A Novel Role for ZEB2 as a Lineage Fidelity Checkpoint in Human Cd4+ T Cells

Autoimmune diseases are a broad range of more than eighty related disorders, affecting up to 5% of the population. The incidence of autoimmune disease is increasing worldwide. It is a disease where the body's immune system fails to recognize its own cells and tissues as “self”. Instead, immune cells attack these healthy cells and tissues as if they were foreign or invading pathogens. One of the key immune cell populations implicated in this immune attack is CD4+ T cells. The CD4+ T cell lineage consists of a number of phenotypically and functionally distinct subsets. In particular there are two functionally distinct compartments in CD4, namely T regulatory cells (Treg) and T conventional cells (Tconv), and the function of each is potentially altered in autoimmune disease. My PhD project has investigated the role of a transcription factor, ZEB2 in shaping the function of human CD4+ T cells. Little is known about the role of ZEB2 in CD4+ T cells and therefore elucidating its role in CD4+ T cells and identifying the transcriptional landscape controlled by ZEB2 has the potential to highlight novel targets for autoimmune disease diagnosis and therapy. ZEB2 is a zinc-finger transcription factor known to play a major role in early embryogenesis and in tumour metastasis. ZEB2 has an established role in the cancer metastasis of several cancers but its role in the immune system has only fairly recently been explored. Interestingly, ZEB2, is directly induced by T-bet (T helper 1 master transcription factor) in mouse NK cells and CD8+ T cells, and therefore I speculated that T-bet may be implicated in the regulation of ZEB2 in CD4+ T cells where T-bet is the defining transcription factor for Th1 cells. My PhD project identifies which CD4+ T cell subsets ZEB2 is expressed in. I show that ZEB2 is expressed highly in Tconv effector memory subsets, indicating its role in the effector compartment of CD4+ T cells. Further investigation indicated that ZEB2 was found predominantly in Th1 effector memory (EM) cells. ZEB2 was expressed at very low levels in the other Tconv helper lineages, suggesting a unique effector role of ZEB2 in Th1 where T-bet is highly expressed and FOXP3 is absent. However, the regulation of ZEB2 is clearly more complex, since in some CD4+ T cell subsets with high T-bet, for instance Th1/17, there is not necessarily high ZEB2, suggesting ZEB2 is not regulated by T-bet alone. In order to specifically define the role of ZEB2 in Th1 EM cells, I deleted ZEB2 and analysed global changes in gene expression by RNA-seq. RNA-seq analysis showed that 222 genes were differentially expressed between WT and ZEB2-deleted Th1 EM, and pathway analysis of the gene profile indicates a potential role for ZEB2 in regulating inflammatory cytokines, repressing cytotoxic responses, enhancing motility and increasing survival in high stress environments. ZEB2 is also shown to regulate effector memory and central memory genes important for Th1 effector memory differentiation. Hence, ZEB2 is important in maintaining the function and fidelity of a Th1 effector memory cell in the steady state, and indirectly or directly maintaining IFNγ expression. Th1 cells preferentially produce IFNγ and IL-2 and are the principal regulators of type 1 immunity (Th1 response), which eradicates intracellular pathogens including viruses. Unravelling the role of ZEB2 in the complex relationships between the Th1 and Treg lineages and subsets may provide critical insight into the disruption of immune homeostasis that leads to autoimmune disease including inflammatory bowel disease (IBD), and may suggest novel therapeutic targets for autoimmune diseases.Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, School of Medicine, 202

