Novel strategy for rapid functional in vivo validation of oncogenic drivers in haematological malignancies

In cancer research, it remains challenging to functionally validate putative novel oncogenic drivers and to establish relevant preclinical models for evaluation of novel therapeutic strategies. Here, we describe an optimized and efficient pipeline for the generation of novel conditional overexpression mouse models in which putative oncogenes, along with an eGFP/Luciferase dual reporter, are expressed from the endogenous ROSA26 (R26) promoter. The efficiency of this approach was demonstrated by the generation and validation of novel R26 knock-in (KI) mice that allow conditional overexpression of Jarid2, Runx2, MN1 and a dominant negative allele of ETV6. As proof of concept, we confirm that MN1 overexpression in the hematopoietic lineage is sufficient to drive myeloid leukemia. In addition, we show that T-cell specific activation of MN1 in combination with loss of Pten increases tumour penetrance and stimulates the formation of Lyl1(+) murine T-cell lymphoblastic leukemias or lymphomas (T-ALL/T-LBL). Finally, we demonstrate that these luciferase-positive murine AML and T-ALL/T-LBL cells are transplantable into immunocompromised mice allowing preclinical evaluation of novel antileukemic drugs in vivo

Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells.

The discovery of direct cell reprogramming and induced pluripotent stem (iPS) cell technology opened up new avenues for the application of non-viral, transposon-based gene delivery systems. The Sleeping Beauty (SB) transposon is highly advanced for versatile genetic manipulations in mammalian cells. We established iPS cell reprogramming of mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts by transposition of OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc) and OSKML (OSKM + Lin28) expression cassettes mobilized by the SB100X hyperactive transposase. The efficiency of iPS cell derivation with SB transposon system was in the range of that obtained with retroviral vectors. Co-expression of the miRNA302/367 cluster together with OSKM significantly improved reprogramming efficiency and accelerated the temporal kinetics of reprogramming. The iPS cells displayed a stable karyotype, and hallmarks of pluripotency including expression of stem cell markers and the ability to differentiate into embryoid bodies in vitro. We demonstrate Cre recombinase-mediated exchange allowing simultaneous removal of the reprogramming cassette and targeted knock-in of an expression cassette of interest into the transposon-tagged locus in mouse iPS cells. This strategy would allow correction of a genetic defect by site-specific insertion of a therapeutic gene construct into 'safe harbor' sites in the genomes of autologous, patient-derived iPS cells

Die gegenseitige Beeinflussung synthetischer Expressionskassetten in definierten chromosomalen Abschnitten

