse mit dem Liganden PDGF-A die schädigende Wirkung der MV-O2 auf die Alveolo- und Vaskulogenese reduziert

Untersuchung zur Speicherung und Funktion von Sulfatid in Neuronen anhand von transgenen Mäusen

Metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine genetisch bedingte Defizienz des lysosomalen Enzyms Arylsulfatase A und führt zur lysosomalen Akkumulation von Sulfatid sowie einer schwerwiegenden Demyelinisierung im zentralen Nervensystem des Menschen. Ein Tier-Modell der MLD sind die ASA-Knockout-Mäuse, die durch die Inaktivierung des ASA-Gens erzeugt wurden. Die ASA-Knockout-Mäuse entwickeln lysosomale Sulfatid-Speicherungen ähnlich wie bei der humanen MLD.Galaktosylceramid (GalCer) und 3-O-Sulfogalactosylceramid (Sulfatid) gehören zu den häufigsten Sphingolipiden in Myelin-produzierenden Glia-Zellen, konnten jedoch beide auch in Neuronen nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um endogenes oder aus Glia-Zellen stammendes GalCer und Sulfatid handelt, ist bislang noch nicht eindeutig geklärt. Han beschrieb ein Modell, in dem Sulfatid durch Apolipoprotein E von Astrozyten zu Neuronen transportiert wird. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Sulfatid-Akkumulation in den Neuronen von ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Mäusen. Unabhängig vom zusätzlichen eingebrachten ApoE-Knockout zeigten die ASA/ApoE-Knockout-Mäuse ebenso wie die ASA-Knockout-Mäuse einen gleichsam erhöhten Sulfatid-Gehalt im Cortex und im gesamten Gehirn im Alter von 18-24 Monaten. Die Sulfatid-Akkumulation wurde durch histochemische Färbungen mit Alcianblau nachgewiesen. Sulfatid-Speicherung wurde bereits bei jüngeren Tieren (12 Monate) und verstärkt bei den älteren Tieren in Neuronen bei den ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Mäusen detektiert. Die neuronale Sulfatid-Anreicherung, besonders im Bereich der Medulla oblongata und Pons, deutet darauf hin, dass die ApoE-Defizienz in den Doppel-Knockout-Tieren keinen wesentlichen Einfluss auf die Akkumulation von Sulfatid in Neuronen hat.Daher ist die Anreicherung von Sulfatid entweder von einem anderen Transporterweg abhängig, oder die Akkumulation in den Neuronen entsteht durch endogen synthetisiertes Sulfatid. Transgene Thy-1-CGT-Mäuse überexprimieren die Ceramid-Galaktosyltransferase (CGT) unter dem neuronalen Promotor Thy-1 und synthetisieren in den Neuronen C18:0-GalCer und Sulfatid in verschiedenen Bereichen des Gehirns. Diese transgenen CGT-Mäuse weisen auf dem C57BL/6Hintergrund eine signifikant reduzierte Lebensspanne auf. Zusätzlich wurde bei den transgenen CGT Mäusen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber akustischen Reizen festgestellt. Nach einer relativ milden Geräusch-Stimulation wie Schlüsselklirren (ca. 90-100 dB) entwickelten die transgenen CGTTiere letale audiogene Anfälle, die sich in unkontrolliertem Hin- und Herlaufen äußerte, die mit Krämpfen verbunden waren und sogar teilweise zum Tod des transgenen Tieres führten. Allerdings konnten bei den transgenen Mäusen, die die Cerebrosid-Sulfotransferase (CST) in den Neuronen überexprimieren, keine solchen Anfälle beobachtet werden. In Doppel-Transgenen Tieren, die sowohl CGT wie CST exprimieren, wurde dagegen eine stärkere Sensitivität gegen audiogene Reiz-Induktion im Vergleich zu den transgenen CGT-Mäusen erfasst. Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, korreliert diese verstärkte audiogene Sensitivität mit dem erhöhten Sulfatid-Gehalt in der neuronalen Plasmamembran von CST/CGT-transgenen Mäusen im Vergleich zu transgenen CGT-Mäusen. Verursacht durch den erhöhten Sulfatid-Gehalt in den Neuronen kommt es zu den letalen audiogenen Anfällen bei den transgenen Mäusen. Eine mögliche therapeutische Option für die lysosomale Speicherkrankheit MLD ist die Substrat-Reduktions-Therapie, wobei die Synthese des akkumulierenden Sulfatids durch spezifische Inhibitoren verhindert werden soll. Im Falle der MLD wird der letzte Schritt der Sulfatid-Synthese, der Transfer einer Sulfatgruppe auf Galaktosylcerebrosid von der CST katalysiert. Die Produktion einer großen Menge an CST-Protein sollte es ermöglichen, eine detaillierte Struktur-Analyse sowie die Testung von potentiellen Inhibitoren durchzuführen. Allerdings wird die Expression einer großen Menge des CST-Proteins durch dessen ineffizienten Export aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) erschwert. Untersuchungen mit verschiedenen CST-Fusions-Proteinen ergaben, dass die CST zum größten Teil im ER zurückgehalten wird. Diese ER-Retention könnte möglicherweise durch die luminale katalytische Domäne hervorgerufen werden. Ein Fusions-Protein aus der amino-terminalen Membran-Domäne der CST und einem GFP-Reporter-Protein wurde effizient in den Golgi-Apparat transportiert, im Gegensatz dazu verblieb ein Fusions-Protein,bestehend aus der katalytischen Domäne der CST und der amino-terminalen Transmembran-Domäne eines Plasmamembran-Proteins (Dipeptidylpeptidase IV), im ER.Da die relative Menge des im ER zurückgehaltenen CST-Proteins mit dem Expressions-Gehalt ansteigt,könnte der Transport der CST aus dem ER durch einen noch unbekannten ER-Export-Faktor limitiert sein