Analyzing epigenomic data in a large-scale context

While large amounts of epigenomic data are publicly available, their retrieval in a form suitable for downstream analysis is a bottleneck in current research. In a typical analysis, users are required to download huge files that span the entire genome, even if they are only interested in a small subset (e.g., promoter regions) or an aggregation thereof. Moreover, complex operations on genome-level data are not always feasible on a local computer due to resource limitations. The DeepBlue Epigenomic Data Server mitigates this issue by providing a robust server that affords a powerful API for searching, filtering, transforming, aggregating, enriching, and downloading data from several epigenomic consortia. Furthermore, its main component implements scalable data storage and Manipulation methods that scale with the increasing amount of epigenetic data, thereby making it the ideal resource for researchers that seek to integrate epigenomic data into their analysis workflow. This work also presents companion tools that utilize the DeepBlue API to enable users not proficient in scripting or programming languages to analyze epigenomic data in a user-friendly way: (i) an R/Bioconductor package that integrates DeepBlue into the R analysis workflow. The extracted data are automatically converted into suitable R data structures for downstream analysis and visualization within the Bioconductor frame- work; (ii) a web portal that enables users to search, select, filter and download the epigenomic data available in the DeepBlue Server. This interface provides elements, such as data tables, grids, data selections, developed for empowering users to find the required epigenomic data in a straightforward interface; (iii) DIVE, a web data analysis tool that allows researchers to perform large-epigenomic data analysis in a programming-free environment. DIVE enables users to compare their datasets to the datasets available in the DeepBlue Server in an intuitive interface, which summarizes the comparison of hundreds of datasets in a simple chart. Furthermore, these tools are integrated, being capable of sharing results among themselves, creating a powerful large-scale epigenomic data analysis environment. The DeepBlue Epigenomic Data Server and its ecosystem was well received by the International Human Epigenome Consortium and already attracted much attention by the epigenomic research community with currently 160 registered users and more than three million anonymous workflow processing requests since its release.Während große Mengen epigenomischer Daten öffentlich verfügbar sind, ist ihre Abfrage in einer für die Downstream-Analyse geeigneten Form ein Engpass in der aktuellen Forschung. Bei einer typischen Analyse müssen Benutzer riesige Dateien herunterladen, die das gesamte Genom umfassen, selbst wenn sie nur an einer kleinen Teilmenge (z.B., Promotorregionen) oder einer Aggregation davon interessiert sind. Darüber hinaus sind komplexe Vorgänge mit Daten auf Genomebene aufgrund von Ressourceneinschränkungen auf einem lokalen Computer nicht immer möglich. Der DeepBlue Epigenomic Data Server behebt dieses Problem, indem er eine leistungsstarke API zum Suchen, Filtern, Umwandeln, Aggregieren, Anreichern und Herunterladen von Daten verschiedener epigenomischer Konsortien bietet. Darüber hinaus implementiert der DeepBlue-Server skalierbare Datenspeicherungs- und manipulationsmethoden, die der zunehmenden Menge epigenetischer Daten gerecht werden. Dadurch ist der DeepBlue Server ideal für Forscher geeignet, die die aktuellen epigenomischen Ressourcen in ihren Analyse-Workflow integrieren möchten. In dieser Arbeit werden zusätzlich Begleittools vorgestellt, die die DeepBlue-API verwenden, um Benutzern, die sich mit Scripting oder Programmiersprachen nicht auskennen, die Möglichkeit zu geben, epigenomische Daten auf benutzerfreundliche Weise zu analysieren: (i) ein R/ Bioconductor-Paket, das DeepBlue in den R-Analyse-Workflow integriert. Die extrahierten Daten werden automatisch in geeignete R-Datenstrukturen für die Downstream-Analyse und Visualisierung innerhalb des Bioconductor-Frameworks konvertiert; (ii) ein Webportal, über das Benutzer die auf dem DeepBlue Server verfügbaren epigenomischen Daten suchen, auswählen, filtern und herunterladen können. Diese Schnittstelle bietet Elemente wie Datentabellen, Raster, Datenselektionen, mit denen Benutzer die erforderlichen epigenomischen Daten in einer einfachen Schnittstelle finden können; (iii) DIVE, ein Webdatenanalysetool, mit dem Forscher umfangreiche epigenomische Datenanalysen in einer programmierungsfreien Umgebung durchführen können. Mit DIVE können Benutzer ihre Datensätze mit den im Deep- Blue Server verfügbaren Datensätzen in einer intuitiven Benutzeroberfläche vergleichen. Dabei kann der Vergleich hunderter Datensätze in einem Diagramm ausgedrückt werden. Aufgrund der großen Datenmenge, die in DIVE verfügbar ist, werden Methoden bereitgestellt, mit denen die ähnlichsten Datensätze für eine vergleichende Analyse vorgeschlagen werden können. Alle zuvor genannten Tools sind miteinander integriert, so dass sie die Ergebnisse untereinander austauschen können, wodurch eine leistungsstarke Umgebung für die Analyse epigenomischer Daten entsteht. Der DeepBlue Epigenomic Data Server und sein Ökosystem wurden vom International Human Epigenome Consortium äußerst gut aufgenommen und erreichten seit ihrer Veröffentlichung große Aufmerksamkeit bei der epigenomischen Forschungsgemeinschaft mit derzeit 160 registrierten Benutzern und mehr als drei Millionen anonymen Verarbeitungsanforderungen

