Estrategias analíticas para la mejora de la determinación cualitativa y cuantitativa en metabolómica por espectrometría de masas

The basic objective of the research in this Thesis Book was to develop new analytical strategies based on the use of low- and high-resolution mass spectrometry to improve the detection and identification coverage in metabolomic analysis. These new strategies were applied throughout the main steps of the analytical process—sampling, sample preparation, determination and data analysis—and allowed improving basic analytical features such as sensitivity, selectivity and precision of metabolomic analysis methods (targeted and untargeted) and their detection capacity. The achievement of this basic objective has leaded to metabolomic analysis methods capable of providing a higher level of information, which is a key milestone for the resolution of biological problems. This objective was divided into three general objectives according to the different topics in this research: (i) to take benefit from the versatility of the triple quadrupole mass spectrometer to improve the identification/quantification of certain families of metabolites; (ii) to develop approaches to improve the detection and identification of metabolites by chromatographic techniques coupled to mass spectrometry in high resolution mode; and (iii) to create strategies for searching potential biomarkers in clinical and agro-food studies. From each general objective, we defined several concrete objectives: - To develop an automated qualitative and quantitative method based on on-line coupling of solid phase extraction (SPE) and liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) to maximize sensitivity for determination of fatty acid esters of hydroxy fatty acids (FAHFAs) in serum (Chapter I). The method was further applied to a cohort of individuals to evaluate the influence of glycaemia on FAHFA levels. - To propose a qualitative/quantitative strategy for determination of polar lipids in human plasma by LC–MS/MS. Two MS/MS acquisition methods were combined to identify and confirm the presence of polar lipids in plasma (Chapter II). Thus, the process was carried out in two steps: (i) identification of lipids through the characteristic fragmentation pattern for each family; and b) confirmation of detected lipids by monitoring product ions corresponding to the fatty acids (FAs) conforming them or other characteristic product ions. - To study the differences at metabolite level between serum and plasma obtained with conventional tubes (heparin tube for plasma) and polymeric gel tubes by application of an untargeted approach based on gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (GC–TOF/MS) (Chapter III). A cohort of volunteers was selected for blood sampling using four different tubes (plasma, plasma-gel, serum and serumgel). - To evaluate the influence of sample preparation on the determination of polar lipids in visceral adipose tissue (Chapter IV). Two different extractants were tested to compare their efficiency for the extraction of polar lipids, but also their inefficiency for extraction of acylglycerides (the main interference in the detection of polar lipids). Additionally, the implementation of an SPE step with a selective sorbent for retention of glycerophospholipids was assessed to check its influence on the subsequent detection of this family of lipids. - To maximize the identification coverage of metabolites found in pig fecal simples through the study of sample preparation (Chapter V). For this purpose, two analytical platforms such as LC–QTOF MS/MS and GC–TOF/MS were combined to evaluate their additivity in terms of identification. Concerning sample preparation, six solvents with different polarity were tested to evaluate the extraction performance and, in case of GC–MS, two derivatization protocols were compared. - To develop a new statistical package, called MetaboQC, to study and filtrate experimental variabililty in data sets generated by MS analysis of sequences processed for several days (Chapter VI). This new tool uses quality controls (QCs) to individually correct any tendency on quantitative signals of metabolites that can be associated to instrumental variability. - To study, by untargeted metabolomics analysis, the postprandial response to the oral fat tolerance test (OFTT) on plasma metabolomic profile (Chapter VII). Collected plasma samples were analyzed by LC–QTOF MS/MS and GC–TOF/MS. This test can open possibilities for the application of OFTT to the diagnostic of a wide range of pathologies. - To evaluate the predictive capacity of type 2 diabetes mellitus (T2DM) occurrence by examining the postprandial response (after OFTT) (Chapter VIII). With this aim, plasma samples were collected from 215 patients (CORDIOPREV project) at baseline and four hours after the OFTT. 107 individuals developed diabetes after five years. Collected plasma samples were analyzed by LC–QTOF MS/MS and GC–TOF/MS. - To elucidate the early events preceding the onset of islet autoimmunity and overt type 1 diabetes mellitus (T1DM). Metabolomics was used to determine levels of molecular lipids and polar metabolites in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from prospective samples collected in the Type 1 Diabetes Prediction and Prevention (DIPP) study (Chapter IX). - To develop discrimination models and search for panels of markers with capability to classify slaughtered pigs by their feeding regime (Chapter X). 