Electron paramagnetic resonance applications: from drug discovery to marine biology studies

El leitmotiv de la tesis es el uso de la técnica EPR, que implica el estudio de la dinámica de interacción de sistemas de interés con la ayuda de especies paramagnéticas apropiadas. El trabajo realizado en los tres años del doctorado se centró en el estudio químico-físico de moléculas de uso biomédico, más un trabajo extra sobre la interacción químico-física entre algunas formas de fitoplancton y microplásticos. La tesis se desarrolla en tres líneas de investigación: 1. El estudio de los glicodendrímeros para el tratamiento de la enfermedad de Wilson ocupó la mayor parte del primer año. Una nueva familia de glicodendrímeros, modificados con grupos DOTA, fue sintetizada el centro de investigación Leibniz-Intitute de Dresden, y analizada para evaluar su habilidad de quelar átomos de Cu(II). En particular, se puso bajo la lupa la interacción químico-física entre estas moléculas y los modelos de membrana, que confirmó su posible aplicación en campo biomédico. Este estudio condujo a la redacción de un artículo publicado en Langmuir. 2. Durante los tres años, se trabajó en la síntesis, caracterización y aplicación de metalodendrímeros para el tratamiento de diversas formas de neoplasia. La combinación de esta clase de polímeros e iones metálicos permite un control fino de los mecanismos anticancerígenos, que pueden moldearse según el sistema en estudio. Nuevas familias de metalodendrímeros de cobre y rutenio fueron sintetizadas en Alcalá y estudiadas bajo un punto de vista químico-físico en la universidad de Urbino. En este contexto, se han publicado 3 artículos y una reseña, además de un último artículo en proceso de peer review. 3. Un proyecto nacido y concluido en pocos meses con la publicación de un artículo en Chemosphere, se refiere a la demostración de la interacción física de algunos tipos de fitoplancton y microplásticos presentes en el Mediterráneo, para explicar un fenómeno particular de bio-contaminación que ha surgido en los últimos años. Dicha interacción fue estudiada en Urbino por medio de técnicas químico-físicas

THE ROLE OF THE FLAVODIIRON PROTEINS IN NITRIC OXIDE DETOXIFICATION

"This dissertation portrays recent developments on the knowledge of a protein family whose once elusive role is presently clearer, although still prone to discussion. The family of Flavodiiron Proteins (FDPs), initially thought to protect anaerobes from oxygen exposure, have been proposed to have a role in nitric oxide detoxification. The main object of study of this dissertation, Escherichia coli Flavorubredoxin (FlRd) made a large contribution to establish this role. FlRd was the first member of the FDP family to be assigned as an NO reductase, followed by the demonstration of the same activity in other FDPs, although a role in oxygen scavenging by other FDP family members has to be considered.(...)

In silico molecular modelling and design of heme-containing peroxidases for industrial applications