Prozessierung und Sortierung der lysosomalen Ntn-Hydrolase Plbd2 und Erzeugung von Plbd1- und Plbd2-defizienten Mausmodellen

Linhorst A. Prozessierung und Sortierung der lysosomalen Ntn-Hydrolase Plbd2 und Erzeugung von Plbd1- und Plbd2-defizienten Mausmodellen. Bielefeld: Universität Bielefeld; 2018.The lysosomal matrixprotein Plbd2 (phospholipase B-domain containing 2) was initially identified in the proteomic analyses of mannose-6-phosphate (M6P)-modified proteins (Kollmann *et al*., 2005; Sleat *et al*., 2005). The lysosomal localisation was confirmed by indirect immunfluorescence in cultured cells (Kollmann *et al*, 2005) and by cofractionation analyses of lysosome-enriched fraction from mouse liver (Deuschl *et al*., 2006). Moreover, Plbd2 was assigned to the superfamily of N-terminal nucleophile (Ntn)-hydrolases by X-ray crystallography due to structural homology (Lakomek *et al*., 2009). With the assignment to the Ntn-hydrolase family, we assume an amidase activity, while the physiological substrate is not yet identified. In this study, the cleavage of the Pro-Plbd2 into an α- and a β-fragment was shown to occur autocatalytically at acidic conditions. While a mutation of the catalytic cystein in the active site inhibited autocatalysis *in vitro*, cleavage still took place intracellularly due to endoprotease activity, most probably by Cathepsin L, cleaving a linker region between the α- and β-fragment of Plbd2. Whether removal of the linker peptide is necessary for enzymatic activity, remains to be elucidated after the identification of the physiological substrate. In contrast to other known Ntn-hydrolases, further processing of the β-fragment can be observed for Plbd2. This processing was shown to be related to the activities of Cathepsin B, Cathepsin L and AEP and most likely takes place at an asparaginyl-residue in position 394 of Plbd2. A direct activity of AEP at this position was ruled out, whereas an indirect effect of AEP by activation of Cathepsin B and Cathepsin L appears to be more likely. By incubation with cysteine protease inhibitors, the cleavage of the β-fragment was inhibited, which is consistent with the involvement of CtsB or CtsL. Further proteolytic truncations at the N- and C-termini of the recombinant Plbd2 were detected *in vitro*. Plbd2 is predominantly sorted in a mannose-6-phosphate (M6P)-dependent manner which was also confirmed in this work. Furthermore, in cells with defects of the M6P-receptors the existence of an M6P-independent pathway for Plbd2 was postulated. However, the correct processing of Plbd2 did not occur in these cells. In order to get access to the physiological role of Plbd2, knockout mouse models for Plbd2 and the homologous protein Plbd1 were generated using the CRISPR-Cas9 technology. In both mouse models strongly reduced transcript levels and virtually no residual protein could be detected for Plbd2 and Plbd1, respectively. In initial analyses the animals had no apparent phenotype that would suggest the function of the proteins. While Plbd2 was particularly detected in macrophages, Plbd1 appeared to be more present in dendritic cells and cells of the bone marrow. A function of the proteins in the hydrolysis of amid bonds to degrade pathogenic macromolecules or immunological relevant mediators of inflamation is postulated in this work