80 samples of subcutaneous adipose tissue from Iberian pigs subjected to four different feedings were used. Data were obtained from the classical method for the determination of FAs based on GC–FID and from a method for determination of carbon isotopic abundances by isotope ratio mass spectrometry (IRMS).El objetivo básico de la investigación en esta Tesis fue desarrollar nuevas estrategias analíticas basadas en el uso de espectrometría de masas de baja y alta resolución para mejorar la detección y la cobertura de identificación. Este objetivo se dividió en tres objetivos generales de acuerdo con los diferentes temas de esta investigación: (i) aprovechar la versatilidad del analizador de triple cuadrupolo (QqQ) para mejorar la identificación/cuantificación de ciertas familias de metabolitos; (b) desarrollar nuevas herramientas para mejorar la detección e identificación de metabolitos mediante técnicas cromatográficas acopladas a espectrometría de masas de alta resolución; y (c) crear estrategias para buscar biomarcadores potenciales en estudios clínicos y agroalimentarios. En este contexto, la Tesis ha dado lugar a los siguientes resultados: - Desarrollo de un método cualitativo y cuantitativo automatizado basado en el acoplamiento en línea de la extracción en fase sólida (SPE) y la cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas en tándem (LC–MS/MS) para maximizar la sensibilidad en la determinación de ésteres de ácidos grasos y ácidos grasos hidroxilados (FAHFAs) en suero. El método se aplicó a una cohorte de individuos para evaluar la influencia de la glicemia en los niveles de FAHFAs [1]. - Propuesta de una estrategia cualitativa/cuantitativa para la determinación de lípidos polares en plasma humano por LC–MS/MS. Se combinaron dos métodos de adquisición de datos MS/MS para identificar y confirmar la presencia de lípidos polares en plasma. La propuesta se llevó a cabo en dos pasos: a) identificación de lípidos a través del patrón de fragmentación característico para cada familia; y b) confirmación de los lípidos detectados mediante la monitorización de iones producto correspondientes a los ácidos grasos (FAs) que los conforman u otros iones característicos. - Estudio sobre las diferencias a nivel de metabolitos entre suero y plasma obtenidos con tubos convencionales (tubo de heparina para plasma) y tubos con gel polimérico mediante la aplicación de un enfoque no dirigido basado en cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo (GC– TOF/MS). Se seleccionó una cohorte de voluntarios para el muestreo de sangre utilizando cuatro tipos de tubos (plasma, plasma-gel, suero y suero-gel) [2]. - Evaluación de la influencia de la preparación de la muestra en la determinación de lípidos polares en tejido adiposo visceral. Se probaron dos disolventes para comparar su eficiencia en la extracción de lípidos polares, pero también su ineficiencia para la extracción de acilglicéridos (las principales interferencias en la detección de lípidos polares). Además, se evaluó la implementación de una etapa SPE con un sorbente selectivo para la retención de glicerofosfolípidos con el fin de verificar su influencia en la detección posterior de esta familia de lípidos [3]. - Desarrollo de una estrategia para maximizar la cobertura de metabolitos identificados en muestras fecales de cerdo a través del estudio de la preparación de la muestra. Con este propósito se combinaron dos técnicas de detección, LC–QTOF MS/MS y GC–TOF/MS, para evaluar su complementariedad en términos de identificación. Con respecto a la preparación de la muestra, se probaron seis disolventes con diferente polaridad para evaluar su rendimiento de extracción y, en el caso de GC–MS, se compararon dos protocolos de derivatización [4]. Diseño y desarrollo de un nuevo paquete estadístico, llamado MetaboQC, para estudiar y filtrar la variabilidad instrumental en conjuntos de datos generados mediante análisis por espectrometría de masas en secuencias desarrolladas durante varios días. Esta nueva herramienta utiliza controles de calidad (QCs) para corregir individualmente cualquier tendencia en las señales cuantitativas de metabolitos que puedan estar asociadas a la variabilidad instrumental [5]. - Estudio, mediante un análisis metabolómico no dirigido, de la respuesta posprandial a la prueba oral de tolerancia a la grasa (OFTT) en el perfil metabólico plasmático. Las muestras de plasma recolectadas se analizaron por LC–QTOF MS/MS y GC– TOF/MS. Los resultados de este estudio abren una vía al uso de este test para el diagnóstico de un amplio abanico de patologías. - Evaluación de la capacidad predictiva de la aparición de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) mediante el examen de la respuesta posprandial (después de la OFTT). En este estudio se recogieron muestras de plasma de 215 pacientes (proyecto CORDIOPREV) justo antes y cuatro horas después de la prueba OFTT. 107 personas desarrollaron diabetes después de cinco años. Las muestras de plasma se analizaron por LC–QTOF MS/MS y GC–TOF/MS. - Dilucidación de los eventos que preceden al inicio de la autoinmunidad de los islotes y la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM). Se utilizó la metabolómica para determinar los niveles de lípidos moleculares y metabolitos polares en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) aisladas de muestras prospectivas recolectadas en el estudio de Predicción y Prevención de Diabetes Tipo 1 (DIPP) [6]. - Desarrollo de modelos de discriminación y búsqueda de paneles de marcadores con capacidad para la clasificación de cerdos por su régimen de alimentación. Se utilizaron 80 muestras de tejido adiposo subcutáneo de cerdos ibéricos sometidos a cuatro regímenes de alimentación. Los datos se obtuvieron combinando el método clásico para la determinación de FAs basado en GC–FID y un método para la determinación de las abundancias isotópicas de carbono por espectrometría de masas con relación isotópica (IRMS) [7]