Heterogeneity in transgene expression is frequently observed upon genetic modification of cells in basic research and biotechnology. The variable transgene expression is considered to be a result of the crosstalk of the incoming promoter cassette with cis-acting elements associated with the chromosomal site of transgene integration (position effect). Targeted integration of the transgene into the open chromatin reduces variability due to chromosomal position effects and also favors the more predictable transgene expression. The objective of this study was to have a mechanistic understanding of the nature of interaction that occurs between the transgenic/synthetic cassettes when integrated into defined chromosomal sites. To this end CMV driven transgene expression were investigated in more than 100 independent cell clones in two different cell lines (CHO and HEK293T). Not only was the transgene expression highly variable among clones but also large levels of heterogeneity in expression existed within clones with metastable phenotype. This was correlated with differential and dynamic chromatin conformation related to differential histone modifications. In addition, a CMV based Tetracycline inducible synthetic promoter (BiTet) was evaluated in the well-characterized Rosa26 locus.The epigenetic status of the promoter cassette was evaluated in mouse ES cells and transgenic mice to investigate the mechanisms mediating the interaction between the transgene and the chromosomal loci that results in variation of transgene expression. Contrary to the expectation, even upon targeting the ubiquitous Rosa26 locus, the expression of the synthetic cassette driven by tetracycline inducible synthetic promoters (BiTet) was highly heterogeneous. However in this analysis the endogenous Rosa26 locus largely remained methylation free. While DNA methylation was the major player in the silencing of the Tetracycline based promoter systems in the Rosa26 site, the heterogeneity associated with the hCMV driven constructs in random CHO and HEK293T clones was entirely associated with distinct histone modifications causing variable transgene expression and transgene silencing. While the heterogeneous expression was found to be associated with different chromatin states conferred by various epigenetic markings, the stability and extent of the variation in transgene expression may largely depend on the nature of crosstalk between the chromosomal integration site and the synthetic construct.Genetisch manipulierte Zellen werden oft in der Biotechnologie und der Grundlagenforschung verwendet. In diesen genetisch manipulierten Zellen kommt es oft zu unerwünschten heterogenen Transgen-Expressionen, die oft ein Nebeneffekt von sogenannten Positionseffekten sind. Diese Positionseffekte entstehen durch die Interaktion der Promoter-Kassetten mit den im Genom codierten Cis agierenden Elementen, was zu unterschiedlichen Transgenexpressionen führt. Die gezielte Integration eines Transgens in einen offenen Chromatin-Abschnitt reduziert den sogenannten Positionseffekt und führt zu einer vorhersagbareren Expression.Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von transgenen/synthetischen Kassetten an verschiedenen chromosomalen Integrations-Orten um die sogenannten Positionseffekte und den chromosomalen "crosstalk" genauer zu charakterisieren. Von zwei verschiedenen Zelllinien (CHO und Hek293T) wurden 100 Klone analysiert. Diese Klone wurden auf die Expression der integrierten Transgen-Kassette überprüft. Hierbei wurde das Transgen von einem CMV Promoter exprimiert. Zum Einen zeigte die Analyse der Zellen, dass die einzelnen Klone mit der gleichen Transgenkassette an verschiedenen Integrationsorten unterschiedliche Expressionsmuster aufwiesen (interklonale Expressionsunterschiede). Interressanterweise änderten sich zum Anderen diese Expressionsmuster der analysierten Klone nach mehrmaligen passagieren (Intraklonale Expressionsunterschiede). Das heisst, dass Zellen mit der gleichen Transgenkassette an dem gleichen Integrationsort ihr Expressionsmuster verändern. Diese intraklonalen Unterschiede wurden als metastabil bezeichnet. Die unterschiedlich exprimierenden Zellen in den metastabilen Klonen wurden genauer charakterisiert. Hierbei korrelierten die verschiedenen Expressionsmuster mit den unterschiedlichen Histon Modifikationen und somit mit den chromatin Konformationen. Zusätzlich wurde ein CMV basierter synthetischer Promoter, Tetracycline abhängiger Promoter (BiTet), in einem gut charakterisierten Lokus, dem R26 Lokus, analysiert. Obwohl der Promoter (BiTet) in diesem ubiquitär aktiven Lokus integriert wurde, zeigte die Expressionsanalyse, sowohl in Maus-Stammzellen als auch in transgenen Mäusen, überraschenderweise eine heterogene Expression. Anhand der epigenetischen Analysen konnte gezeigt werden, dass der Bitet Promoter methyliert wird, wobei der endogene R26 Promoter hauptsächlich frei von Methylierungen bleibt. Während das Silencing der Bitet Kassette in dem R26 Lokus und somit die heterogene Transgenexpression hauptsächlich auf die Methylierung der DNA zurückzuführen ist, ist das Silencing der analysierten CHO und HEK293T Klone, die zufällig im Genom integrierten, ein Resultat der Histon Modifikationen. Nichts desto trotz, während die Heterogenität der Transgenexpression von verschiedenen Chromatin-Zuständen, die über bestimmte epigenetische Markierungnen etabliert werden, abhängt, ist die Stabilität und die Stärke der heterogenen Expression abhängig von der Interaktion des synthetischen integrierten Konstrukts und des chromosomalen Integrations-Ortes

One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT)

Ohtsuka, M., Miura, H., Mochida, K. et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics 16, 274 (2015). https://doi.org/10.1186/s12864-015-1432-

Die Epigenetischen Modulation von die Doxcycline gesteuert Transgen-Expression in die Zellen und die Mäusen

