Classification of Boar Sperm Head Images using Learning Vector Quantization

We apply Learning Vector Quantization (LVQ) in automated boar semen quality assessment. The classification of single boar sperm heads into healthy (normal) and non-normal ones is based on grey-scale microscopic images only. Sample data was classified by veterinary experts and is used for training a system with a number of prototypes for each class. We apply as training schemes Kohonen’s LVQ1 and the variants Generalized LVQ (GLVQ) and Generalized Relevance LVQ (GRLVQ). We compare their performance and study the influence of the employed metric

The Era of Assisted Reproductive Technologies Tailored to the Specific Necessities of Species, Industry and Case Reports

Nowadays, assisted reproductive technologies (ARTs) have a pivotal role not only in achieving fertilization in subfertile animals, but they are also involved in the management of the herd, decreasing disease spread and even allowing offspring sex selection. Nonetheless, there are differences between species or even within species that have led researchers worldwide to focus on those differences in order to bypass these specific difficulties. This Special Issue, titled “The Era of Assisted Reproductive Technologies Tailored to the Specific Necessities of Species, Industry and Case Reports” and published in Animals, is composed of 12 original manuscripts and three reviews that offer an overview of current and future ARTs used to improve reproductive outcomes, mainly focused on farm animals, such as horse, pig, bovine, rabbit and ovine species. Thus, the Special Issue covers information from the classical point of view, including comparative studies of different semen extenders, to the most advanced technologies of sperm selection by thermotaxis or chemoattractants, as well as the improvement of sperm features by red light irradiation. The female and embryo contributions to ART outcomes are also covered, for instance, with a study that improves our knowledge by the metabolomic description of follicular fluid composition or the description of better culture conditions of oocytes. In brief, this Special Issue provides a balanced overview of emerging techniques and technologies used to preserve, improve, rescue or even create fertility for domestic farm animals with high economic impact

Dietary supplementation of omega-3 fatty acids and subsequent effects on fresh, cooled, and frozen seminal characteristics of stallions

The use of cooled and frozen/thawed semen offers many advantages to breeders. However, many stallions produce spermatozoa that are unable to endure the stresses of cooling/storage and freezing/thawing. Improving the quality and viability of equine spermatozoa via appropriate dietary manipulation could make these stallions commercially viable for cooling or cryopreservation. To evaluate whether spermatozoa quality and viability can be improved by supplementation of omega-3 fatty acids, and if improvements can be made by altering the sources of these fats, nine miniature stallions were placed into 1 of 2 treatment groups and fed either a fish- or algae/flaxseed-based supplement which was added to the basal concentrate. Motion characteristics, membrane integrity and morphology of spermatozoa in fresh, cooled/stored (24 and 48 h), and frozen/thawed semen samples were analyzed. When comparing spermatozoa obtained from stallions in each treatment, no differences were found (P > 0.05) in motility, percentage of membrane intact spermatozoa, and percentage of morphologically normal spermatozoa of stallions. Overall, omega-3 supplementation did not appear to have a beneficial effect on offsetting the harmful effects of the cooling and freezing processes. However, when analyzing the data of one stallion that had < 40% progressive motility (PMOT) after 24 h of cooling and storage, a significant increase was observed in total motility, and progressive motility of fresh and 24 h cooled/stored spermatozoa was observed when supplemented with the fish-based supplement. Thus, omega-3 fatty acid supplementation may be most beneficial for stallions that produce lower quality ejaculates. However, further studies should be conducted, with a larger sample size, in order to substantiate these findings

