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Etude de la diversité génétique de Mycoplasma agalactiae : plasticité des génomes, mobilome et dynamique de surface
Mycoplasma agalactiae est responsable de l'agalactie contagieuse, maladie des petits ruminants difficilement contrôlée et figurant sur la liste de l’OIE. Afin d’évaluer la diversité génétique de ce pathogène, 101 isolats ont été comparés par trois techniques (VNTR, RFLP, répertoire vpma). Les résultats révèlent une grande homogénéité génétique dont la souche type PG2 est représentative. Quelques isolats font exception telle la souche 5632 que nous avons séquencée et analysée ici. La comparaison des génomes et des protéomes entre 5632 et PG2 indiquent que la plasticité de ces génomes est liée à d’importants échanges d'ADN et à la présence de nombreux éléments génétiques mobiles (10% du génome). Ces analyses révèlent également une forte dynamique au sein de répertoires de gènes codant des protéines de surfaces. Pour les mycoplasmes, bactéries minimales dépourvues de paroi, ces évènements ont certainement joués un rôle dans leur survie et leur adaptation à des hôtes complexes. ABSTRACT : Mycoplasma agalactiae is responsible of contagious agalactia, a disease of small ruminants that is still difficult to control and is listed by the OIE. In order to evaluate the genetic diversity of this pathogen, 101 isolates were compared using three techniques (VNTR, RFLP, vpma repertoire). Results revealed a high genetic homogeneity with the PG2 type strain as representative. Some isolates however diverged such as the 5632 which was sequenced and analysed here. Whole comparative genomic and proteomic analyses of the 5632 and PG2 strains indicate that their genomic plasticity resides in important genes flux and in the presence of several mobile genetic elements (10% of the genome). These analyses also revealed that specific loci encoding repertoire of surface proteins are highly dynamic. For these minimal bacteria that lack a cell-wall, these events have most likely played a major role in their survival and adaptation to complex hosts
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High-throughput experimental and computational studies of bacterial evolution
The work in this thesis is concerned with the study of bacterial adaptation on short and long timescales. In the first section, consisting of three chapters, I describe a recently developed high-throughput technology for probing gene function, transposon-insertion sequencing, and its application to the study of functional differences between two important human pathogens, Salmonella enterica subspecies enterica serovars Typhi and Typhimurium. In a first study, I use transposon-insertion sequencing to probe differences in gene requirements during growth on rich laboratory media, revealing differences in serovar requirements for genes involved in iron-utilization and cell-surface structure biogenesis, as well as in requirements for non-coding RNA. In a second study I more directly probe the genomic features responsible for differences in serovar pathogenicity by analyzing transposon-insertion sequencing data produced following a two hour infection of human macrophage, revealing large differences in the selective pressures felt by these two closely related serovars in the same environment. The second section, consisting of two chapters, uses statistical models of sequence variation, i.e. covariance models, to examine the evolution of intrinsic termination across the bacterial kingdom. A first collaborative study provides background and motivation in the form of a method for identifying Rho-independent terminators using covariance models built from deep alignments of experimentally-verified terminators from Escherichia coli and Bacillus subtilis. In the course of the development of this method I discovered a novel putative intrinsic terminator in Mycobacterium tuberculosis. In the final chapter, I extend this approach to de novo discovery of intrinsic termination motifs across the bacterial phylogeny. I present evidence for lineage-specific variations in canonical Rho-independent terminator composition, as well as discover seven non-canonical putative termination motifs. Using a collection of publicly available RNA-seq datasets, I provide evidence for the function of some of these elements as bona fide transcriptional attenuators.This work was supported by the Wellcome Trust [grant numbers WT076964, WT079643 and WT098051]