Significant Gene Array Analysis and Cluster-Based Machine Learning for Disease Class Prediction

Gene expression analysis has been of major interest to biostatisticians for many decades. Such studies are necessary for the understanding of disease risk assessment and prediction, so that medical professionals and scientists alike may learn how to better create treatment plans to lessen symptoms and perhaps even find cures. In this study, we will investigate various gene expression analyses and machine learning techniques for disease class prediction, as well as assess predictive validity of these models and uncover differentially expressed (DE) genes for their relevant pathology datasets. Multiple gene expression datasets will be used to test model accuracies and will be obtained using the Affymetrix U133A platform (GPL96). Significant Analysis of Microarrays (SAM) had been used to identify potential disease biomarkers, followed by these predictive models: (a) random forest, (b) random forest with Gene eXpression Network Analysis (GXNA), (c) RF++, (d) LASSO, and (e) Bayesian Neural Networks. One of the intended goals for this study is to find clusters of co-expressed genes and identify the effect of clustering classification based on knowledge in gene expression data/microarray data. The other goal is to determine the usefulness of Automatic Relevancy Determination in Bayesian neural networks

Computational models of gene expression regulation

Throughout the last several decades, many efforts have been put into elucidating the genetic or epigenetic defects that result in various diseases. Gene regulation, i.e., the process of how genes are turned on and off in the right place and at the right time, is a paramount and prevailing question for researchers. Thanks to the discoveries made by researchers in this field, our understanding of interactions between proteins and DNA or proteins with themselves, as well as the dynamics of chromatin structure under different conditions, have substantially advanced. Even though there has been a lot achieved through these discoveries, there are still many unknown aspects about gene regulation. For instance, proteins called transcription factors (TFs) recognize and bind to specific regions of DNA and recruit the transcriptional machinery, which is essential for gene regulation. As there have been more than 2000 TFs identified in the human genome, it is important to study where they bind to or which genes they target. Computational approaches are important, in particular, as the biological experiments are often very expensive and cannot be done for all TFs. In 2016, a competition named DREAM Challenge was held encouraging researchers to develop novel computational tools for predicting the binding sites of several TFs. The first chapter of this thesis describes our machine learning approach to address this challenge within the scope of the competition. Using ensembles of random forest classifiers, we formulated our framework such that it is able to benefit from the tissue specificity inherent in the data leading to better generalization. Also, our models were tailored for spotting cofactors involved in the binding of TFs of interest. Comparing the important TFs that our computational models suggested with protein-protein association networks revealed that the models preferentially select motifs of TFs that are potential interaction partners in those networks. Another important aspect beyond predicting TF binding is to link epigeneomics, such as histone modification (HM) data, with gene expression. We, particularly, concentrated on predicting expression in a subset of genes called bidirectional. Bidirectional genes are referred to as pairs of genes that are located on opposite strands of DNA close to each other. As the sequencing technologies advance, more such bidirectional configurations are being detected. This indicates that in order to understand the gene regulatory mechanisms, it would be beneficial to account for such promoter architectures. In the second and third chapters, we focused on genes having bidirectional promoter architectures utilizing high resolution epigenomic signatures and single cell RNA-seq data to dissect the complex epigenetic architecture at these promoters. Using single-cell RNA-seq data as the estimate of gene expression, we were able to generate a hypothetical model for gene regulation in bidirectional promoters. We showed that bidirectional promoters can be categorized into three architecture types with distinct characteristics. Each of these categories corresponds to a unique gene expression profile at single cell level. The single cell RNA-seq data proved to be a powerful means for studying gene regulation. Therefore, in the last chapter, we proposed a novel approach for predicting gene expression at the single cell level using cis-regulatory motifs as well as epigenetic features. To achieve this, we designed a tree-guided multi-task learning framework that considers each cell as a task. Through this framework we were able to explain the single cell gene expression values using either TF binding affinities or TF ChIP-seq data measured at specific genomic regions. This allowed us to identify distinct TFs that show cell-type specific