Small-scale encapsulation method for novel drug substances with associated characterization of highly diluted samples

One of the biggest challenges in the development of novel active ingredients is the lack of available drug substances in early stages of development. Nevertheless, in many cases an early decision must be made whether the active ingredient can be delivered to the desired site of action by a suitable carrier system or not. Therefore, it is desirable to manufacture carrier systems in a very small scale avoiding unnecessary material waste. Following this idea, polymer-based nanoparticles were manufactured acting as drug carriers. They were produced using a microfluidic system to keep the required quantities of utilized substances as small as possible. The microfluidic system was especially designed for this application controlling the respective volumetric flow rates of the used liquids by applying air pressure. This allows to tune the desired microfluidic mixing ratio very precisely without any time delay. In addition, the drug loading of produced particles was optimized, with particular attention paid to the type and concentration of utilized stabilizers. By specific adjustments to the mentioned factors, the drug loading could be maximized. Furthermore, particle concentrations of the prepared suspensions were investigated. For this purpose, a microfluidic device was developed precisely determining the number of particles contained by the produced and highly diluted nanosuspensions.Eines der größten Probleme bei der Etablierung von neuartigen Wirkstoffen ist der Mangel an verfügbareren Substanzen in frühen Entwicklungsabschnitten. Da dennoch häufig in Frühphasen der Entwicklung eine Entscheidung gefällt werden muss, ob sich der Wirkstoff mit Hilfe eines geeigneten Trägersystems an den gewünschten Wirkort transportieren lässt, ist es wünschenswert Trägersysteme im Kleinstmaßstab herzustellen. Hierzu wurden polymerbasierte Nanopartikel als Wirkstoffträger verwendet, welche mittels eines mikrofluidischen Systems hergestellt wurden, um die einzusetzenden Substanzmengen so gering wie möglich zu halten. Das dazu verwendete mikrofluidische System wurde speziell für diesen Einsatz entworfen und ist luftdruckgetrieben, wodurch die jeweiligen Volumenströme der verwendeten Flüssigkeiten gesteuert werden. Dadurch kann sehr präzise und ohne zeitliche Verzögerung ein gewünschtes mikrofluidisches Mischungsverhältnis erreicht werden. Außerdem wurde für die hergestellten Partikel die Wirkstoffbeladung optimiert, wobei ein besonderes Augenmerk auf den Typ und die Konzentration der verwendeten Stabilisatoren gelegt wurde. Durch gezielte Anpassungen konnte die Wirkstoffbeladung maximiert werden. Des Weiteren wurden die hergestellten Suspensionen bezüglich ihrer Partikelkonzentration untersucht. Hierfür wurde ein mikrofluidisches Element entwickelt, mit dem sich gerade bei hochverdünnten Nanosuspensionen die Anzahl an enthaltenen Partikeln präzise ermitteln lässt

Improving FRAP and SPT for mobility and interaction measurements of molecules and nanoparticles in biomaterials

An increasing amount of pharmaceutical technologies are being developed in which nanoparticles play a crucial role. The rational development of these technologies requires detailed knowledge of the mobility and interaction of the nanoparticles inside complex biomaterials. The aim of this PhD thesis is to improve fluorescence microscopy based methods that allow to extract this information from time sequences of images. In particular, the fluorescence microscopy techniques Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Single Particle Tracking (SPT) are considered. FRAP modelling is revisited in order to incorporate the effect of the microscope's scanning laser beam on the shape of the photobleached region. The new model should lead to more straightforward an accurate FRAP measurements. SPT is the main focus of the PhD thesis, starting with an investigation of how motion during image acquisition affects the experimental uncertainty with which the nanoparticle positions are determined. This knowledge is used to develop a method that is able to identify interactions between nanoparticles in high detail, by scanning their trajectories for correlated positions. The method is proven to be useful in the context of drug delivery, where it was used to study the intracellular trafficking of polymeric gene complexes. Besides SPT data analysis, it is also explored how light sheet illumination, which allows to strongly reduce the out of focus fluorescence that degrades the contrast in SPT experiments, can be generated by a planar waveguide that is incorporated on a disposable chip. The potential as platform for diagnostic measurements was demonstrated by using the chip to perform SPT size and concentration measurements of cell-derived membrane vesicles. The results of this PhD thesis are expected to contribute to the effort of making accurate SPT and FRAP measurements of nanoparticle properties in biomaterials more accessible to the pharmaceutical research community