Aktivierung von Hämozyten des Tabakschwärmers Manduca sexta nach bakteriellen Infektionen

Hämozyten sind bei Insekten an Abwehrreaktionen, wie z. B. Neusynthese und Sekretion verschiedener antimikrobieller Substanzen, Phagozytose und Einkapselung beteiligt. Bisher gibt es nur wenige Erkenntnisse über die bei einer zellulären Abwehr beteiligten Moleküle und Mechanismen. Zwei unterschiedliche methodische Ansätze, proteinchemisch und molekularbiologisch, wurden zum Nachweis an Aktivierungsvorgängen von Hämozyten beteiligter Moleküle genutzt. Proteinchemisch konnten mehrere Proteine mit Affinität zu Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert werden. Zwei Proteine von ca. 21 kDa wurden gereinigt und N-terminal sequenziert. Molekularbiologisch gelang die Klonierung von 4 cDNAs, aus zuvor produzierten Expressionsbibliotheken des Fettkörpers und aus Hämozyten. Aufgrund der festgestellten Sequenzhomologien und der ersten Ergebnisse zur biochemischen Charakterisierung ist davon auszugehen, dass die von diesen cDNAs kodierten Proteine eine Funktion in der Hämozytenaktivierung besitzen. Das Hämozyten-Aggregation-inhibierende Protein (HAIP) zeigt eine Sequenzhomologie zu Chitinase-verwandten Wachstumsfaktoren. Die RNA ist im Fettkörper nachweisbar, Hämozyten enthalten sie nicht. Bakterielle Infektion führt nicht zu einer gesteigerten Expression von HAIP. Immunhistochemisch konnte HAIP in Hämozyten nachgewiesen werden. Daneben wurde gezeigt, dass HAIP Chitin bindet. Chitosan und Xylose können diese Bindung teilweise antagonisieren. Immunolektin-3 (IML-3) zeigt eine Sequenzhomologie zu verschiedenen Calcium-abhängigen Lektinen. Die IML-3-RNA ist im Fettkörper nachweisbar, wo seine Expression durch bakterielle Infektionen induziert wird. Hämozyten enthalten keine IML-3-RNA. In der Hämolymphe sind mit dem gegen das rekombinante Protein hergestellten Antikörper drei Proteine detektierbar. Nach bakteriellen Infektionen ist IML-3 in Plasmatozyten, neben granulären Zellen wichtigsten phagozytierenden Zellen, nachweisbar. Ferner konnten erste Anhaltspunkte für eine Assoziation von IML-3 mit sich selbst oder anderen Hämolymphkomponenten gefunden werden. Fettkörper-Protease-1 (FP-1) zeigt eine Sequenzhomologie zu CLIP-Domänen Proteasen. FP--1 wird von Hämozyten und Fettkörper exprimiert, im Fettkörper ist die Expression induzierbar. In Infektionsexperimenten konnte eine Aktivierung der FP-1 nach Injektion Gram-positiver Bakterien beobachtet werden. Darüber hinaus konnte das Protein in Oenozytoiden, den Prophenoloxidase synthetisierenden Zellen, nachgewiesen werden. Die vollständige cDNA des M. sexta Hemocytin (MsHc) wurde kloniert und analysiert. Das kodierte Protein ist homolog zum von-Willebrand Faktor. Die RNA des MsHc ist in Hämozyten nachweisbar, bakterieller Infektionen führen nicht zu einer Induktion