Updates in metabolomics tools and resources: 2014-2015

Data processing and interpretation represent the most challenging and time-consuming steps in high-throughput metabolomic experiments, regardless of the analytical platforms (MS or NMR spectroscopy based) used for data acquisition. Improved machinery in metabolomics generates increasingly complex datasets that create the need for more and better processing and analysis software and in silico approaches to understand the resulting data. However, a comprehensive source of information describing the utility of the most recently developed and released metabolomics resources—in the form of tools, software, and databases—is currently lacking. Thus, here we provide an overview of freely-available, and open-source, tools, algorithms, and frameworks to make both upcoming and established metabolomics researchers aware of the recent developments in an attempt to advance and facilitate data processing workflows in their metabolomics research. The major topics include tools and researches for data processing, data annotation, and data visualization in MS and NMR-based metabolomics. Most in this review described tools are dedicated to untargeted metabolomics workflows; however, some more specialist tools are described as well. All tools and resources described including their analytical and computational platform dependencies are summarized in an overview Table

Untargeted lipidomic features associated with colorectal cancer in a prospective cohort.

BackgroundEpidemiologists are beginning to employ metabolomics and lipidomics with archived blood from incident cases and controls to discover causes of cancer. Although several such studies have focused on colorectal cancer (CRC), they all followed targeted or semi-targeted designs that limited their ability to find discriminating molecules and pathways related to the causes of CRC.MethodsUsing an untargeted design, we measured lipophilic metabolites in prediagnostic serum from 66 CRC patients and 66 matched controls from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (Turin, Italy). Samples were analyzed by liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (LC-MS), resulting in 8690 features for statistical analysis.ResultsRather than the usual multiple-hypothesis-testing approach, we based variable selection on an ensemble of regression methods, which found nine features to be associated with case-control status. We then regressed each selected feature on time-to-diagnosis to determine whether the feature was likely to be either a potentially causal biomarker or a reactive product of disease progression (reverse causality).ConclusionsOf the nine selected LC-MS features, four appear to be involved in CRC etiology and merit further investigation in prospective studies of CRC. Four other features appear to be related to progression of the disease (reverse causality), and may represent biomarkers of value for early detection of CRC

Development of a complete advanced computational workflow for high-resolution LDI-MS metabolomics imaging data processing and visualization