Transkription in Mycoplasma pneumoniae
Das humanpathogene Bakterium Mycoplasma pneumoniae besitzt lediglich ein kleines Repertoire von Genen, die vermutlich an der Transkriptionsregulation beteiligt sind. Dieser Umstand reflektiert seine Anpassung an ein nährstoffreiches Habitat mit konstanten Umweltbedingungen, dem menschlichen Lungenepithel. Bis heute ist der Hitzeschockregulator HrcA das einzige charakterisierte Protein, welches an der Transkriptionsregulation in diesem Organismus beteiligt ist. Da jedoch zahlreiche andere Transkriptionsregulationen in M. pneumoniae beschrieben worden sind, stellt sich die Frage, welche Mechanismen bzw. welche Regulatoren für diese Ereignisse verantwortlich sind. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der übrigen Proteine, die vermutlich an Regulationsereignissen beteiligt sind. Die gezielte Suche nach Mutanten, denen diese Proteine fehlen, zeigte dass die Mehrheit dieser Proteine für die Vitalität des Bakteriums essentiell ist. Lediglich Mutanten, denen die weitläufig in Bakterien konservierten Proteine RelA und WhiA fehlen, konnten isoliert werden. Außerdem konnte eine Interaktion zwischen dem Protein Mpn266 und der α-Untereinheit der RNA-Polymerase nachgewiesen werden, ein Hinweis darauf, dass Protein Mpn266 ein Ortholog des Transkriptionsregulators Spx in den Firmicutes ist. Auch dieser mutmaßliche Transkriptionsregulator ist essentiell. Zahlreiche Experimente zur Charakterisierung der Rolle von RelA und des Signalmoleküls (p)ppGpp in M. pneumoniae wurden durchgeführt. Während gezeigt werden konnte, dass die Mechanismen, die zur RelA-abhängigen Synthese von (p)ppGpp in diesem Organismus konserviert sind, konnte, abgesehen von der Unfähigkeit (p)ppGpp herzustellen kein weiterer Phänotyp gefunden werden. Ein Effekt von (p)ppGpp auf die Transkription konnte mittels Mikroarray-Experimenten nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche Untersuchungen zur Rolle der HPr-Phosphorylierung konnten zudem zeigen, dass diese keine Rolle bei der Transkriptionsregulation spielen. Statt dessen scheint die HPr-Phosphorylierung die pH-abhängige Zuckeraufnahme in M. pneumoniae zu regulieren. Mikroarrayuntersuchungen einer whiA Mutante zeigen eine konstitutive Hochregulation der Transkription eines großen Operons, welches hauptsächlich aus ribosomalen Genen besteht. Da sowohl der Regulator als auch das Operon in Gram-positiven Bakterien konserviert sind, liegt die Vermutung einer identischen Funktion dieses Regulators in anderen Bakterien nahe. Diese Vermutung wird durch das Vorhandensein eines gemeinsamen DNA Motivs vor diesem Operon gestützt. Zusammengefasst beinhaltet diese Arbeit die ersten Mikroarrayuntersuchungen von M. pneumoniae Mutanten überhaupt und liefert die Grundlage für zukünftige Experimente, die darauf abzielen, Regulationsereignisse in diesen Organismus besser zu verstehen
Analysis of ammonium uptake; a sigma 54 regulated function in rhizobium meliloti
Ammonium transport was examined in the symbiotic nitrogenfixing acterium Rhizobium meliloti. This was done by
assaying for the uptake of a radio-labelled analogue of
ammonium, 14C-methylamine. The activity was shown to vary
depending on the nitrogen source and its concentration m
the growth medium, and to be inducible. The effect of
various compounds on the actual assay itself was also
assessed. Ammonium, methylamme and glutamine were found to
inhibit uptake, as did sodium azide, indicating that it was
an energy-requiring process. Several mutants in nitrogen
assimilation were assayed for uptake, and this showed the
activity to be dependent on the sigma factor a54 and its
associated activator protein NtrC, but not on the three
genes for glutamine synthetase found m R . meliloti.
Genes transcribed by a54 show a highly conserved promoter
sequence m the -24/-12 region. A primer designed to this
sequence allowed use of the PCR technique to amplify
fragments containing this sequence from a gene bank of R .