SURFACE ENABLED LAB-ON-A-CHIP (LOC) DEVICE FOR PROTEIN DETECTION AND SEPARATION

Sensitive and selective chemical/biological detection/analysis for proteins is essential for applications such as disease diagnosis, species phenotype identification, product quality control, and sample examination. Lab-on-a-chip (LOC) device provides advantages of fast analysis, reduced amount of sample requirements, and low cost, to magnificently facilitate protein detection research. Isoelectric focusing (IEF) is a strong and reliable electrophoretic technique capable of discerning proteins from complex mixtures based on the isoelectric point (pI) differences. It has experienced plenty of fruitful developments during previous decades which has given it the capability of performing with highly robust and reproducible analysis. This progress has made IEF devices an excellent tool for chemical/biological detection/analysis purposes. In recent years, the trends of simple instrument setting, rapid analysis, small sample requirement, and light labor intensity have inspired the LOC concept to be combined with IEF to evolve it into an “easily-handled chip with hours of analysis” from the earlier method of “working with big and heavy machines in a few days.” Although IEF is already a mature technique being applied, further LOC-IEF developments are still experiencing challenges related to its limitations such as miniaturizing the device scale without harming the resolving/discerning ability. With the facilitation of newly technologically advanced/improved fabrication tools, it is completely possible to address challenges and approach new limits of LOC-IEF. In this dissertation, a surface enabled printing technique, which can transfer liquid to a surface with prescribed patterns, was firstly introduced to IEF device fabrication. By employing surface enabled printing, a surface enabled IEF (sIEF) device running at a scale of 100 times smaller than those previously reported was designed and fabricated. Commercial carrier ampholytes (PharmalyteTM) with different pH range were engaged to generate a continuous pH gradient on sIEF device. Device design and optimized fabrication conditions were practically investigated; establishment of pH gradient was verified by fluorescent dyes; dependencies of electric field strength and carrier ampholytes concentration were systematically examined. To further optimize the sIEF system, dependencies of surface treatment and additive chemicals were explored. Fluorescent proteins and peptides were tested for the separation capability of sIEF. Finally, the well optimized sIEF system was used as a tool for real protein (hemoglobin variants and monoclonal antibody isoforms) separations. Hemoglobin variants test results revealed that sIEF is capable of separating amphoteric species with pI difference as small as 0.2. Monoclonal protein tests demonstrated the capability of sIEF to be a ready-to-use tool for protein structural change monitoring. In conclusion, this new sIEF approach has lower applied voltages, smaller sample requirements, a relatively quick fabrication process, and reusability, making it more attractive as a portable, user-friendly platform for qualitative protein detection and separation

High-throughput Single-Entity Analysis Methods: From Single-Cell Segmentation to Single-Molecule Force Measurements

This work is focused on the development of new microscopy-based analysis methods with single-entity resolution and high-throughput capabilities from the cellular to the molecular level to study biomembrane-associated interactions. Currently, there is a variety of methods available for obtaining quantitative information on cellular and molecular responses to external stimuli, but many of them lack either high sensitivity or high throughput. Yet, the combination of both aspects is critical for studying the weak but often complex and multivalent interactions at the interface of biological mem-branes. These interactions include binding of pathogens such as some viruses (e.g., influenza A virus, herpes simplex virus, and SARS-CoV-2), transmembrane signaling such as ligand-based oli-gomerization processes, and transduction of mechanical forces acting on cells. The goal of this work was to overcome the shortcomings of current methods by developing and es-tablishing new methods with unprecedented levels of automation, sensitivity, and parallelization. All methods are based on the combination of optical (video) microscopy followed by highly refined data analysis to study single cellular and molecular events, allowing the detection of rare events and the identification and quantification of cellular and molecular populations that would remain hidden in ensemble-averaging approaches. This work comprises four different projects. At the cellular level, two methods have been developed for single-cell segmentation and cell-by-cell readout of fluorescence reporter systems, mainly to study binding and inhibition of binding of viruses to host cells. The method developed in the first pro-ject features a high degree of automation and automatic estimation of sufficient analysis parameters (background threshold, segmentation sensitivity, and fluorescence cutoff) to reduce the manual ef-fort required for the analysis of cell-based infection assays. This method has been used for inhibition potency screening based on the IC50 value of various virus binding inhibitors. With the method used in the second project, the sensitivity of the first method is extended by providing an estimate of the number of fluorescent nanoparticles bound to the cells. The image resolution was chosen to allow many cells to be imaged in parallel. This allowed for the quantification of cell-to-cell heterogeneity of particle binding, at the expense of resolution of the individual fluorescent nanoparticles. To account for this, a new approach was developed and validated by simulations to estimate the number of fluo-rescent nanoparticles below the diffraction limit with an accuracy of about 80 to 100 %. In the third project, an approach for the analysis and refinement of two-dimensional single-particle tracking ex-periments was presented. It focused on the quality assessment of the derived tracks by providing a guide for the selection of an appropriate maximal linking distance. This tracking approach was used in the fourth project to quantify small molecule responses to hydrodynamic shear forces with sub-nm resolution. Here, the combination of TIRF microscopy, microfluidics, and single particle tracking enabled the development of a new single molecule force spectroscopy method with high resolution and parallelization capabilities. This method was validated by quantifying the mechanical response of well-defined PEG linkers and subsequently used to study the energy barriers of dissociation of mul-tivalent biotin-NeutrAvidin complexes under low (~ 1.5 to 12 pN) static forces. In summary, with this work, the repertoire of appropriate methods for high-throughput investigation of the properties and interactions of cells, nanoparticles, and molecules at single resolution is expand-ed. In the future, the methods developed here will be used to screen for additional virus binding inhib-itors, to study the oligomerization of membrane receptors on cells and model membranes, and to quantify the mechanical response of force-bearing proteins and ligand-receptor complexes under low force conditions