regulation in induced pluripotent stem cells. Our approach does not only limit to TFs, rather it can take any type of data that can potentially be used in explaining gene expression at single cell level. We believe that our findings can be used in drug discovery and development that can regulate the presence of TFs or other regulatory factors, which lead the cell fate into abnormal states, to prevent or cure diseases.In den letzten Jahrzehnten wurden große Anstrengungen unternommen, um die genetischen oder epigenetischen Defekte aufzuklären, die zu verschiedenen Krankheiten führen. Die Genregulation, d.h. der Prozess der Ein- und Abschaltung der Gene am richtigen Ort und zur richtigen Zeit reguliert, ist für die Forscher eine Frage von zentraler Bedeutung. Dank der Entdeckungen von Forschern auf diesem Gebiet ist unser Verständnis der Wechselwirkungen zwischen zwischen den Proteinen und der DNA oder der Proteine untereinander sowie der Dynamik der Chromatinstruktur unter verschiedenen Bedingungen wesentlich fortgeschritten. Obwohl durch diese Entdeckungen viel erreicht wurde, gibt es noch viele unbekannte Aspekte der Genregulation. Beispielsweise erkennen Proteine, sogenannte Transkriptionsfaktoren (Transcription Factors, TFs), bestimmte Bereiche der DNA und binden an diese und rekrutieren die Transkriptionsmaschinerie, die für die Genregulation erforderlich ist. Da mehr als 2000 TFs im menschlichen Genom identifiziert wurden, ist es wichtig zu untersuchen, wo sie binden oder auf welche Gene sie abzielen. Rechnerische Ansätze sind insbesondere wichtig, da die biologischen Experimente oft sehr teuer sind und nicht für alle TFs durchgeführt werden können. Im Jahr 2016 fand ein Wettbewerb namens DREAM Challenge statt, bei dem Forscher aufgefordert wurden, neuartige Rechenwerkzeuge zur Vorhersage der Bindungsstellen mehrerer TFs zu entwickeln. Das erste Kapitel dieser Arbeit beschreibt unseren Ansatz des maschinellen Lernens, um diese Herausforderung im Rahmen des Wettbewerbs anzugehen. Unter Verwendung von Ensembles von Random Forest Klassifikatoren haben wir unser Framework so formuliert, dass es von der Gewebespezifität der Daten profitiert und damit zu einer besseren Generalisierung führt. Außerdem wurden unsere Modelle auf das Erkennen von Kofaktoren angepasst, die an der Bindung von TFs beteiligt sind, die für uns von Interesse sind. Der Vergleich der wichtigen TFs, die unsere Computermodelle mit Protein-Protein-Assoziationsnetzwerken vorschlugen, ergab, dass die Modelle bevorzugt Motive von TFs auswählen, die potenzielle Interaktionspartner in diesen Netzwerken sind. Ein weiterer wichtiger Aspekt, der über die Vorhersage der TF-Bindung hinausgeht, besteht darin, epigeneomische Faktoren wie Histonmodifikationsdaten (HM-Daten) mit der Genexpression zu verknüpfen. Wir konzentrierten uns insbesondere auf die Vorhersage der Expression in einer Untergruppe von Genen, die als bidirektional bezeichnet werden. Bidirektionale Gene werden als Paare von Genen bezeichnet, die sich auf gegenüberliegenden DNA-Strängen befinden und nahe beieinander liegen. Mit dem Fortschritt der Sequenzierungstechnologien werden immer mehr solche bidirektionalen Konfigurationen erkannt. Dies weist darauf hin, dass es zum Verständnis der Genregulationsmechanismen vorteilhaft wäre, solche Promotorarchitekturen zu berücksichtigen. Im zweiten und dritten Kapitel konzentrierten wir uns auf Gene mit bidirektionalen Promotorarchitekturen, um mit Hilfe von epigenomischen Signaturen und Einzelzell-RNA-Sequenzdaten die komplexe epigenetische Architektur an diesen Promotoren zu analysieren. Unter Verwendung von Einzelzell-RNA-Sequenzdaten als Schätzung der Genexpression konnten wir ein hypothetisches Modell für die Genregulation in bidirektionalen Promotoren aufstellen. Wir haben gezeigt, dass bidirektionale Promotoren in drei Architekturtypen mit unterschiedlichen Merkmalen eingeteilt werden können. Jede dieser Kategorien entspricht einem eindeutigen Genexpressionsprofil auf Einzelzellebene. Die Einzelzell-RNA-Sequenzdaten erwiesen sich als leistungsstarkes Mittel zur Untersuchung der Genregulation. Daher haben wir im letzten Kapitel einen neuen Ansatz zur Vorhersage der Genexpression auf Einzelzellebene unter Verwendung von cis-regulatorischen Motiven sowie epigenetischen Merkmalen vorgeschlagen. Um dies zu erreichen, haben wir ein baumgesteuertes Multitasking-Lernsystem entwickelt, das jede Zelle als eine Aufgabe betrachtet. Durch dieses Gerüst konnten wir die Einzelzellgenexpressionswerte entweder mit TF-Bindungsaffinitäten oder mit TF-ChIP-Sequenzdaten erklären, die in bestimmten Genomregionen gemessen wurden. Dies ermöglichte es uns, verschiedene TFs zu identifizieren, die eine zelltypspezifische Regulation in induzierten pluripotenten Stammzellen zeigen. Unser Ansatz beschränkt sich nicht nur auf TFs, sondern kann jede Art von Daten verwenden, die potentiell zur Erklärung der Genexpression auf Einzelzellebene verwendet werden können. Wir glauben, dass unsere Erkenntnisse für die Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln verwendet werden können, die das Vorhandensein von TFs oder anderen regulatorischen Faktoren regulieren können, die die Zellen abnormal werden lassen, um Krankheiten zu verhindern oder zu heilen

