SamuROI, a Python-Based Software Tool for Visualization and Analysis of Dynamic Time Series Imaging at Multiple Spatial Scales

The measurement of activity in vivo and in vitro has shifted from electrical to optical methods. While the indicators for imaging activity have improved significantly over the last decade, tools for analysing optical data have not kept pace. Most available analysis tools are limited in their flexibility and applicability to datasets obtained at different spatial scales. Here, we present SamuROI (Structured analysis of multiple user-defined ROIs), an open source Python-based analysis environment for imaging data. SamuROI simplifies exploratory analysis and visualization of image series of fluorescence changes in complex structures over time and is readily applicable at different spatial scales. In this paper, we show the utility of SamuROI in Ca2+-imaging based applications at three spatial scales: the micro-scale (i.e., sub-cellular compartments including cell bodies, dendrites and spines); the meso-scale, (i.e., whole cell and population imaging with single-cell resolution); and the macro-scale (i.e., imaging of changes in bulk fluorescence in large brain areas, without cellular resolution). The software described here provides a graphical user interface for intuitive data exploration and region of interest (ROI) management that can be used interactively within Jupyter Notebook: a publicly available interactive Python platform that allows simple integration of our software with existing tools for automated ROI generation and post-processing, as well as custom analysis pipelines. SamuROI software, source code and installation instructions are publicly available on GitHub and documentation is available online. SamuROI reduces the energy barrier for manual exploration and semi-automated analysis of spatially complex Ca2+ imaging datasets, particularly when these have been acquired at different spatial scales.Peer Reviewe

Developmental and interspecies comparison of morphology and plasticity in neuronal circuits involved in olfactory information processing

The anterior piriform cortex (aPCx) is a three layered paleocortex receiving afferent inputs from the olfactory bulb as well as local and long-range associational inputs. Neurons in layer 2 are segregated into layer 2A and layer 2B according to their position, morphology and implementation in the sensory and associative circuits. The dendritic architecture of these neurons is determined during postnatal development and plays an important role for the functionality and circuit integration of the two cell types. Here, confocal imaging, electrophysiology, morphometry and Ca2+ imaging, were combined in order to study the development of the dendritic arborizations for both subtypes of layer 2 neurons. Three different growth phases were identified: branch complexity determination, branch elongation and pruning, occurring at different time windows during development. Layer 2A and layer 2B neurons showed morphological differences between their apical and basal dendrites from the very first postnatal days; as well as phase-specific differences during development associated to differences in circuit implementation. During the first postnatal week, early spontaneous network activity in layer 2 of the aPCx displayed differences between layer 2A and layer 2B neurons in their functional connectivity, reflected in the morphological dissimilarities between their basal dendritic trees during the period of branch complexity determination. Additionally, strong differences in growth phase three were observed. Pruning was exclusive for layer 2B neurons and selective for apical dendrites receiving layer 1A sensory inputs. These differences between layer 2A and layer 2B cells in their morphological and functional development exhibit the close association between circuit specificity and neuronal development. Finally, synaptic plasticity in the mossy fiber (MF) pathway of the hippocampus in shrews was investigated and compared to mice. Although hippocampal structure in shrews is preserved, short and long-term plasticity at the MF synapsis was lower compared to mice, suggesting different involvement of these synapses in the behavioral outcome of different species.Der Cortex piriformis anterior (aPCx auf Englisch) ist ein dreischichtiger Paläokortex, der sensorische afferente Eingänge aus dem Riechkolben sowie intracerebrale assoziative Eingänge empfängt. Die Neuronen in Schicht 2 werden nach ihrer Position, Morphologie und Einbindung in die sensorischen und rekurrenten Netzwerke in die Schichten 2A und 2B unterteilt. Die dendritische Architektur dieser Neurone wird während der postnatalen Entwicklung festgelegt und spielt eine wichtige Rolle für die Funktionalität und Netzwerkintegration der beiden Zelltypen. Hier wurden konfokales Imaging, Elektrophysiologie, Morphometrie und Kalzium-Imaging kombiniert, um die Entwicklung der Dendritenbäume für beide Subtypen von Schicht-2-Neuronen zu untersuchen. Es wurden drei verschiedene Wachstumsphasen identifiziert: Bestimmung der Komplexität der Verzweigung, Verlängerung der Verzweigung und strukturelle Vereinfachung, die in verschiedenen Zeitfenstern während der Entwicklung auftreten. Neurone der Schicht 2A und der Schicht 2B zeigten bereits in den ersten postnatalen Tagen morphologische Unterschiede zwischen ihren apikalen und basalen Dendriten sowie phasenspezifische Unterschiede während der Entwicklung, die mit Unterschieden in der Netzwerkimplementierung verbunden sind. Während der ersten postnatalen Woche zeigte die frühe spontane Netzwerkaktivität in Schicht 2 des aPCx Unterschiede in der funktionellen Konnektivität zwischen Neuronen der Schicht 2A und Schicht 2B, die sich in den morphologischen Unterschieden zwischen ihren basalen Dendritenbäumen während der Bestimmung der Verzweigungskomplexität widerspiegelten. Außerdem wurden starke Unterschiede in der dritten Wachstumsphase beobachtet. Die strukturelle Vereinfachung fand ausschließlich bei Neuronen der Schicht 2B statt und war selektiv für apikale Dendriten, die sensorische Inputs der Schicht 1A erhielten. Diese Unterschiede zwischen Zellen der Schicht 2A und der Schicht 2B in ihrer morphologischen und funktionellen Entwicklung zeigen den engen Zusammenhang zwischen Netzwerkspezifität und neuronaler Entwicklung. Schließlich wurde die synaptische Plastizität des Moosfaser (MF)-Trakts des Hippocampus bei Spitzmäusen untersucht und mit der von Mäusen verglichen. Obwohl die Struktur des Hippocampus bei Spitzmäusen erhalten ist, war die Kurz- und Langzeitplastizität an den MF-Synapsen im Vergleich zu Mäusen geringer, was auf eine unterschiedliche Beteiligung dieser Synapsen an spezifisch adaptierte Verhaltensweisen der beiden Spezies hindeutet