Liquid Metal Printing with Scanning Probe Lithography for Printed Electronics

In den letzten Jahren hat das „Internet der Dinge“ (Englisch Internet of Things, abgekürzt IoT), das auch als Internet of Everything (Deutsch frei „Internet von Allem“) bezeichnet wird, mit dem Aufkommen der „Industrie 4.0“ einen Strom innovativer und intelligenter sensorgestützter Elektronik der neuen Generation in den Alltag gebracht. Dies erfordert auch die Herstellung einer riesigen Anzahl von elektronischen Bauteilen, einschließlich Sensoren, Aktoren und anderen Komponenten. Gleichzeitig ist die herkömmliche Elektronikfertigung zu einem hochkomplexen und investitionsintensiven Prozess geworden. In dem Maße, wie die Zahl der elektronischen Bauteile und die Nachfrage nach neuen, fortschrittlicheren elektronischen Bauteilen zunimmt, steigt auch die Notwendigkeit, effizientere und nachhaltigere Wege zur Herstellung dieser Bauteile zu finden. Die gedruckte Elektronik ist ein wachsender Markt, der diese Nachfrage befriedigen und die Zukunft der Herstellung von elektronischen Geräten neu gestalten könnte. Sie erlaubt eine einfache und kostengünstige Produktion und ermöglicht die Herstellung von Geräten auf Papier- oder Kunststoffsubstraten. Für die Herstellung gibt es dabei eine Vielzahl von Methoden. Techniken auf der Grundlage der Rastersondenlithografie waren dabei schon immer Teil der gedruckten Elektronik und haben zu Innovationen in diesem Bereich geführt. Obwohl die Technologie noch jung ist und der derzeitige Stand der gedruckten Elektronik im industriellen Maßstab, wie z. B. die Herstellung kompletter integrierter Schaltkreise, stark limitiert ist, sind die potenziellen Anwendungen enorm. Im Mittelpunkt der Entwicklung gedruckter elektronischer Schaltungen steht der Druck leitfähiger und anderer funktionaler Materialien. Die meisten der derzeit verfügbaren Arbeiten haben sich dabei auf die Verwendung von Tinten auf Nanopartikelbasis konzentriert. Die Herstellungsschritte auf der Grundlage von Tinten auf Nanopartikelbasis sind komplizierte Prozesse, da sie das Ausglühen (Englisch Annealing) und weitere Nachbearbeitungsschritte umfassen, um die gedruckten Muster leitfähig zu machen. Die Verwendung von Gallium-basierten, bei/nahe Raumtemperatur flüssigen Metallen und deren direktes Schreiben für vollständig gedruckte Elektronik ist immer noch ungewöhnlich, da die Kombination aus dem Vorhandensein einer Oxidschicht, hohen Oberflächenspannungen und Viskosität ihre Handhabung erschwert. Zu diesem Zweck zielt diese Arbeit darauf ab, Methoden zum Drucken von Materialien, einschließlich Flüssigmetallen, zu entwickeln, die mit den verfügbaren Druckmethoden nicht oder nur schwer gedruckt werden können und diese Methoden zur Herstellung vollständig gedruckter elektronischer Bauteile zu verwenden. Weiter werden Lösungen für Probleme während des Druckprozesses untersucht, wie z. B. die Haftung der Tinte auf dem Substrat und andere abscheidungsrelevante Aspekte. Es wird auch versucht, wissenschaftliche Fragen zur Stabilität von gedruckten elektronischen Bauelementen auf Flüssigmetallbasis zu beantworten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine auf Glaskapillaren basierenden Direktschreibmethode für das Drucken von Flüssigmetallen, hier Galinstan, entwickelt. Die Methode wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen implementiert: Einmal in einer „Hochleistungsversion“, basierend auf einem angepassten Nanolithographiegerät, aber ebenfalls in einer hochflexiblen, auf Mikromanipulatoren basierenden Version. Dieser Aufbau erlaubt einen on-the-fly („im Fluge“) kapillarbasierten Druck auf einer breiten Palette von Geometrien, wie am Beispiel von vertikalen, vertieften Oberflächen sowie gestapelten 3D-Gerüsten als schwer zugängliche Oberflächen gezeigt wird. Die Arbeit erkundet den potenziellen Einsatz dieser Methode für die Herstellung von vollständig gedruckten durch Flüssigmetall ermöglichten Bauteilen, einschließlich Widerständen, Mikroheizer, p-n-Dioden und Feldeffekttransistoren. Alle diese elektronischen Bauelemente werden ausführlich charakterisiert. Die hergestellten Mikroheizerstrukturen werden für temperaturgeschaltete Mikroventile eingesetzt, um den Flüssigkeitsstrom in einem Mikrokanal zu kontrollieren. Diese Demonstration und die einfache Herstellung zeigt, dass das Konzept auch auf andere Anwendungen, wie z.B. die bedarfsgerechte Herstellung von Mikroheizern für in-situ Rasterelektronenmikroskop-Experimente, ausgeweitet werden kann. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit, wie PMMA-Verkapselung als effektive Barriere gegen Sauerstoff und Feuchtigkeit fungiert und zusätzlich als brauchbarer mechanischer Schutz der auf Flüssigmetall basierenden gedruckten elektronischen Bauteile wirken kann. Insgesamt zeigen der alleinstehende, integrierte Herstellungsablauf und die Funktionalität der Geräte, dass das Potenzial des Flüssigmetall-Drucks in der gedruckten Elektronik viel größer ist als einzig die Verwendung zur Verbindung konventioneller elektronischer Bauteile. Neben der Entwicklung von Druckverfahren und der Herstellung elektronischer Bauteile befasst sich die Arbeit auch mit der Korrosion und der zusätzlichen Legierung von konventionellen Metallelektroden in Kontakt mit Flüssigmetallen, welche die Stabilität der Bauteil beinträchtigen könnten. Zu diesem Zweck wurde eine korrelierte Materialinteraktionsstudie von gedruckten Galinstan- und Goldelektroden durchgeführt. Durch die kombinierte Anwendung von optischer Mikroskopie, vertikaler Rasterinterferometrie, Rasterelektronenmikroskopie, Röntgenphotonenspektroskopie und Rasterkraftmikroskopie konnte der Ausbreitungsprozess von Flüssigmetalllinien auf Goldfilmen eingehend charakterisiert werden. Diese Studie zeigt eine unterschiedliche Ausbreitung der verschiedenen Komponenten des Flüssigmetalls sowie die Bildung von intermetallischen Nanostrukturen auf der umgebenden Goldfilmoberfläche. Auf der Grundlage der erhaltenen zeitabhängigen, korrelierten Charakterisierungsergebnisse wird ein Modell für den Ausbreitungsprozess vorgeschlagen, das auf dem Eindringen des Flüssigmetalls in den Goldfilm basiert. Um eine ergänzende Perspektive auf die interne Nanostruktur zu erhalten, wurde die Röntgen-Nanotomographie eingesetzt, um die Verteilung von Gold, Galinstan und intermetallischen Phasen in einem in das Flüssigmetall getauchten Golddraht zu untersuchen. Schlussendlich werden Langzeitmessungen des Widerstands an Flüssigmetallleitungen, die Goldelektroden verbinden, durchgeführt, was dazu beiträgt, die Auswirkungen von Materialwechselwirkungen auf elektronische Anwendungen zu bewerten