The tetracycline (Tet) regulation system is being widely utilized for conditional transgenesis in cells of various species. Although the system has been successfully used in mammalian cells, the application in mice is not as straight forward. Published examples show variations in the performance of the Tet system in mice. However, these studies differ in the selected chromosomal integration sites of the Tet cassettes, the design of the cassette, the tissue investigated as well as the nature of the read-out. This hampers the direct comparison and the improvement of the system. The aim of this study was to characterize the performance of Tet cassettes located in a defined chromosomal environment in embryonic stem (ES) cells and mice and to explore strategies to overcome the silencing and heterogeneity of Tet induced transgene expression. Three chromosomal loci in the mouse genome, Rosa26, COL1A1 and Tigre loci were evaluated. Although elevated expression levels have been observed in COL1A1 and Tigre loci in ES cells compared to the expression in the Rosa26 locus, neither of them was capable of supporting expression of Tet cassettes upon differentiation, indicating that in all these sites expression is compromised related with DNA methylation. It was investigated if chromosomal shielding elements such as the chicken chromatin insulator cHS4 can prevent silencing of the Tet cassettes and stabilizes the expression. Indeed, cHS4 insulators resulted in partial rescue of expression even after differentiation. Furthermore, a novel strategy was designed to reactive the silenced Tet promoter in an active and targeted way. For this purpose, the catalytic domain from the ten eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1 (TET1) was employed. This protein has been previously shown to induce the demethylation of methylated CpGs. To specifically recruit the catalytic active domain of the TET1 to the Tet promoter a tripartite fusion protein was designed comprising the dioxygenase catalytic domain, the Tet promoter binding domain as well as the VP16 transactivating domain. The application of the expression vector in transgenic mice by hydrodynamic tail vein injection showed that the silenced Tet cassettes could even be reactivated in mice. In conclusion, this novel strategy to overcome silencing of the Tet promoter represents a promising approach to reactivate epigenetically silenced Tet promoter in vitro and in vivo.Die Tetracycline (Tet) regulierten systeme, unter Verwendung von Doxycycline induzierten Promotoren, werden häufig verwendet um eine konditionale Genexpression transduzierter Gene in Zellen verschiedener Spezies zu generieren. Obwohl diese Systeme erfolgreich in Säugerzellen angewendet werden konnten, ist die Anwendung im Mausmodell nicht so geradlinig. Interessanterweise unterscheiden sich jedoch in all diesen studien die chromosomalen Integrationsorte, das Design der Kassetten, die verwendeten Gewebe als auch die Art der Auswertung. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin das Verhalten der Tet-Kassetten in embryonalen Stamzellen sowie in Mäusen zu charakterisieren und Strategien zu entwickeln das „silencing“ dieser Doxycycline-induzierbaren Promotoren zu verhindern, um somit eine homogenere und stabilere Genexpression zu erhalten. Die erste Strategie verfolgte die Integration der Doxycycline-kontrollierten Kassetten in drei definierten chromosomalen Abschnitten (Rosa26, COL1A1 und Tigre Lokus) und die Untersuchung der Regulierbarkeit und Expression des Transgens. Konnte keiner der drei Integrationsorte die Expression der Tet-Kassette auch nach Zelldifferenzierung unterstützen. Aus diesem Grund befasste sich die zweite Strategie mit der Modifikation der „targeting“- Kassette. Hierfür wurde der Doxycyclin-induzierte Promoter von dem „chicken HS4 insulator“ umrahmt. Zudem ermöglichte die Integration des cHS4 eine teilweise erhaltene Expression des Transgens auch nach Zelldifferenzierung. Des Weiteren wurde eine dritte Strategie entwickelt, welche die Reaktivierung bereits „gesilencter“ Promotoren ermöglichen sollte. Für diesen Zweck wurde die aktive katalytische Domäne der TET1 mit dem reversen Tetrazyklin Transaktivator rtTA fusioniert. Das Protein TET1 wurde zuvor beschrieben eine Demethylierung von methylierten CpGs zu induzieren. Die Anwendung dieses Expressionvektors im Mausmodell ermöglichte eine Reaktivierung „gesilenc’ter“ Transgenexpression. Hierzu wurde die Genexpressionskassette über hydrodynamische Injektion in zwei unterschiedlichen transgenen Tierlinien eingebracht und seine Wirkung untersucht. In beiden Fällen führte die transiente Integration zu einem signifikanten Anstieg des Reportergens. Zusammenfassend zeigt sich diese neuartige Strategie als sehr vielversprechend das „silencing“ des Tet-Promotors in vitro und in vivo zu überwinden und zeigt sich ebenfalls erfolgreich in der Reaktivierung zuvor „gesilencter“ Tet-Promotoren

Etablierung muriner embryonaler Stammzellen mit vorhersagbarer, regulierbarer Transgenexpression