Effect of hormones of the female reproductive tract on ram sperm functionality

La presencia de hormonas en el tracto reproductor femenino y su papel en la regulación de la reproducción ha sido tema de estudio en múltiples especies. Entre ellas se encuentran las hormonas esteroideas, como la progesterona y el estradiol, y otras como la melatonina. Las hormonas esteroideas, ejercen su mecanismo de acción mediante la regulación de la expresión génica tras su unión a receptores nucleares, también llamados clásicos. Sin embargo, estas hormonas también pueden ejercer sus efectos de manera no genómica en diferentes tipos celulares, provocando respuestas rápidas a través de receptores presentes en la membrana o en el citoplasma. En espermatozoides de diferentes especies se han descrito y localizado este tipo de receptores para progesterona y 17-β estradiol, así como acciones no genómicas sobre procesos que tienen lugar en el tracto reproductor femenino como la capacitación, hiperactivación, quimiotaxis y la reacción acrosómica. Sin embargo, hasta el día de hoy, no han sido descritos los receptores para estas hormonas en espermatozoides ovinos, por lo que este hito constituyó el primer objetivo de esta tesis. Nuestros estudios mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta e inmunocitoquímica pusieron en evidencia, por primera vez, la localización del receptor de progesterona (PR) en en la zona ecuatorial y la pieza intermedia del espermatozoide ovino. Los análisis de western-blot de los extractos proteicos de los espermatozoides para el PR permitieron identificar un receptor con un peso molecular diferente al receptor clásico descrito en humano, por lo que se trataría de una isoforma del receptor clásico o de un receptor de membrana específico para la especie ovina. Así mismo, también se evidenció, por primera vez, la presencia de los receptores de estrógenos, ERα y ERβ en el espermatozoide ovino, localizándose en la zona post-acrosomal y en la región apical respectivamente, y correspondiendo su peso molecular a los de los receptores nucleares clásicos. Además, nuestros resultados demostraron una correlación positiva entre la presencia del receptor ERβ y el porcentaje de espermatozoides no capacitados evaluados por la tinción con clorotetraciclina. El porcentaje de células marcadas (ERβ+) disminuyó significativamente tras la capacitación in vitro, y prácticamente desapareció tras la inducción de la reacción acrosómica con lisofosfatidilcolina (LPC). Sin embargo, la localización de los receptores PR y ERα no cambió durante la capacitación ni tras la reacción acrosómica (Artículo 1). Una vez demostrada la presencia de los receptores para progesterona y estrógenos en el espermatozoide de morueco, nos planteamos, como segundo objetivo, determinar la implicación de ambas hormonas esteroideas, progesterona y 17-β estradiol, en la funcionalidad del espermatozoide ovino. Se llevaron a cabo experimentos con diferentes concentraciones de hormonas en un medio con y sin sustancias elevadoras del cAMP (cocktail) que promueven la capacitación in vitro en la especie ovina. Ambas hormonas provocaron un aumento del porcentaje de espermatozoides reaccionados (AR) tras 3 horas de incubación, pero únicamente la progesterona a baja (100 pM) y media (10 nM) concentración en un medio cocktail provocó un aumento en la fosforilación de proteínas en residuos de tirosina (TyrPP). Ambas hormonas a baja concentración también provocaron una disminución de la motilidad total cuando se añadieron a los espermatozoides en un medio cocktail. Por lo tanto, nuestros resultados ponen de manifiesto por primera vez el papel de la progesterona y 17-β estradiol sobre la funcionalidad espermática ovina y la capacidad de inducir la reacción acrosómica en el espermatozoide ovino (Artículo 1). Una vez determinados los efectos de la progesterona y 17-β estradiol en la funcionalidad del espermatozoide ovino, nos planteamos estudiar, como tercer objetivo, si dichos efectos estaban mediados por su unión a los receptores, PR, ERα y ERβ, que habíamos evidenciado. Para ello, incubamos espermatozoides ovinos en condiciones capacitantes, en presencia o ausencia de agonistas y antagonistas de PR y ER. La incubación con los agonistas provocaron un aumento del porcentaje de espermatozoides reaccionados (AR), en algún caso superior al inducido por la hormona, mientras que los antagonistas inhibieron el efecto inductor de la progesterona y el 17-β estradiol sobre la reacción acrosómica. Además, la incubación con los