7 research outputs found

    Etude de la diversité génétique de Mycoplasma agalactiae : plasticité des génomes, mobilome et dynamique de surface

    Get PDF
    Mycoplasma agalactiae est responsable de l'agalactie contagieuse, maladie des petits ruminants difficilement contrôlée et figurant sur la liste de l’OIE. Afin d’évaluer la diversité génétique de ce pathogène, 101 isolats ont été comparés par trois techniques (VNTR, RFLP, répertoire vpma). Les résultats révèlent une grande homogénéité génétique dont la souche type PG2 est représentative. Quelques isolats font exception telle la souche 5632 que nous avons séquencée et analysée ici. La comparaison des génomes et des protéomes entre 5632 et PG2 indiquent que la plasticité de ces génomes est liée à d’importants échanges d'ADN et à la présence de nombreux éléments génétiques mobiles (10% du génome). Ces analyses révèlent également une forte dynamique au sein de répertoires de gènes codant des protéines de surfaces. Pour les mycoplasmes, bactéries minimales dépourvues de paroi, ces évènements ont certainement joués un rôle dans leur survie et leur adaptation à des hôtes complexes. ABSTRACT : Mycoplasma agalactiae is responsible of contagious agalactia, a disease of small ruminants that is still difficult to control and is listed by the OIE. In order to evaluate the genetic diversity of this pathogen, 101 isolates were compared using three techniques (VNTR, RFLP, vpma repertoire). Results revealed a high genetic homogeneity with the PG2 type strain as representative. Some isolates however diverged such as the 5632 which was sequenced and analysed here. Whole comparative genomic and proteomic analyses of the 5632 and PG2 strains indicate that their genomic plasticity resides in important genes flux and in the presence of several mobile genetic elements (10% of the genome). These analyses also revealed that specific loci encoding repertoire of surface proteins are highly dynamic. For these minimal bacteria that lack a cell-wall, these events have most likely played a major role in their survival and adaptation to complex hosts

    Transkription in Mycoplasma pneumoniae

    Get PDF
    Das humanpathogene Bakterium Mycoplasma pneumoniae besitzt lediglich ein kleines Repertoire von Genen, die vermutlich an der Transkriptionsregulation beteiligt sind. Dieser Umstand reflektiert seine Anpassung an ein nährstoffreiches Habitat mit konstanten Umweltbedingungen, dem menschlichen Lungenepithel. Bis heute ist der Hitzeschockregulator HrcA das einzige charakterisierte Protein, welches an der Transkriptionsregulation in diesem Organismus beteiligt ist. Da jedoch zahlreiche andere Transkriptionsregulationen in M. pneumoniae beschrieben worden sind, stellt sich die Frage, welche Mechanismen bzw. welche Regulatoren für diese Ereignisse verantwortlich sind. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der übrigen Proteine, die vermutlich an Regulationsereignissen beteiligt sind. Die gezielte Suche nach Mutanten, denen diese Proteine fehlen, zeigte dass die Mehrheit dieser Proteine für die Vitalität des Bakteriums essentiell ist. Lediglich Mutanten, denen die weitläufig in Bakterien konservierten Proteine RelA und WhiA fehlen, konnten isoliert werden. Außerdem konnte eine Interaktion zwischen dem Protein Mpn266 und der α-Untereinheit der RNA-Polymerase nachgewiesen werden, ein Hinweis darauf, dass Protein Mpn266 ein Ortholog des Transkriptionsregulators Spx in den Firmicutes ist. Auch dieser mutmaßliche Transkriptionsregulator ist essentiell. Zahlreiche Experimente zur Charakterisierung der Rolle von RelA und des Signalmoleküls (p)ppGpp in M. pneumoniae wurden durchgeführt. Während gezeigt werden konnte, dass die Mechanismen, die zur RelA-abhängigen Synthese von (p)ppGpp in diesem Organismus konserviert sind, konnte, abgesehen von der Unfähigkeit (p)ppGpp herzustellen kein weiterer Phänotyp gefunden werden. Ein Effekt von (p)ppGpp auf die Transkription konnte mittels Mikroarray-Experimenten nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche Untersuchungen zur Rolle der HPr-Phosphorylierung konnten zudem zeigen, dass diese keine Rolle bei der Transkriptionsregulation spielen. Statt dessen scheint die HPr-Phosphorylierung die pH-abhängige Zuckeraufnahme in M. pneumoniae zu regulieren. Mikroarrayuntersuchungen einer whiA Mutante zeigen eine konstitutive Hochregulation der Transkription eines großen Operons, welches hauptsächlich aus ribosomalen Genen besteht. Da sowohl der Regulator als auch das Operon in Gram-positiven Bakterien konserviert sind, liegt die Vermutung einer identischen Funktion dieses Regulators in anderen Bakterien nahe. Diese Vermutung wird durch das Vorhandensein eines gemeinsamen DNA Motivs vor diesem Operon gestützt. Zusammengefasst beinhaltet diese Arbeit die ersten Mikroarrayuntersuchungen von M. pneumoniae Mutanten überhaupt und liefert die Grundlage für zukünftige Experimente, die darauf abzielen, Regulationsereignisse in diesen Organismus besser zu verstehen