Genome-wide identification of Hand2 target regions in mouse embryos using dRMCE, a new genetic tool

Limb bud development is a paradigmatic model to study the molecular signals that orchestrate cell growth and behaviour. Anterior-posterior patterning of the limb bud mesenchyme is dependent on the secreted ligand Sonic hedgehog (Shh). Shh expression in the posterior limb bud mesenchyme defines the zone of polarizing activity (ZPA) and controls cell survival and proliferative expansion during limb bud outgrowth. The bHLH transcription factor Hand2 binds to the limb-specific far-upstream Shh enhancer termed ZPA regulatory sequence (ZRS) and is essential for Shh activation. With the exception of the ZRS, no other direct Hand2 target regulatory regions and genes have been identified. Given that Hand2 is also required for development of the heart and neural crest derivatives, determining the genome-wide range of Hand2 target regions in mouse embryos will contribute to the understanding of underlying gene-regulatory networks. We decided to insert an epitope tag into the endogenous Hand2 protein to be able to precisely determine the range of Hand2 target sequences by ChIP-seq analysis. However, as genetic engineering of the Hand2 locus by homologous recombination is very inefficient, we developed dRMCE to re-engineer the Hand2 conditional allele. In doing so, we realized that dRMCE is compatible with thousands of conditional alleles and allows highly efficient custom-modification of the endogenous locus. dRMCE allowed me to rapidly generate a mouse model encoding an epitope tag within the endogenous Hand2 protein, which permits highly sensitive detection and localization of endogenous Hand2 in differentiated ES cells and embryonic tissues. We successfully used this fully functional epitope-tagged Hand2 protein to identify the large range of Hand2 target sequences in mouse embryonic tissues using a ChIP-seq approach. Our results indicate that Hand2 interacts with Gli3 and Tbx regulatory sites in limb buds and binds to a minimal ZRS element associated with human point mutations that cause polydactyly. I show that Hand2 is required for the development of the proximal skeleton of the hindlimb, likely by interacting directly with a Tbx4 enhancer. Furthermore, I describe the Hand2 target range associated with essential regulators of cardiac or craniofacial development. Thus, my approach begins to provide insight into the regulatory gene networks regulated by Hand2 during embryogenesis