Transgenic mice are often generated by Random Integration (RI) of the transgene into the genome of murine Embryonic Stem (mES) cells. Since the chromosomal integration site of the gene of interest has a strong impact on expression patterns in the animal (ôposition effectö), generation of transgenic mouse models is hindered by high screening efforts to identify appropriate loci. Strategies devised to circumvent the problems of RI, e.g. site specific integration by homologous recombination, suffer from various limitations like the small number of suitable integration sites currently available. Hence, the aim of this work was to screen for chromosomal loci in mES cells that allow for high and well regulated transgene expression in mice and to render them reusable via Recombinase Mediated Cassette Exchange (RMCE). The screening cassette applied for this purpose contained an autoregulatory positive feedback loop driven by the tetracycline dependent system. As autoregulated transgene expression has not yet been examined in detail on transgenic mouse level, evaluation of this mode of regulated expression was a major issue of this work. Luciferase reporter levels from two random loci and the ROSA26 reference locus revealed strong variations that seem to be specific to autoregulation. In vivo bioluminescence analyses of transgenic mice derived from the two above mentioned clones showed a strong heterogeneity of expression between individuals of the same line with some animals completely shutting off expression. As expected for the autoregulated design, luciferase expression in one transgenic mouse line could only be induced by doxycycline if the animal had previously shown detectable basal levels. For both transgenic lines activity of the cassette was restricted to certain tissues. In conclusion, proof of principle for the envisioned "tag-and-target" strategy has been provided by this work and the tools and methods have been established to start large scale screening.Transgene Mäuse werden oft durch Integration des Transgens in zufällige chromosomale Loci muriner embryonaler Stammzellen (mES Zellen) generiert. Der jeweilige Integrationsort hat einen starken Einfluss auf das Expressionsverhalten, was aufwändiges Screening nach geeigneten Loci erforderlich macht. Es gibt mehrere Möglichkeiten diesen Positionseffekt zu umgehen, z.B. durch spezifische Integration des Transgens in einen definierten Locus durch homologe Rekombination. Diese Strategien unterliegen aber einigen Beschränkungen, u. a. der geringen Anzahl zur Zeit verwendbarer Loci. Deshalb befasst sich diese Arbeit mit dem Screening nach chromosomalen Loci in mES Zellen, welche eine hohe und gut regulierte Transgenexpression erlauben. Diese Integrationsorte werden über Rekombinase vermittelten Kassetten Austausch (RMCE) wieder verwendbar gemacht. Dazu wurde eine Screening Kassette mit einem autoregulierten, Tetracyclin (Tet) abhängigen positiven Feedback Loop eingesetzt. Die Charakterisierung dieses autoregulierten, Tet abhängigen Expressionsmodus in transgenen Mäusen war ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit. Die Luziferase Reporter Expression von zwei zufälligen Loci und vom ROSA26 Referenz Locus in mES Zellen schwankte stark, was vermutlich eine spezifische Eigenschaft der Autoregulation ist. Aus den ersten beiden Klonen wurden transgene Mäuse generiert. In vivo Biolumineszenz Analysen dieser Tiere zeigten ein sehr heterogenes Expressionsverhalten in beiden Linien; einige Mäuse unterdrückten die Expression komplett. Wie für das autoregulierte System erwartet konnte die Expression durch Gabe von Doxycyclin in einer Linie induziert werden sofern das jeweilige Tier detektierbare Basalwerte aufwies. In beiden transgenen Linien war die Aktivität der Kassette auf bestimmte Gewebe beschränkt. Zusammenfassend konnte die Funktionalität der verwendeten „tag and target“ Strategie nachgewiesen werden und die notwendigen Methoden für ein groß angelegtes Screening etabliert werden

Genome-wide identification of Hand2 target regions in mouse embryos using dRMCE, a new genetic tool

Limb bud development is a paradigmatic model to study the molecular signals that orchestrate cell growth and behaviour. Anterior-posterior patterning of the limb bud mesenchyme is dependent on the secreted ligand Sonic hedgehog (Shh). Shh expression in the posterior limb bud mesenchyme defines the zone of polarizing activity (ZPA) and controls cell survival and proliferative expansion during limb bud outgrowth. The bHLH transcription factor Hand2 binds to the limb-specific far-upstream Shh enhancer termed ZPA regulatory sequence (ZRS) and is essential for Shh activation. With the exception of the ZRS, no other direct Hand2 target regulatory regions and genes have been identified. Given that Hand2 is also required for development of the heart and neural crest derivatives, determining the genome-wide range of Hand2 target regions in mouse embryos will contribute to the understanding of underlying gene-regulatory networks. We decided to insert an epitope tag into the endogenous Hand2 protein to be able to precisely determine the range of Hand2 target sequences by ChIP-seq analysis. However, as genetic engineering of the Hand2 locus by homologous recombination is very inefficient, we developed dRMCE to re-engineer the Hand2 conditional allele. In doing so, we realized that dRMCE is compatible with thousands of conditional alleles and allows highly efficient custom-modification of the endogenous locus. dRMCE allowed me to rapidly generate a mouse model encoding an epitope tag within the endogenous Hand2 protein, which permits highly sensitive detection and localization of endogenous Hand2 in differentiated ES cells and embryonic tissues. We successfully used this fully functional epitope-tagged Hand2 protein to identify the large range of Hand2 target sequences in mouse embryonic tissues using a ChIP-seq approach. Our results indicate that Hand2 interacts with Gli3 and Tbx regulatory sites in limb buds and binds to a minimal ZRS element associated with human point mutations that cause polydactyly. I show that Hand2 is required for the development of the proximal skeleton of the hindlimb, likely by interacting directly with a Tbx4 enhancer. Furthermore, I describe the Hand2 target range associated with essential regulators of cardiac or craniofacial development. Thus, my approach begins to provide insight into the regulatory gene networks regulated by Hand2 during embryogenesis