[eng] It is widely known that the development of modern chemistry and the consequent world industrialization have improved our quality of life to unimaginable levels. However, these advances have come with a high cost, causing environmental, health and societal concerns. As a consequence, during the past two decades a growing need has appeared to update the traditional chemistry industry processes towards greener and efficient alternatives. Along these lines, the use of enzymes has shown to be a suitable alternative to conventional industrial chemical processes. Enzymes are life-essential proteins that catalyze biochemical reaction and show several advantages over conventional chemical catalysts: they work under milder conditions, which decrease the energy requirements and consequently the capital costs of reactions; They show a high degree of selectivity and catalytic efficiency; and in addition, they are inherently non-hazardous, reusable and biodegradable catalysts, making them ideal environmentally friendly reagents. However, the main bottleneck for taking more benefit of enzymes in an industrial context is the lack of biocatalysts with the required selectivity, availability, and compatibility with industrial rigorous process conditions, and because of this, the development of enhanced enzymes by means of enzyme engineering is a main research field nowadays. Along these lines, in silico methodologies have progressively turned into highly valuable tools for the study and design of enzymatic systems, due to their unique potential to offer atomic and electronic-level insights into biocatalysts’ activity. Moreover, the continuous software and hardware improvements, and the cost-effectiveness and rapidness generally associated with these methods, make them very appealing for their application to the real problems that face the industry. Motivated by the advances on computational techniques and by the ease of obtaining valuable experimental data, which has been provided by our collaborators, the main goal of this thesis has been to understand the mechanisms of reaction of the heme-containing peroxidases under study (Auricularia auricula-judae DyP and Agrocybe aegerita UPO). Moreover, the acquired knowledge has been used to evaluate experimentally obtained enzyme variants and to guide the design of new ones towards desired properties. In this way, distinct computational techniques at different levels of accuracy (e.g. PELE, QM/MM or MD calculations) have been used to unravel the atomic and electronic mechanistic details under peroxidases mechanisms (e.g. long range electron transfer pathways, peroxidation and peroxygenation mechanisms) and to rationalize the molecular determinants that guide yield and selectivity in both natural occurring and experimentally designed peroxidases. Furthermore, the better understanding of the molecular principles under enzyme activity, along with the use of in silico semi-rational redesign methods, has enabled us to tailor UPO enzyme towards the enhanced production of high-value chemicals.[cat] A causa del desenvolupament de la química moderna i de la consegüent industrialització del món, la nostra qualitat de vida ha millorat a uns nivells que creiem inimaginables. Malauradament, tots aquests avenços han vingut acompanyats de repercussions mediambientals, socials i de salut. Per això, en les dues últimes dècades s'ha percebut una creixent necessitat de reemplaçar els processos químics tradicionals per alternatives més ecològiques i eficients. En aquest sentit, els enzims han demostrat ser una alternativa molt plausible als processos químics convencionals que s'usen avui en dia en la indústria. Els enzims són proteïnes essencials per a la vida que catalitzen reaccions bioquímiques, i l'ús dels quals aporta múltiples avantatges en comparació a les tècniques convencionals: permeten treballar en condicions suaus, fet que disminueix els requisits energètics i conseqüentment els costos de les reaccions a nivells industrials; en general són molt selectius i eficients; i a més a més, són inherentment reutilitzables, segurs i biodegradables, fet que els converteix en reactius respectuosos amb el medi ambient. Tot i això, les seves aplicacions a nivells industrials encara són limitades degut a la baixa tolerància a substrats, la poca disponibilitat d'enzims i a l'escassa resistència a les severes condicions industrials. Per aquesta raó, avui en dia el desenvolupament d'enzims millorats és un camp d'investigació important. Particularment, les tècniques in silico de modelització molecular s'estan convertint cada vegada més en eines clau per a l'estudi i el disseny de biocatalitzadors degut al seu potencial per a obtenir informació, tant a escala electrònica com molecular, sobre els mecanismes d'acció enzimàtics. A més a més, millores en el software i el hardware, i la rapidesa i bona relació cost-qualitat que mostren aquests mètodes, els fan molt atractius per a resoldre els problemes reals de la indústria. Motivada pels avenços en les tècniques computacionals i per la facilitat d'obtenir dades experimentals, que han estat proporcionades pels nostres col·laboradors, l'objectiu principal d'aquesta tesi ha sigut entendre els mecanismes de reacció de les peroxidases (en particular la DyP del fong Auricularia aurícula-judae i la UPO del fong Agrocybe aegerita). D'altra banda, els coneixements adquirits durant aquest procés de racionalització s'han utilitzat per avaluar variants millorats d'enzims obtinguts experimentalment i per guiar el disseny de nous biocatalitzadors cap a les propietats desitjades. Així doncs, s'han utilitzat diferents tècniques computacionals, a diferents nivells de precisió (p. ex. PELE, QM/MM o MD), per tal de comprendre els mecanismes electrònics i moleculars responsables de diferents mecanismes en les peroxidases (p. ex., mecanismes de transferència electrònica de llarg abast, peroxidació o peroxigenació), i racionalitzar els determinants moleculars que guien el rendiment i la selectivitat tant en les peroxidases naturals com en aquelles millorades experimentalment. A banda d'això, la millor comprensió dels principis moleculars responsables de l'activitat enzimàtica, juntament amb l'ús de mètodes computacionals per al disseny d'enzims, ens ha permès adaptar l'enzim UPO cap a la producció de productes químics valuosos