meliloti. These PCR products were then cloned, and eight
transformants with different sized inserts selected for
sequencing. Analysis of the sequence data showed one to
contain the start of the m f H gene, known to be (independent,
and thereby validating this method for the
isolation of a group of promoter-specific genes
Investigating Natural Product Biosynthesis in Uncultivated Symbiotic Bacteria of the Marine Sponge <em>Theonella swinhoei</em>
Marine sponges are a rich source of bioactive natural products with potent anticancer activities. Currently, the limited availability of most of these substances prohibits further drug development (Proksch et al., 2002). Highly complex consortia of bacterial symbionts associated with sponges have been frequently proposed to be the true producers of many secondary metabolites (Piel, 2004). However, the majority of these complex microbial assemblages are not amenable to cultivation (Amann et al., 1995; Hugenholtz et al., 1998; Friedrich et al., 2001; Webster & Hill, 2001), thereby hampering efforts to prove the symbiont hypothesis as well as to access their biosynthetic potential. Using metagenomic-based approaches, Piel and colleagues have previously provided the first genetic evidence for the bacterial origin of invertebrate-derived natural products by cloning the entire gene cluster for onnamide/theopederin from the Japanese sponge Theonella swinhoei (Piel et al., 2004a, 2004b). In this work, we investigated further natural product biosynthetic pathways from uncultivated symbiotic bacteria using Japanese T. swinhoei as a symbiotic assemblage model. The reasons for selecting this sponge are the wide variety of pharmaceutically important secondary metabolites isolated from this sponge as well as the high complexity of the associated bacteria (Fusetani & Matsunaga, 1993; Henstchel et al., 2002), which might play an important role in metabolite biosynthesis. Metagenome mining strategies that we applied and developed in this work have led to the cloning of two new biosynthetic pathways from this complex symbiosis model. Our bioinformatic analysis predicted that one pathway is responsible for the biosynthesis of misakinolide A, and another one for keramamide H. Interestingly, we found that the first pathway contains additional components that match structures of swinholide A and hurghadolide A, potent actin polymerization inhibitors isolated from other sponges (Carmely & Kashman, 1985; Kitagawa et al., 1990; Doi et al. 1991; Youssef & Mooberry, 2006). Both biosynthetic pathways were encoded on two different gene clusters that exhibited typical bacterial gene features, strongly indicating that the producer of misakinolide A and keramamide H is a symbiotic bacterium. Since the screening system used to clone the gene clusters was based on the filamentous fraction dominated by “Candidatus Entotheonella sp.”, a heterothropic delta-proteobacterium associated with T. swinhoei, we assumed that misakinolide A and keramamide H are produced by “Entotheonella sp.” To confirm the taxonomic status of the bacterial producer, further analysis either by single cell studies or its combination with complete genome is currently underway. Subsequent genome sequencing of another member of this as-yet uncultivable candidate genus from a different chemotype of T. swinhoei led to the identification of genes for the biosynthesis of orbiculamide-like structure, which is structurally related to keramamides. Therefore, the results in this work provide not only convincing proof for the microbial origin of marine natural products but also specific taxonomic information as well as the potential to sustainable supply of pharmacologically potential compounds
Modulation of fatty acid synthase and plasma membrane microdomains by hydrogen peroxide
Adaptation of Saccharomyces cerevisiae cells to hydrogen peroxide (H2O2) decreases
plasma membrane permeability, slowing H2O2 diffusion into cells and turning cells more
resistant to H2O2. The mechanism responsible for this change remains largely unknown.
Here this mechanism was addressed revealing that fatty acid synthase (Fas) plays a key role
during the cellular response of S. cerevisiae to H2O2: Adaptation to H2O2 was associated with
a decrease in both Fas expression and activity. However, cellular effects of H2O2 were shown
to vary over a narrow range of concentrations. Therefore, a tight control of H2O2 exposure is
essential for cellular studies of H2O2-dependent redox regulation. The importance of Fas in
adaptation was reinforced by the observation that the decrease of Fas activity by 50 %
through deletion of one of the FAS1 alleles increases the resistance to lethal doses of H2O2.
The plasma membrane of fas1 cells presented a large increase lignoceric acid (C24:0)
(40%) and cerotic acid (C26:0) (50%) levels, suggesting that alterations in the plasma
membrane composition of very-long-chain fatty acids (VLCFA) occur with Fas downregulation.