Entwicklung einer Integrierten Expressionsplattform für die Proteinproduktion in Eukaryotischen Systemen

A prerequisite for structural and biochemical analyses of proteins is the availability of large amounts of high-quality material. However, the recombinant production of complex proteins typically requires a profound screening process to identify expressible constructs. Furthermore, the evaluation of an optimal expression host has an important impact on protein quality, yield and cost efficiency. As a result, the production of target proteins in eukaryotic systems is a major bottleneck in structural biology. In this work, the novel expression/donor vector pFlpBtM has been constructed to be utilised for both, the rapid screening for expressible protein variants and the evaluation of an optimal expression host. The range of applications comprises a variety of highly efficient eukaryotic hosts used at the Helmholtz Protein Sample Production Facility (PSPF). It was realised by the unique combination of different expression methods including transient, viral and stable expression strategies. The efficiency of the vector is demonstrated in a comparative expression study of model proteins from different protein classes which have been produced by transient expression in HEK293-6E cells as well as in the baculovirus expression vector system and by stable expression using a recombinase mediated cassette exchange system in CHO Lec3.2.8.1 cells. Additionally, engineered BEVS host cell lines were generated, which enable the stable genomic expression of auxiliary proteins to facilitate the production of particularly challenging target proteins. The flexible RMCE system was implemented in insect cell lines for the first time to provide optimised coexpression for each target protein and deploy compatibility to the RMCE CHO Lec3.2.8.1 cell lines. With the combination of a versatile donor/expression plasmid and optimised mammalian and lepidopteran producer cell lines, the PSPF offers an integrated platform for protein production in eukaryotic systems.Eine Grundvoraussetzung für strukturbiologische und biochemische Analysen ist die Verfügbarkeit von Proteinen in großen Mengen und hoher Qualität. Die Identifizierung von exprimierbaren Varianten eines Zielproteins und die Evaluierung des am besten geeigneten Expressionswirtes ist jedoch ein zeit- und arbeitsaufwendiger sowie kostenintensiver Prozess. Die rekombinante Proteinproduktion in eukaryotischen Expressionssystemen ist daher ein entscheidender Flaschenhals in der strukturbiologischen Forschung. In dieser Arbeit wurde der neuartige Expressions- und Donorvektor pFlpBtM für die Produktion von Zielproteinen in den eukaryotischen Expressionssystemen der Helmholtz Protein Sample Production Facility (PSPF) konstruiert. Dies wurde durch die bislang nicht verfügbare Kombination mehrerer leistungsfähiger Expressionsmethoden in einem einzigen Plasmid ermöglicht. Der Vektor eignet sich dadurch sowohl für ein schnelles Screening von exprimierbaren Proteinkonstrukten mittels transienter Expression als auch für die parallele Evaluierung von verschiedenen Wirtssystemen. Die Funktionalität des Vektors konnte über die erfolgreiche Expression unterschiedlicher Modellproteinklassen in der humanen Zelllinie HEK293-6E, dem Baculovirus Expressionsvektorsystem sowie in stabiler genomischer Expression nach Rekombinase-vermitteltem Kassettenaustausch (RMCE) in CHO Lec3.2.8.1 gezeigt werden. Die PSPF wurde zudem um speziell entwickelte Insektenzelllinien erweitert, die eine stabile genomische Expression von auxiliären Proteinen ermöglichen und sich daher als optimierte Wirtszelllinien für die baculovirale Expression von besonders anspruchsvollen Zielproteinen eignen. Die erstmals erfolgte Implementierung des flexiblen RMCE in Insektenzellen ist kompatibel zu dem bereits vorhandenen System in CHO Lec3.2.8.1 Zellen. Mit der Kombination des vielseitigen Vektors und optimierten Wirtszellen bietet die PSPF nun eine integrierte Infrastruktur zur Proteinproduktion in eukaryotischen Systemen