    Analysis of ammonium uptake; a sigma 54 regulated function in rhizobium meliloti

    Get PDF
    Ammonium transport was examined in the symbiotic nitrogenfixing acterium Rhizobium meliloti. This was done by assaying for the uptake of a radio-labelled analogue of ammonium, 14C-methylamine. The activity was shown to vary depending on the nitrogen source and its concentration m the growth medium, and to be inducible. The effect of various compounds on the actual assay itself was also assessed. Ammonium, methylamme and glutamine were found to inhibit uptake, as did sodium azide, indicating that it was an energy-requiring process. Several mutants in nitrogen assimilation were assayed for uptake, and this showed the activity to be dependent on the sigma factor a54 and its associated activator protein NtrC, but not on the three genes for glutamine synthetase found m R . meliloti. Genes transcribed by a54 show a highly conserved promoter sequence m the -24/-12 region. A primer designed to this sequence allowed use of the PCR technique to amplify fragments containing this sequence from a gene bank of R . meliloti. These PCR products were then cloned, and eight transformants with different sized inserts selected for sequencing. Analysis of the sequence data showed one to contain the start of the m f H gene, known to be (independent, and thereby validating this method for the isolation of a group of promoter-specific genes

    Investigating Natural Product Biosynthesis in Uncultivated Symbiotic Bacteria of the Marine Sponge <em>Theonella swinhoei</em>

    Get PDF
    Marine sponges are a rich source of bioactive natural products with potent anticancer activities. Currently, the limited availability of most of these substances prohibits further drug development (Proksch et al., 2002). Highly complex consortia of bacterial symbionts associated with sponges have been frequently proposed to be the true producers of many secondary metabolites (Piel, 2004). However, the majority of these complex microbial assemblages are not amenable to cultivation (Amann et al., 1995; Hugenholtz et al., 1998; Friedrich et al., 2001; Webster & Hill, 2001), thereby hampering efforts to prove the symbiont hypothesis as well as to access their biosynthetic potential. Using metagenomic-based approaches, Piel and colleagues have previously provided the first genetic evidence for the bacterial origin of invertebrate-derived natural products by cloning the entire gene cluster for onnamide/theopederin from the Japanese sponge Theonella swinhoei (Piel et al., 2004a, 2004b). In this work, we investigated further natural product biosynthetic pathways from uncultivated symbiotic bacteria using Japanese T. swinhoei as a symbiotic assemblage model. The reasons for selecting this sponge are the wide variety of pharmaceutically important secondary metabolites isolated from this sponge as well as the high complexity of the associated bacteria (Fusetani & Matsunaga, 1993; Henstchel et al., 2002), which might play an important role in metabolite biosynthesis. Metagenome mining strategies that we applied and developed in this work have led to the cloning of two new biosynthetic pathways from this complex symbiosis model. Our bioinformatic analysis predicted that one pathway is responsible for the biosynthesis of misakinolide A, and another one for keramamide H. Interestingly, we found that the first pathway contains additional components that match structures of swinholide A and hurghadolide A, potent actin polymerization inhibitors isolated from other sponges (Carmely & Kashman, 1985; Kitagawa et al., 1990; Doi et al. 1991; Youssef & Mooberry, 2006). Both biosynthetic pathways were encoded on two different gene clusters that exhibited typical bacterial gene features, strongly indicating that the producer of misakinolide A and keramamide H is a symbiotic bacterium. Since the screening system used to clone the gene clusters was based on the filamentous fraction dominated by “Candidatus Entotheonella sp.”, a heterothropic delta-proteobacterium associated with T. swinhoei, we assumed that misakinolide A and keramamide H are produced by “Entotheonella sp.” To confirm the taxonomic status of the bacterial producer, further analysis either by single cell studies or its combination with complete genome is currently underway. Subsequent genome sequencing of another member of this as-yet uncultivable candidate genus from a different chemotype of T. swinhoei led to the identification of genes for the biosynthesis of orbiculamide-like structure, which is structurally related to keramamides. Therefore, the results in this work provide not only convincing proof for the microbial origin of marine natural products but also specific taxonomic information as well as the potential to sustainable supply of pharmacologically potential compounds

    Modulation of fatty acid synthase and plasma membrane microdomains by hydrogen peroxide