Through interdigitation or by modulating formation of lipid rafts, VLCFA may
decrease the overall or localized plasma membrane permeability to H2O2, respectively, thus
conferring a higher resistance to H2O2. In agreement, fluorescence studies with transparinaric
acid showed that both H2O2 adaptation and Fas downregulation increase the
formation of lipid domains in the plasma membrane. Also, microscopy studies revealed that
changes in Fas activity lead to the reorganization of plasma membrane domains. Preliminary
studies in Jurkat T cells showed a decrease in plasma membrane fluidity, alteration to
digitonin sensitivity and reorganization of membrane microdomains after exposure to a nonlethal
H2O2 dose for 4 h. However, no relation between these changes and fatty acid
synthase activity could be established. In conclusion, these results reveal the key role of Fas
in the modulation of plasma membrane permeability to H2O2 during adaptation in S.
cerevisiae and suggest that downregulation of FAS1 is the molecular mechanism by which
H2O2 leads to the reorganization of the plasma membrane by remodelling specific membrane
microdomains.O peróxido de hidrogénio (H2O2) é a espécie reactiva de oxigénio mais abundante em
organismos aeróbios, uma vez que é produzido intracelularmente de forma contínua. As
suas características fisico-químicas, juntamente com a facilidade de difusão através das
membranas celulares fazem com que o H2O2 seja uma importante molécula sinalizadora em
diversos processos celulares. Porém, a regulação precisa dos níveis intracelulares de H2O2
é crucial, uma vez que a exposição a diferentes doses de H2O2 pode levar a respostas tão
diferentes como proliferação celular, senescência, adaptação, apoptose ou necrose.
Em Saccharomyces cerevisiae, a exposição a doses baixas de H2O2 (150 μM) leva à
adaptação das células, tornando-as mais resistentes a uma exposição posterior a uma dose
letal deste mesmo agente. Esta adaptação ao H2O2 deve-se não só a um aumento da
actividade dos principais enzimas que catalisam a redução do H2O2 (catalase e citocromo c
peroxidase), mas também a uma diminuição da permeabilidade da membrana plasmática ao
H2O2, impedindo a sua difusão para o interior das células. O mecanismo reponsável por
estas alterações permanece ainda desconhecido porém, estudos anteriores mostraram que
a adaptação ao H2O2 leva a alterações na composição lipídica e organização da membrana
plasmática, sendo este muito provavelmente responsável pelas alterações de fluidez e
permeabilidade ao H2O2 detectadas. Estudos anteriores mostraram que, após uma curta
exposição a uma dose adaptativa de H2O2, há um aumento dos níveis de esqualeno
(intermediário na via de síntese do ergosterol), uma alteração na composição relativa dos
principais fosfolípidos e uma reorganização dos microdomínios rígidos da membrana
plasmática, enriquecidos em ergosterol e esfingolípidos. Neste estudo observaram-se
também alterações nos níveis de expressão de genes envolvidos no metabolismo de lípidos,
nomeadamente, de genes envolvidos na via biosintetica do ergosterol (ERG1, ERG3, ERG7
and ERG25) e do metabolismo de ácidos gordos (os genes ELO1, ELO2 and ELO3,
envolvidos na enlongação de ácidos gordos, o gene OLE1 envolvido na desaturação de
ácidos gordos e nos genes FAS1 e FAS2 codificantes para as duas sub-unidades do sintase
de ácidos gordos). Uma vez que os ácidos gordos são um dos principais componentes das
membranas, o sintase de ácidos gordos surgiu como um candidato interessante para o
estudo das alterações celulares na adaptação ao H2O2.
Neste trabalho fez-se então uma abordagem ao mecanismo de adaptação centrada nas
alterações observadas no sintase de ácidos gordos (Fas), pretendendo-se compreender de
que modo o H2O2 altera a actividade de Fas e de que modo as alterações na actividade
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deste enzima alteram, por si, a resistência celular ao H2O2 e a composição e organização da
membrana plasmática.
Um dos principais resultados obtidos foi o de que a exposição de células de Saccharomyces
cerevisiae a doses adaptativas de H2O2, que leva a uma diminuição da expressão do gene
FAS1, levando consequentemente a uma diminuição da actividade de Fas. Porém, foi
observada uma variação dos efeitos celulares do H2O2 num intervalo curto de concentrações
de H2O2. Este resultado demonstra que é essencial que haja um controlo estrito da
concentração de H2O2 a que as células estão expostas de modo a ter uma reprodutibilidade
de resultados. A exposição em estado estacionário demonstrou ser a mais adequeada a
este tipo de estudos, uma vez que permite a exposição prolongada a uma dose constante
de H2O2, aproximando-se mais das condições fisiológicas. A sobre-expressão de FAS1
(conseguida através da construção de uma estirpe contendo o gene sob influência de um
promotor regulável) levou por si a uma diminuição da capacidade de sobreviver a doses
letais de H2O2, sendo esta reestabelecida com a diminuição da expressão de FAS1.