La imatge per espectrometria de masses (MSI) mapeja la distribució espacial de les molècules en una mostra. Això permet extreure informació Metabolòmica espacialment corralada d'una secció de teixit. MSI no s'usa àmpliament en la metabolòmica espacial a causa de diverses limitacions relacionades amb les matrius MALDI, incloent la generació d'ions que interfereixen en el rang de masses més baix i la difusió lateral dels compostos. Hem desenvolupat un flux de treball que millora l'adquisició de metabòlits en un instrument MALDI utilitzant un "sputtering" per dipositar una nano-capa d'Au directament sobre el teixit. Això minimitza la interferència dels senyals del "background" alhora que permet resolucions espacials molt altes. S'ha desenvolupat un paquet R per a la visualització d'imatges i processament de les dades MSI, tot això mitjançant una implementació optimitzada per a la gestió de la memòria i la programació concurrent. A més, el programari desenvolupat inclou també un algoritme per a l'alineament de masses que millora la precisió de massa.La imagen por espectrometría de masas (MSI) mapea la distribución espacial de las moléculas en una muestra. Esto permite extraer información metabolòmica espacialmente corralada de una sección de tejido. MSI no se usa ampliamente en la metabolòmica espacial debido a varias limitaciones relacionadas con las matrices MALDI, incluyendo la generación de iones que interfieren en el rango de masas más bajo y la difusión lateral de los compuestos. Hemos desarrollado un flujo de trabajo que mejora la adquisición de metabolitos en un instrumento MALDI utilizando un “sputtering” para depositar una nano-capa de Au directamente sobre el tejido. Esto minimiza la interferencia de las señales del “background” a la vez que permite resoluciones espaciales muy altas. Se ha desarrollado un paquete R para la visualización de imágenes y procesado de los datos MSI, todo ello mediante una implementación optimizada para la gestión de la memoria y la programación concurrente. Además, el software desarrollado incluye también un algoritmo para el alineamiento de masas que mejora la precisión de masa.Mass spectrometry imaging (MSI) maps the spatial distributions of molecules in a sample. This allows extracting spatially-correlated metabolomics information from tissue sections. MSI is not widely used in spatial metabolomics due to several limitations related with MALDI matrices, including the generation of interfering ions and in the low mass range and the lateral compound delocalization. We developed a workflow to improve the acquisition of metabolites using a MALDI instrument. We sputter an Au nano-layer directly onto the tissue section enabling the acquisition of metabolites with minimal interference of background signals and ultra-high spatial resolution. We developed an R package for image visualization and MSI data processing, which is optimized to manage datasets larger than computer’s memory using a mutli-threaded implementation. Moreover, our software includes a label-free mass alignment algorithm for mass accuracy enhancement

Advances in analytical tools and current statistical methods used in ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry of glycero-, glycerophospho- and sphingolipids

The review concentrates on the properties of analytical and statistical ultrahigh-performance liquid chromatographic (UHPLC) - mass spectrometric (MS) methods suitable for glycero-, glycerophospho- and sphingolipids in lipidomics published between the years 2017 2019. Trends and fluctuations of conventional and nano-UHPLC methods with MS and tandem MS detection were observed in context of analysis conditions and tools used for data-analysis. Whereas general workflow characteristics are agreed upon, more details related to the chromatographic methodology (i.e. stationary and mobile phase conditions) need evidently agreements. Lipid quantitation relies upon isotope-labelled standards in targeted analyses and fully standardless algorithm-based untargeted analyses. Furthermore, a wide spectrum of setups have shown potential for the elucidation of complex and large datasets by minimizing the risks of systematic misinterpretation like false positives. This kind of evaluation was shown to have increased importance and usage for cross-validation and data-analysis. (C) 2020 Elsevier B.V. All rights reserved.Peer reviewe

Sample Preparation in Metabolomics

Metabolomics is increasingly being used to explore the dynamic responses of living systems in biochemical research. The complexity of the metabolome is outstanding, requiring the use of complementary analytical platforms and methods for its quantitative or qualitative profiling. In alignment with the selected analytical approach and the study aim, sample collection and preparation are critical steps that must be carefully selected and optimized to generate high-quality metabolomic data. This book showcases some of the most recent developments in the field of sample preparation for metabolomics studies. Novel technologies presented include electromembrane extraction of polar metabolites from plasma samples and guidelines for the preparation of biospecimens for the analysis with high-resolution μ magic-angle spinning nuclear magnetic resonance (HR-μMAS NMR). In the following chapters, the spotlight is on sample preparation approaches that have been optimized for diverse bioanalytical applications, including the analysis of cell lines, bacteria, single spheroids, extracellular vesicles, human milk, plant natural products and forest trees