    Get PDF
    Adaptation of Saccharomyces cerevisiae cells to hydrogen peroxide (H2O2) decreases plasma membrane permeability, slowing H2O2 diffusion into cells and turning cells more resistant to H2O2. The mechanism responsible for this change remains largely unknown. Here this mechanism was addressed revealing that fatty acid synthase (Fas) plays a key role during the cellular response of S. cerevisiae to H2O2: Adaptation to H2O2 was associated with a decrease in both Fas expression and activity. However, cellular effects of H2O2 were shown to vary over a narrow range of concentrations. Therefore, a tight control of H2O2 exposure is essential for cellular studies of H2O2-dependent redox regulation. The importance of Fas in adaptation was reinforced by the observation that the decrease of Fas activity by 50 % through deletion of one of the FAS1 alleles increases the resistance to lethal doses of H2O2. The plasma membrane of fas1 cells presented a large increase lignoceric acid (C24:0) (40%) and cerotic acid (C26:0) (50%) levels, suggesting that alterations in the plasma membrane composition of very-long-chain fatty acids (VLCFA) occur with Fas downregulation. Through interdigitation or by modulating formation of lipid rafts, VLCFA may decrease the overall or localized plasma membrane permeability to H2O2, respectively, thus conferring a higher resistance to H2O2. In agreement, fluorescence studies with transparinaric acid showed that both H2O2 adaptation and Fas downregulation increase the formation of lipid domains in the plasma membrane. Also, microscopy studies revealed that changes in Fas activity lead to the reorganization of plasma membrane domains. Preliminary studies in Jurkat T cells showed a decrease in plasma membrane fluidity, alteration to digitonin sensitivity and reorganization of membrane microdomains after exposure to a nonlethal H2O2 dose for 4 h. However, no relation between these changes and fatty acid synthase activity could be established. In conclusion, these results reveal the key role of Fas in the modulation of plasma membrane permeability to H2O2 during adaptation in S. cerevisiae and suggest that downregulation of FAS1 is the molecular mechanism by which H2O2 leads to the reorganization of the plasma membrane by remodelling specific membrane microdomains.O peróxido de hidrogénio (H2O2) é a espécie reactiva de oxigénio mais abundante em organismos aeróbios, uma vez que é produzido intracelularmente de forma contínua. As suas características fisico-químicas, juntamente com a facilidade de difusão através das membranas celulares fazem com que o H2O2 seja uma importante molécula sinalizadora em diversos processos celulares. Porém, a regulação precisa dos níveis intracelulares de H2O2 é crucial, uma vez que a exposição a diferentes doses de H2O2 pode levar a respostas tão diferentes como proliferação celular, senescência, adaptação, apoptose ou necrose. Em Saccharomyces cerevisiae, a exposição a doses baixas de H2O2 (150 μM) leva à adaptação das células, tornando-as mais resistentes a uma exposição posterior a uma dose letal deste mesmo agente. Esta adaptação ao H2O2 deve-se não só a um aumento da actividade dos principais enzimas que catalisam a redução do H2O2 (catalase e citocromo c peroxidase), mas também a uma diminuição da permeabilidade da membrana plasmática ao H2O2, impedindo a sua difusão para o interior das células. O mecanismo reponsável por estas alterações permanece ainda desconhecido porém, estudos anteriores mostraram que a adaptação ao H2O2 leva a alterações na composição lipídica e organização da membrana plasmática, sendo este muito provavelmente responsável pelas alterações de fluidez e permeabilidade ao H2O2 detectadas. Estudos anteriores mostraram que, após uma curta exposição a uma dose adaptativa de H2O2, há um aumento dos níveis de esqualeno (intermediário na via de síntese do ergosterol), uma alteração na composição relativa dos principais fosfolípidos e uma reorganização dos microdomínios rígidos da membrana plasmática, enriquecidos em ergosterol e esfingolípidos. Neste estudo observaram-se também alterações nos níveis de expressão de genes envolvidos no metabolismo de lípidos, nomeadamente, de genes envolvidos na via biosintetica do ergosterol (ERG1, ERG3, ERG7 and ERG25) e do metabolismo de ácidos gordos (os genes ELO1, ELO2 and ELO3, envolvidos na enlongação de ácidos gordos, o gene OLE1 envolvido na desaturação de ácidos gordos e nos genes FAS1 e FAS2 codificantes para as duas sub-unidades do sintase de ácidos gordos). Uma vez que os ácidos gordos são um dos principais componentes das membranas, o sintase de ácidos gordos surgiu como um candidato interessante para o estudo das alterações celulares na adaptação ao H2O2. Neste trabalho fez-se então uma abordagem ao mecanismo de adaptação centrada nas alterações observadas no sintase de ácidos gordos (Fas), pretendendo-se compreender de que modo o H2O2 altera a actividade de Fas e de que modo as alterações na actividade xiv deste enzima