Layer 3 Pyramidal Cells in the Medial Entorhinal Cortex Orchestrate Up-Down States and Entrain the Deep Layers Differentially

Up-down states (UDS) are synchronous cortical events of neuronal activity during non-REM sleep. The medial entorhinal cortex (MEC) exhibits robust UDS during natural sleep and under anesthesia. However, little is known about the generation and propagation of UDS-related activity in the MEC. Here, we dissect the circuitry underlying UDS generation and propagation across layers in the MEC using both in vivo and in vitro approaches. We provide evidence that layer 3 (L3) MEC is crucial in the generation and maintenance of UDS in the MEC. Furthermore, we find that the two sublayers of the L5 MEC participate differentially during UDS. Our findings show that L5b, which receives hippocampal output, is strongly innervated by UDS activity originating in L3 MEC. Our data suggest that L5b acts as a coincidence detector during information transfer between the hippocampus and the cortex and thereby plays an important role in memory encoding and consolidation

Circuit-specific dendritic development in the piriform cortex

Dendritic geometry is largely determined during postnatal development and has a substantial impact on neural function. In sensory processing, postnatal development of the dendritic tree is affected by two dominant circuit motifs, ascending sensory feedforward inputs and descending and local recurrent connections. Two subtypes of layer 2 neurons in the three-layered anterior piriform cortex, layer 2a and layer 2b neurons, display a clear vertical segregation of these two circuit motifs. Here, we combined electrophysiology, detailed morphometry and Ca(2+) imaging-both of neuronal networks as well as of subcellular structures-in acute mouse brain slices and modeling. This allowed us to compare the functional implications of distinct circuit-specific postnatal dendritic growth patterns in these two neuronal subtypes. We observed that determination of branching complexity, dendritic length increases and pruning occurred in distinct growth phases. Layer 2a and layer 2b neurons displayed growth phase specific developmental differences between their apical and basal dendritic trees. This was reflected by compartment-specific differences in Ca(2+) signaling. The morphological and functional developmental pattern differences between layer 2a and layer 2b neurons dendrites provide further evidence that they constitute two functionally distinct streams of olfactory information processing