Development of 1H-NMR Serum Profiling Methods for High-Throughput Metabolomics

El perfilat de sèrum per ressonància magnètica nuclear de protó (1H-RMN) està especialment indicat per a anàlisi a gran escala en estudis epidemiològics, nutricionals o farmacològics. L’espectroscòpia 1H-RMN requereix mínima manipulació de mostra i gràcies a la seva resposta quantitativa permet la comparació directa entre laboratoris. Un perfilat complet de sèrum per 1H-RMN requereix de tres mesures que es corresponen amb tres espècies moleculars diferents: lipoproteïnes, metabòlits de baix pes molecular i lípids. El perfilat de sèrum per 1H-RMN permet obtenir informació de grandària, nombre de partícules i contingut lipídic de les subfraccions lipoproteiques, així com l'abundància d'aminoàcids, productes de la glicòlisi, cossos cetònics, àcids grassos i fosfolípids, entre d'altres. No obstant això, la complexitat espectral afavoreix la inclusió d'errors en l'anàlisi manual de les dades, mentre que les múltiples interaccions moleculars en el sèrum comprometen la seva precisió quantitativa. És per tant necessari desenvolupar mètodes robustos de perfilat metabòlic per consolidar la 1H-RMN en la pràctica clínica. Per a això, aquesta tesi presenta diverses estratègies metodològiques i computacionals. En el primer treball, es van desenvolupar mètodes de regressió dels lípids del perfil lipídic clàssic, generalitzables a mostres de població sana i amb valors de lípids i lipoproteïnes anormals. Aquests lípids representen els principals indicadors de risc cardiovascular i els objectius terapèutics primaris. En el segon estudi caracteritzem els errors de quantificació en el perfilat 1H-RMN de metabòlits clínicament rellevants, que són deguts a la seva agregació a la proteïna sanguínia. També proposem un mètode que fomenta la competició per l'agregació i que ens permet obtenir quantificacions dels nostres metabòlits properes a les absolutes. Finalment, el tercer treball presenta LipSpin: una eina bioinformàtica de codi obert específicament dissenyada per al perfilat de lípids per 1H-RMN. A més, aquest estudi exposa alguns aspectes metodològics per millorar l'anàlisi de lípids per RMN.El perfilado de suero por resonancia magnética nuclear de protón (1H-RMN) está especialmente indicado para el análisis a gran escala en estudios epidemiológicos, nutricionales o farmacológicos. La espectroscopía 1H-RMN requiere mínima manipulación de muestra y gracias a su respuesta cuantitativa permite la comparación directa entre laboratorios. Un perfilado completo de suero por 1H-RMN requiere de tres mediciones que se corresponden con tres especies moleculares distintas: lipoproteínas, metabolitos de bajo peso molecular y lípidos. El perfilado de suero por 1H-RMN permite obtener información de tamaño, número de partículas y contenido lipídico de las subfracciones lipoproteicas, así como la abundancia de aminoácidos, productos de la glicólisis, cuerpos cetónicos, ácidos grasos y fosfolípidos, entre otros. Sin embargo, la complejidad espectral favorece la inclusión de errores en el análisis manual de los datos, mientras que las múltiples interacciones moleculares en el suero comprometen su precisión cuantitativa. Es por tanto necesario desarrollar métodos robustos de perfilado metabólico para consolidar la 1H-RMN en la práctica clínica. Para ello, esta tesis presenta varias estrategias metodológicas y computacionales. En el primer trabajo, se desarrollaron métodos de regresión de los lípidos del perfil lipídico clásico, generalizables a muestras de población sana y con valores de lípidos y lipoproteínas anormales. Estos lípidos representan los principales indicadores de riesgo cardiovascular y los objetivos terapéuticos primarios. En el segundo estudio caracterizamos los errores de cuantificación en el perfilado 1H-RMN de metabolitos clínicamente relevantes, que son debidos a su agregación a la proteína sanguínea. También proponemos un método que fomenta la competición por la agregación y que nos permite obtener cuantificaciones de nuestros metabolitos cercanas a las absolutas. Por último, el tercer trabajo presenta LipSpin: una herramienta bioinformática de código abierto específicamente diseñada para el perfilado de lípidos por 1H-RMN. Además, este estudio expone algunos aspectos metodológicos para mejorar el análisis de lípidos por RMN.1H-NMR serum profiling is especially suitable for high-throughput epidemiological studies and large-scale nutritional studies and drug monitoring. It requires minimal sample manipulation and its quantitative response allows inter-laboratory comparison. A comprehensive 1H-NMR serum profiling consists of three measurements encoding different molecular species: lipoproteins, low-molecular-weight metabolites and lipids. 1H-NMR serum profiling provides information of size, particle number and lipid content of lipoprotein subclasses, as well as abundance of amino acids, glycolysis-related metabolites, ketone bodies, fatty acids and phospholipids, among others. However, the spectral complexity promotes errors in manual data analysis and the multiple molecular interactions within the sample compromise reliable quantifications. Developing robust methods of metabolite serum profiling is therefore desirable to consolidate high-throughput 1H-NMR in the clinical practice. This thesis presents several methodological and computational strategies to that end. In the first study, we developed generalizable regression methods for lipids in routine clinical practice (known as “lipid panel”), to be applied in healthy population and in a wide spectrum of lipid and lipoprotein abnormalities. These standard lipids are still the main measurements of cardiovascular risk and therapy targets. In the second study, we characterised the quantitative errors introduced by protein binding in 1H-NMR profiling of clinically-relevant LMWM in native serum. Then, we proposed a competitive binding strategy to achieve quantifications closer to absolute concentrations, being fully compatible with high-throughput NMR. Finally, the third study presents LipSpin: an open source bioinformatics tool specifically designed for 1H-NMR profiling of serum lipids. Moreover, some methodological aspects to improve NMR-based serum lipid analysis are discussed