Toxicity Studies of Polymer Based Supermagnetic Iron Oxide Nanoparticles

En las últimas décadas, la nanotecnología se ha convirtido en una de las áreas de investigación científica más importantes, que se ha extendido a muchos aspectos de la vida (industriales, médicas, biológicas, etc), gracias a las excepcionales propiedades físico-químicas que ofrecen los nanomateriales. Además de la utilización de nanomateriales en el campo de la medicina, nanomedicina, los últimos años han sido testigos de un progreso tangible en la producción de productos de consumo que conteniendo nanomateriales. Hoy en día, más de 1.000 productos de consumo que contienen nanomateriales están disponibles en el mercado. Entre estos productos están, los productos de cuidado personal (por ejemplo, protección solar, lociones para la piel, etc), aditivos alimentarios, productos de limpieza, selladores, pinturas, productos electrónicos, pilas de combustible, neumáticos y muchos otros. Por desgracia, este vasto uso contrasta con los intentos limitados para evaluar los efectos nocivos de los nanomateriales en la salud pública y el medio ambiente. Este hecho pone de manifiesto la necesidad y la importancia de la nanotoxicología. Es insoslayable que cada nuevo producto que se investigue vaya acompañado del correspondiente estudio toxicológico. Esta tesis pretende aplicar ese punto de vista a unas series de bioferrofluidos y sus componentes producidos en dos grupos diferentes de los Institutos de Ciencia de Materiales de Zaragoza y Madrid con el objetivo de su utilización en aplicaciones biomédicas. A lo largo de la tesis, vamos a explorar la toxicidad de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro y sus encapsulados poliméricos sobre, células, sangre y órganos, como pasos necesarios para el desarrollo de la aplicabilidad biomédica de estos nuevos nanomateriales. Este trabajo se desarrolla en cinco capítulos. El capítulo 1 tiene por título Introducción general y propósito de la tesis. Se trata de una introducción general que incluye las definiciones básicas de la nanotecnología, nanomedicina y nanotoxicología. En él muestra la importancia de la nanomedicina en la solución de varios problemas médicos y farmacéuticos, y el gran impacto de la utilización de nanomateriales en los niveles terapéutico y de diagnóstico. Además, explica las propiedades magnéticas de nanopartículas magnéticas seguido de algunos ejemplos de los efectos de la utilización de las nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro a nivel de diagnóstico y terapéutico. En este capítulo se discuten las precauciones y los pasos a tener en cuenta durante el diseño de un nuevo nanomaterial. A continuación, se revisa la importancia de los estudios de la nanotoxicidad proporcionadas con algunos ejemplos de los efectos de los nanomateriales en células, sangre, medio ambiente, etc. Por último, el capítulo explica el propósito principal de la tesis y describe las características generales de los materiales a ser utilizado. El capítulo 2 tiene por título Estudios in vitro de la citotoxicidad de las nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro. Este capítulo comienza con una introducción sobre la nanotoxicología, mostrando algunos ejemplos sobre los nanopeligros (nanohazards) y sus efectos sobre la salud pública, que a su vez ponen de relieve la importancia de las medidas preventivas y los estudios nanotoxicología. Explica, además, algunos de los elementos de estudio implicados en nanotoxicología, como vía de exposición y mecanismos toxicológicos de los nanomateriales. La sección de introducción termina con la descripción de pruebas utilizadas para estudios de citotoxicidad. El propósito principal de este capítulo es estudiar el comportamiento toxicológico de nuestros bioferrofluidos in vitro utilizando diversos ensayos toxicológicos. En este capítulo se muestra la influencia de muchos factores sobre la toxicidad de las nanopartículas en las células, tales como tipo de célula, tamaño hidrodinámico de las partículas encapsuladas en su recubrimiento polimérico, tamaño de las nanopartículas óxido de hierro, relación polímero/hierro, etc. Resultado de los estudios descritos en el capítulo es que la muerte de las células es debido a la necrosis, sin evidencia de la producción de especies de oxígeno reactivo, y las pequeñas nanopartículas tienen un efecto inflamatorio en comparación con los más grandes, que se recomiendan para ser utilizado para otros estudios debido a su menor efecto tóxico en comparación con otros tamaños. El capítulo 3 tiene por título Estudios en el nivel de la interface nano-bio: captación, localización subcelular y la endocitosis. El capítulo comienza con una ilustración de la importancia de este tipo de estudios y explica los principales componentes del interface nano-bio, los factores que afectan a la internalización del nanomateriales y mecanismos de endocitosis. El propósito principal de este capítulo es entender la citotoxicidad causada por nuestros bioferrofluidos a través del estudio de la captación de las nanopartículas y la captación cinética, localización subcelular y el mecanismo de endocitosis. En este capítulo se muestra la influencia de muchos factores sobre la captación de las nanopartículas en las células, tales como el tamaño de las nanopartículas, tipo de célula, la concentración de las nanopartículas y el tiempo de incubación. Los resultados obtenidos explican la toxicidad dependiente del tamaño y del tipo de célula causada por nuestros bioferrofluidos. A nivel subcelular, las nanopartículas existen en los compartimentos endolisosomal y la endocitosis dependiente de clatrina es el mecanismo que se encarga de la internalización de las nanopartículas. El capítulo 4 tiene por título Estudios in vitro de hemocompatibilidad de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro. En este capítulo se muestra que el nanomaterial puede actuar como un agente pro-coagulante o hipo-coagulante, lo que a su vez, subraya la importancia de este tipo de estudios, especialmente para los nanomateriales que se desarrollan para su administración intravenosa. Se describe brevemente el mecanismo de coagulación de la sangre, los mecanismos de regulación y pruebas de detección de la coagulación. El propósito principal de este capítulo es estudiar la toxicidad de tres tipos diferentes de nanoparticulas superparamagnéticas de óxido de hierro recubiertas de polímero y sus componentes separados en la sangre. En este capítulo se muestra la influencia de la carga de la superficie y el revestimiento de la superficie en el comportamiento tóxico de los bioferrofluidos. Los tres tipos de bioferrofluidos exhiben efecto anticoagulante, con ningún efecto sobre el recuento de la sangre in vitro. No se detectó ninguna incidencia de hemólisis. El capítulo 5 tiene por título Estudios de biodistribución de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro recubiertas de polímero. Este capítulo comienza con un breve revisión sobre la imagen biomédica y la imagen por resonancia magnética (IRM), con una ilustración de los principios básicos de la resonancia magnética y agentes de contraste. Además, en este capítulo se discute los factores que afectan a la biodistribución de los nanomateriales. El objetivo de este capítulo es estudiar la relajación in vitro, la biodistribución in vivo y la toxicidad in vivo para dos tipos de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro recubiertas de polímero. Los resultados obtenidos muestran que nuestros bioferrofluidos son unos buenos agentes de contraste del tipo T2 con ningún efecto tóxico in vivo