alteram, por si, a resistência celular ao H2O2 e a composição e organização da membrana plasmática. Um dos principais resultados obtidos foi o de que a exposição de células de Saccharomyces cerevisiae a doses adaptativas de H2O2, que leva a uma diminuição da expressão do gene FAS1, levando consequentemente a uma diminuição da actividade de Fas. Porém, foi observada uma variação dos efeitos celulares do H2O2 num intervalo curto de concentrações de H2O2. Este resultado demonstra que é essencial que haja um controlo estrito da concentração de H2O2 a que as células estão expostas de modo a ter uma reprodutibilidade de resultados. A exposição em estado estacionário demonstrou ser a mais adequeada a este tipo de estudos, uma vez que permite a exposição prolongada a uma dose constante de H2O2, aproximando-se mais das condições fisiológicas. A sobre-expressão de FAS1 (conseguida através da construção de uma estirpe contendo o gene sob influência de um promotor regulável) levou por si a uma diminuição da capacidade de sobreviver a doses letais de H2O2, sendo esta reestabelecida com a diminuição da expressão de FAS1. A importância do gene FAS1 no mecanismo de adaptação ao H2O2 foi reforçada pela observação de que uma estirpe fas1 , com uma diminuição em aproximadamente 50 % dos níveis de expressão do gene FAS1 e consequente diminuição da actividade de Fas, apresenta por si uma maior resistência a doses letais de H2O2. Os níveis de actividade dos principais enzimas responsáveis pela remoção de H2O2 intracelular (catalase e citocromo c peroxidase) não aumentaram com a diminuição da expressão de FAS1 em 50 %. Os níveis de citocromo c peroxidase mostraram até ser inferiores na estirpe fas1 , o que demonstra que a maior resistência celular ao H2O2 nestas células não se deve a um aumento da capacidade de eliminação de H2O2. Estudos de integridade da parede celular (estrutura que poderia também actuar como barreira de entrada ao H2O2) mostraram não existirem alterações a nível da parede que possam justificar a diferente resistência ao H2O2. Deste modo a membrana plasmática, que já demonstrou no mecanismo de adaptação ao H2O2 ser uma estrutura dinâmica que sofre alterações de modo a limitar a difusão de H2O2 para o interior da célula, foi considerada como a principal responsável pela resistência acrescida ao H2O2 nas células fas1 . Efectivamente, a membrana plasmática da estirpe fas1 apresentou um aumento da razão PC/PE. Devido às suas características biofísicas, esta alteração leva por si a um aumento da rigidez da membrana plasmática. A membrana plasmática da estirpe fas1 apresentou também um aumento acentuado dos níveis de ácido lignocérico (C24:0) (40 %) e ácido cerótico (C26:0) (50 %), sugerindo que as alterações na composição da membrana plasmática em ácidos gordos de cadeia muito longa (VLCFA) estão envolvidas neste xv processo. Em concordância estão os estudos de fluorescência com ácido trans-parinárico que revelaram que a repressão de Fas leva a um aumento quantitativo e aumento da rigidez dos domínios gel da membrana plasmática. Também os estudos de microscopia com marcação dos princípais microdomínios da membrana plasmática de S. cerevisiae (MCCmicrodomains occupied by Can1 e MCP – microdomains occupied by Pma1) mostraram que as alterações na actividade de Fas levam a uma reorganização destes domínios lipídicos na membrana plasmática. A diminuição da actividade de Fas não provoca alterações significativas na distribuição dos domínios MCP (ao contrário do acontece na adaptação), observando-se, porém, um pequeno aumento dos níveis de Pma1p na membrana plasmática, embora não tão significativo como o observado no processo de adaptação ao H2O2. As maiores alterações foram observadas ao nível dos domínios MCC, que sofreram não só uma reorganização na membrana como um aumento em número na membrana plasmática das células da estirpe fas1 . As alterações nos MCC poderão estar associadas às restantes alterações observadas na membrana plasmática das células fas1 , uma vez que estes domínios se encontram normalmente associados aos eisossomas, estruturas organizadoras da membrana plasmática. Foram também efectuados alguns estudos preliminares em Jurkat mostraram que a exposição a uma dose não letal de H2O2 por tempos curtos leva a uma diminuição da fluidez da membrana plasmática acompanhada por uma alteração da sensibilidade à digitonina e por uma reorganização dos microdomínios da membrana plasmática. Não foi porém ainda possível estabelecer uma ligação entre estas alterações e a sintase de ácidos gordos. Em conclusão, este trabalho revela o papel fundamental de Fas na modulação da permeabilidade da membrana plasmática ao H2O2 durante o processo de adaptação e sugere que a repressão de Fas é um dos mecanismos moleculares pelos quais o H2O2 estimula a formação de jangadas lipídicas em S. cerevisiae. O proteína Fas é aqui apresentada pela primeira vez como um novo candidato na resposta ao stress oxidativo em S. cerevisiae.Fundação para a Ciência e a Tecnologi
    corecore