A importância do gene FAS1 no mecanismo de adaptação ao H2O2 foi reforçada pela
observação de que uma estirpe fas1 , com uma diminuição em aproximadamente 50 % dos
níveis de expressão do gene FAS1 e consequente diminuição da actividade de Fas,
apresenta por si uma maior resistência a doses letais de H2O2. Os níveis de actividade dos
principais enzimas responsáveis pela remoção de H2O2 intracelular (catalase e citocromo c
peroxidase) não aumentaram com a diminuição da expressão de FAS1 em 50 %. Os níveis
de citocromo c peroxidase mostraram até ser inferiores na estirpe fas1 , o que demonstra
que a maior resistência celular ao H2O2 nestas células não se deve a um aumento da
capacidade de eliminação de H2O2. Estudos de integridade da parede celular (estrutura que
poderia também actuar como barreira de entrada ao H2O2) mostraram não existirem
alterações a nível da parede que possam justificar a diferente resistência ao H2O2. Deste
modo a membrana plasmática, que já demonstrou no mecanismo de adaptação ao H2O2 ser
uma estrutura dinâmica que sofre alterações de modo a limitar a difusão de H2O2 para o
interior da célula, foi considerada como a principal responsável pela resistência acrescida ao
H2O2 nas células fas1 .
Efectivamente, a membrana plasmática da estirpe fas1 apresentou um aumento da razão
PC/PE. Devido às suas características biofísicas, esta alteração leva por si a um aumento
da rigidez da membrana plasmática. A membrana plasmática da estirpe fas1 apresentou
também um aumento acentuado dos níveis de ácido lignocérico (C24:0) (40 %) e ácido
cerótico (C26:0) (50 %), sugerindo que as alterações na composição da membrana
plasmática em ácidos gordos de cadeia muito longa (VLCFA) estão envolvidas neste
xv
processo. Em concordância estão os estudos de fluorescência com ácido trans-parinárico
que revelaram que a repressão de Fas leva a um aumento quantitativo e aumento da rigidez
dos domínios gel da membrana plasmática. Também os estudos de microscopia com
marcação dos princípais microdomínios da membrana plasmática de S. cerevisiae (MCCmicrodomains
occupied by Can1 e MCP – microdomains occupied by Pma1) mostraram que
as alterações na actividade de Fas levam a uma reorganização destes domínios lipídicos na
membrana plasmática. A diminuição da actividade de Fas não provoca alterações
significativas na distribuição dos domínios MCP (ao contrário do acontece na adaptação),
observando-se, porém, um pequeno aumento dos níveis de Pma1p na membrana
plasmática, embora não tão significativo como o observado no processo de adaptação ao
H2O2. As maiores alterações foram observadas ao nível dos domínios MCC, que sofreram
não só uma reorganização na membrana como um aumento em número na membrana
plasmática das células da estirpe fas1 . As alterações nos MCC poderão estar associadas
às restantes alterações observadas na membrana plasmática das células fas1 , uma vez
que estes domínios se encontram normalmente associados aos eisossomas, estruturas
organizadoras da membrana plasmática.
Foram também efectuados alguns estudos preliminares em Jurkat mostraram que a
exposição a uma dose não letal de H2O2 por tempos curtos leva a uma diminuição da fluidez
da membrana plasmática acompanhada por uma alteração da sensibilidade à digitonina e
por uma reorganização dos microdomínios da membrana plasmática. Não foi porém ainda
possível estabelecer uma ligação entre estas alterações e a sintase de ácidos gordos.
Em conclusão, este trabalho revela o papel fundamental de Fas na modulação da
permeabilidade da membrana plasmática ao H2O2 durante o processo de adaptação e
sugere que a repressão de Fas é um dos mecanismos moleculares pelos quais o H2O2
estimula a formação de jangadas lipídicas em S. cerevisiae. O proteína Fas é aqui
apresentada pela primeira vez como um novo candidato na resposta ao stress oxidativo em
S. cerevisiae.Fundação para a Ciência e a Tecnologi