Alteration of gene expression in mammary gland tissue of dairy cows in response to dietary unsaturated fatty acids

The aim of this study was to determine the effects of supplementing unprotected dietary unsaturated fatty acids (UFAs) from different plant oils on gene expression in the mammary gland of grazing dairy cows. A total of 28 Holstein–Friesian dairy cows in mid-lactation were blocked according to parity, days in milk, milk yield and fat percentage. The cows were then randomly assigned to four UFA sources based on rapeseed, soybean, linseed or a mixture of the three oils for 23 days, after which, all 28 cows were switched to a control diet for an additional 28 days. On the last day of both periods, mammary gland biopsies were taken to study genome-wide differences in gene expression on Affymetrix GeneChip® Bovine Genome Arrays (no. 900493) by ServiceXS (Leiden, The Netherlands). Supplementation with UFAs resulted in increased milk yield but decreased milk fat and protein percentages. Furthermore, the proportion of de novo fatty acids (FAs) in the milk was reduced, whereas that of long-chain FAs increased. Applying a statistical cut-off of false discovery rate of q-value

Computational approaches for the multimodal imaging of nanomaterials and their biochemical effects

Nanomaterial delivery systems constitute a group of drug delivery vehicles that have been used extensively in biodelivery. The proper characterization of the therapeutic function of these nanomaterials requires analytical methods to track the presence of the cargo and its biochemical effects. In some cases, the detection of the cargo and biochemical changes are not attainable in the same experiment, and more than one technique might be needed for the proper analysis of the drug delivery system. In this case, separate analysis of adjacent tissue sections is performed by techniques that offer complementary information such as MALDI-MS and LA-ICP-MS. However, the approaches to combine the information from these techniques to obtain insights into the mechanism of action of the nanomaterials have been limited to visual inspection and image overlay, which can only provide qualitative information. To advance towards a more quantitative analysis, in this dissertation we have developed computational techniques for image reconstruction, segmentation, and registration of MALDI-MS and LA-ICP-MS images to monitor the biodistribution, excretion and biochemical effects of nanomaterial delivery systems. First, we developed an open-source computational approach for LA-ICP-MS image reconstruction and segmentation using Python, which revealed that nanomaterials distribute in different sub-organ regions based on their chemical and physical properties. For instance, in the analysis of gold nanoparticles and bismuth nanorods, we find that the nanomaterials distribute in different regions of the spleen, suggesting differences in their biochemical interactions within the same organ. Next, we developed a computational workflow in Python to register LA-ICP-MS and MALDI-MS images using image registration approaches, obtaining a method with errors below 50 µm. Finally, we used the developed approaches for registration of LA-ICP-MS and MALDI-MS images to evaluate the delivery vehicles and cargo, obtaining quantitative information about the correlation of the signals obtained in the two image modalities. The use of image registration for the analysis of siRNA delivery via nanoparticle stabilized capsules (NPSC) reveals that expected changes in lipid levels occur at different locations than the NPSC accumulate, thus providing deeper insight into how siRNA delivery by NPSCs influences lipid biochemistry in vivo