agonistas, tanto de PR como de ER, provocó un descenso de la motilidad progresiva mientras que la incubación con los antagonistas (previa a la adición de las hormonas) provocó un aumento significativo de este parámetro. Estos resultados confirman que tanto la progesterona como el 17-β estradiol son capaces de inducir la reacción acrosómica en espermatozoides ovinos, y que esta acción está mediada por su unión a sus receptores (Artículo 2). El cuarto objetivo de esta tesis fue profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de la progesterona y el 17-β estradiol en el espermatozoide ovino, analizando los mecanismos moleculares subyacentes al proceso de capacitación y reacción acrosómica. Para ello, evaluamos la distribución de TyrPP tras la capacitación in vitro mediante IIF. Ambas hormonas provocaron cambios diferentes en la localización de las TyrPP en los espermatozoides. La progesterona dio lugar a la desaparición de TyrPP del acrosoma, provocando un descenso de la subpoblación con marcaje en acrosoma, zona ecuatorial y flagelo, que correlacionaba con espermatozoides capacitados, y un aumento de la subpoblación con marcaje en la zona ecuatorial y flagelo, correlacionada con los espermatozoides reaccionados, mientras que este efecto no se observó en los espermatozoides incubados con estradiol. Además, la progesterona provocó un aumento en los niveles de calcio intracelular y una movilización de este ion hacia el acrosoma, así como un aumento en los niveles de especies oxígeno reactivas (ROS) y una rotura significativa del acrosoma (evidenciada mediante el uso de lectinas). Sin embargo, el 17-β estradiol no dio lugar a ninguno de estos cambios. La vía cAMP-PKA no parece estar involucrada en los efectos de ninguna de estas hormonas esteroideas en el espermatozoide ovino. Finalmente, ni la progesterona ni el estradiol provocaron un aumento en los parámetros cinéticos relacionados con la hiperactivación espermática (Artículo 3). Así, nuestros resultados demostraron que, aunque la progesterona y el 17-β estradiol promueven mecanismos conducentes a la inducción de la reacción acrosómica en los espermatozoides ovinos, estos mecanismos son diferentes. Por último, quisimos profundizar en el efecto de otra hormona presente en el tracto reproductor femenino, la melatonina, sobre la funcionalidad espermática ovina. Esta hormona es secretada por la hipófisis y controla la estacionalidad reproductiva a través también del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal, pero también se secreta en otros tejidos y es capaz de ejercer efectos directos sobre las células, incluyendo los espermatozoides. En estudios previos, nuestro grupo identificó los receptores de melatonina, MT1 Y MT2 , en la membrana plasmática del espermatozoide ovino y demostró que, entre otras acciones, esta hormona provocaba efectos opuestos en función de su concentración, sobre la capacitación espermática ovina. Por ello, el último objetivo de esta tesis se centró en investigar los mecanismos moleculares por los que la melatonina ejerce su acción dual capacitante/descapacitante sobre el espermatozoide ovino. Se comprobó que la melatonina a alta concentración (1 μM) daba lugar a la inhibición del proceso de capacitación y de reacción acrosómica mediante la disminución de los niveles de fosfotirosinas y de ROS. Por otro lado, tras un estudio de análisis de componentes principales (PCA), se pudo comprobar que la melatonina a concentraciones bajas (100 pM y 10 nM) promueve la hiperactivación. Sin embargo, no se pudo confirmar el papel de la vía cAMP-PKA en estos procesos, ya que aunque la melatonina a concentración alta fue capaz de modificar los niveles de cAMP, no provocó cambios en la actividad de la enzima PKA durante la capacitación espermática ovina (Artículo 4 + Anexo I). En conclusión, los resultados de esta tesis doctoral demuestran el papel de las hormonas esteroideas, progesterona y 17-β estradiol, en la inducción de la reacción acrosómica, y el papel dual capacitante/descapacitante de la melatonina en el espermatozoide ovino, lo que abre nuevas posibilidades para el uso de las mismas, o bien agonistas o antagonistas de sus receptores, para la formulación de diluyentes o medios empleados en inseminación artificial o para el mantenimiento de las dosis seminales. Así mismo, también abre nuevas perspectivas en la investigación del mecanismo de acción de estas hormonas a través otras vías distintas a la vía cAMP-PKA y que podrían estar implicadas en la funcionalidad del espermatozoide ovino. <br /