Separation of H2 and CO2 Containing Mixtures with Mixed Matrix Membranes Based on Layered Materials

Some membrane separation processes are gradually taking over conventional processes such as distillation, evaporation or crystallization as the technology progresses from bench-scale tests to large-scale prototypes. However, membranes for H2 and CO2 separation constitute a daring technology still under development. This overview focuses on mixed matrix membranes (MMMs), a special type of membranes in which a filler is dispersed in a polymer matrix, as a successful strategy to improve their permeability-selectivity performance while keeping the polymer processability. In particular, among all the possible fillers for MMMs, layered materials (porous zeolites and titanosilicates and graphite derivatives) are discussed in detail due to the several advantages they offer regarding selective microporosity, crystallinity and, what is most important, high specific surface area and aspect ratio. In fact, a selective and as thin as possible, i.e. with high aspect ratio, filler would help to develop high performance MMMs

Microextraction of Xenobiotics and Biomolecules from Different Matrices on Nano Structures

Sample preparation is the backbone of any analytical procedure; it involves extraction and pre-concentration of the desired analytes; often at trace levels. The present article describes the applications of nanomaterials (carbon based inorganic and polymeric materials) in miniaturized extraction such as solid phase micro-extraction, stir-bar sorptive extraction, liquid phase micro-extraction, and dispersive liquid phase micro-extraction in the analyses of aqueous samples. The nanoparticles used for micro-extractions are discussed on the basis of their chemical natures. The synthetic route and the preparation of nanomaterials are described along with the optimization strategies for micro-extraction. A comparison between the conventional materials and nanomaterials for micro-extraction is proposed. The key roles of the nanomaterials for the micro-extraction of different analytes such as drugs, pesticides, polycyclic aromatic hydrocarbons, proteins and peptides from aqueous samples are reported. The use of nanomaterials, combined with miniaturized micro-extraction techniques, proved to be highly promising for sample preparation of various matrices with analytes at trace levels

Nanoscale Magnetometry with Single Fluorescent Nanodiamonds Manipulated in an Anti-Brownian Electrokinetic Trap

Studies on single-molecule spectroscopy and nanoscale detection have been remarkably driven by an interest to reveal quantum and conformational states of single particles, the intra-molecular dynamics and their response to physical observables hidden by ensemble level measurements. A straightforward practice used in enhancing the signal from single particles is either to immobilize them on an engineered substrate or to embed them in a solid matrix. Given that the biophysical properties of the host environment introduce new perturbations and the particles will not behave as in their native environment, such approaches are inefficient to reflect the real dynamics. Therefore, recent advances in the field of single-molecule have led to a renewed interest in novel trapping methods, increased efforts into the development of promising tools for extended investigation, and the manipulation of solution-phase bio-molecules in real time. Despite the variety of successful passive trapping techniques, precise manipulation through non-perturbative forces is a big challenge for nano-sized particles. Such techniques either exert high power to the sample or compel special operating conditions disturbing the native environment. Therefore, an active trapping scheme guiding non-perturbative forces can break the trade-off between the particle size and the excreted power. This dissertation presents the development of an active trapping set-up using non-perturbative electrokinetic feedback and demonstrates its performance on nano-sized single particles for aims in biophysics. The essential theme is the engineering aspect of the technique, including the feedback configurations for various fluidic devices, the corresponding particle tracking schemes and the integration of the trapping platform to an integrated circuit pattern for advanced manipulation aims. The second theme is on specialized single fluorescence nanodiamonds (FNDs) as scanning magnetometer in fluidics. The implemented active trapping tool is employed for the manipulation of a rotationally free single FND to detect the localized magnetic field through an optically detected magnetic resonance (ODMR) spectrum. While the laser beam used in particle tracking can serve in optical excitation, an external radio frequency (RF) source is not sufficient to achieve microwave manipulation. Therefore, an RF antenna is designed to transmit the microwave signal to the proximity of the trapping chamber for electron spin resonance (ESR) spectroscopy. A nanostage positioning controller introduces scanning ability to the sample plane, in relative position of the trapped particle, in order to map the distribution of the detected fields over a fluidic volume. As FNDs are also sensitive to many other physical quantities, nanoscale single particle trapping and diamond photonics linkages are realized in this work, which provide an outstanding alternative for detection and imaging in complex fluidic environments that are closed to AFM-like physically supported probes