Peak annotation and data analysis software tools for mass spectrometry imaging

La metabolòmica espacial és la disciplina que estudia les imatges de les distribucions de compostos químics de baix pes (metabòlits) a la superfície dels teixits biològics per revelar interaccions entre molècules. La imatge d'espectrometria de masses (MSI) és actualment la tècnica principal per obtenir informació d'imatges moleculars per a la metabolòmica espacial. MSI és una tecnologia d'imatges moleculars sense marcador que produeix espectres de masses que conserven les estructures espacials de les mostres de teixit. Això s'aconsegueix ionitzant petites porcions d'una mostra (un píxel) en un ràster definit a través de tota la seva superfície, cosa que dona com a resultat una col·lecció d'imatges de distribució de ions (registrades com a relacions massa-càrrega (m/z)) sobre la mostra. Aquesta tesi té com a objectius desenvolupar eines computacionals per a l'anotació de pics de MSI i el disseny de fluxos de treball per a l'anàlisi estadística i multivariant de dades MSI, inclosa la segmentació espacial. El treball realitzat en aquesta tesi es pot separar clarament en dues parts. En primer lloc, el desenvolupament d'una eina d'anotació de pics d'isòtops i adductes adequada per facilitar la identificació de compostos de rang de massa baix. Ara podem trobar fàcilment ions monoisotòpics als nostres conjunts de dades MSI gràcies al paquet de programari rMSIannotation. En segon lloc, el desenvolupament de eines de programari per a l’anàlisi de dades i la segmentació espacial basades en soft clustering per a dades MSI.La metabolómica espacial es la disciplina que estudia las imágenes de las distribuciones de compuestos químicos de bajo peso (metabolitos) en la superficie de los tejidos biológicos para revelar interacciones entre moléculas. Las imágenes de espectrometría de masas (MSI) es actualmente la principal técnica para obtener información de imágenes moleculares para la metabolómica espacial. MSI es una tecnología de imágenes moleculares sin marcador que produce espectros de masas que conservan las estructuras espaciales de las muestras de tejido. Esto se logra ionizando pequeñas porciones de una muestra (un píxel) en un ráster definido a través de toda su superficie, lo que da como resultado una colección de imágenes de distribución de iones (registradas como relaciones masa-carga (m/z)) sobre la muestra. Esta tesis tiene como objetivo desarrollar herramientas computacionales para la anotación de picos en MSI y en el diseño de flujos de trabajo para el análisis estadístico y multivariado de datos MSI, incluida la segmentación espacial. El trabajo realizado en esta tesis se puede separar claramente en dos partes. En primer lugar, el desarrollo de una herramienta de anotación de picos de isótopos y aductos adecuada para facilitar la identificación de compuestos de bajo rango de masa. Ahora podemos encontrar fácilmente iones monoisotópicos en nuestros conjuntos de datos MSI gracias al paquete de software rMSIannotation.Spatial metabolomics is the discipline that studies the images of the distributions of low weight chemical compounds (metabolites) on the surface of biological tissues to unveil interactions between molecules. Mass spectrometry imaging (MSI) is currently the principal technique to get molecular imaging information for spatial metabolomics. MSI is a labelfree molecular imaging technology that produces mass spectra preserving the spatial structures of tissue samples. This is achieved by ionizing small portions of a sample (a pixel) in a defined raster through all its surface, which results in a collection of ion distribution images (registered as mass-to-charge ratios (m/z)) over the sample. This thesis is aimed to develop computational tools for peak annotation in MSI and in the design of workflows for the statistical and multivariate analysis of MSI data, including spatial segmentation. The work carried out in this thesis can be clearly separated in two parts. Firstly, the development of an isotope and adduct peak annotation tool suited to facilitate the identification of the low mass range compounds. We can now easily find monoisotopic ions in our MSI datasets thanks to the rMSIannotation software package. Secondly, the development of software tools for data analysis and spatial segmentation based on soft clustering for MSI data. In this thesis, we have developed tools and methodologies to search for significant ions (rMSIKeyIon software package) and for the soft clustering of tissues (Fuzzy c-means algorithm)