Funktionelle Rolle Medial Septaler Projektionen zum Parasubiculum

Oscillations are a hallmark of brain activity and can be generated by local synchronisation mechanisms. They have been implicated in the communication between brain areas. An important type of oscillations are θ oscillations (4-12 Hz), which are associated with different behaviours, such as movements and navigation, but they also play a crucial role in memory formation and retrieval. One of the major θ rhythm generators in the brain is the medial septum (MS), which with its different types of projecting neurons, innervates many cortical areas and synchronises their activity. I investigated two major projection types of the MS: GABAergic (γ-aminobutyric acid – GABA) and cholinergic (acetylcholine – ACh) projections. Both projections are known to target the medial entorhinal cortex (MEC) and hippocampus. Parvalbumin positive (PV+) projections of the MS, which are GABAergic, are known to synchronise cortical networks via disinhibition often by inhibiting interneurons. In contrast, cholinergic projections of the MS project to a wide range of cell types in the MEC and hippocampus and can have substantially different effects on the target cell (e.g. activation or inhibition). Thus, their function on a network can range from increasing activity through depolarising excitatory cells, to more inhibition of the network by activating interneurons, or even modulating synaptic integration. Previous studies have focussed on identifying projections to the hippocampus and the MEC but did not consider the parasubiculum (PaS), a major input of the MEC. In this study, we electrophysiologically characterised cells in the PaS and demonstrated layer I interneurons to be distinctly different from putative layer II interneurons. The PaS, with its strong θ rhythmic firing cells, was shown to have the highest density of MS PV+ fibres in the parahippocampal formation, suggesting that it is an important target of MS projections and yet MS inputs to the PaS are unknown. Using channelrhodopsin (ChR2), a light sensitive ion channel, expressed in the MS of PV-Cre and ChAT-Cre (choline acetyltransferase) mice in-vivo, I identified GABAergic and cholinergic MS connections to the PaS in-vitro and demonstrated cell type specific projection patterns. I found that PV+ MS projections mainly inhibit interneurons in the PaS, including layer I interneurons, representing a novel cortical target of PV+ MS cells. On the other hand, cholinergic projections depolarise layer I interneurons and have multiple effects on deeper cells of the PaS, leading to a depolarisation or hyperpolarisation. To investigate a potential role of GABAergic projections in θ generation, I recorded local field potentials (LFP) in awake head-fixed mice and entrained oscillations in the PaS by stimulating with light in the MS. In contrast, local stimulation of fibres in the PaS could not entrain oscillation, suggesting that increased activity in the PaS might be required for MS PV+ cells to entrain θ. Taken together, stimulation of PV+ cells in the MS is sufficient to drive oscillations in the PaS, likely via disinhibition in line with other areas as the MEC and hippocampus. However, novel targets in layer I could be involved via cholinergic activation and GABAergic entrainment. Whether cholinergic activation by itself can entrain θ remains to be further investigated.Oszillationen sind ein Kennzeichen von Gehirnaktivität und können durch lokale Synchronisationsmechanismen generiert werden. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Kommunikation zwischen Gehirnarealen. Ein wichtiger Typ von Oszillationen sind θ Oszillationen (4 − 12 Hz), welche mit verschiedenen Verhalten wie Bewegung und Navigation assoziiert sind und eine wichtige Rolle in der Gedächtnisbildung und -abrufung spielen. Einer der wichtigen θ Generatoren im Gehirn ist das Mediale Septum (MS), welches mit seinen verschiedenen projizierenden Neuronen viele kortikale Regionen innerviert. Ich habe zwei Typen von Projektionen des MS untersucht: GABAerge (γ-Aminobuttersäure – GABA) und cholinerge (Acetylcholin – ACh) Projektionen. Beide Typen projizieren zum Medialen Entohinalen Kortex (MEC) und zum Hippocampus. Parvalbumin positive (PV+) Projektionen des MS können kortikale Netzwerke via Disinhibition, durch inhibieren von Interneuronen, synchronisieren. Im Gegensatz dazu projizieren cholinerge Projektionen des MS zu verschiedensten Zelltypen des MEC und des Hippocampus und können unterschiedliche weitreichende Effekte auf Zellen haben (z.B. Aktivierung und Inhibierung). Folglich können die Konsequenzen von Aktivierung des Netzwerkes via Depolarisation von exzitatorischen Zellen, über Inhibierung des Netzwerkes via Aktivierung von Interneuronen bis hin zur Modulation von synaptischer Integration reichen. In der Vergangenheit haben Studien sich auf die Identifizierung von Projektionen zum Hippocampus und MECs fokussiert, jedoch nicht zum Parasubiculum (PaS), eines der bedeutendsten Eingänge des MEC. In dieser Studie haben wir elektrophysiologisch Zellen im PaS charakterisiert und konnten herausstellen, dass Schicht I Zellen sich von anderen vermeintlichen Interneuronen in Schicht II unterscheiden. Das PaS, mit seinen im θ Rhythmus feuernden Zellen, hat die höchste Dichte von MS PV+ Fasern im parahippocampalen Netzwerk, was es als besonderes Ziel für MS Projektionen herausstellt. Dennoch sind Projektionen vom MS zum PaS nicht untersucht worden. Mit Hilfe von Channelrhodopsin (ChR2), einem lichtsensitivem Ionenkanal, welcher im MS von PV-Cre und ChAT-Cre Mäusen exprimiert wurde, konnte ich GABAerge und cholinerge MS Verbindungen zum PaS in-vitro detektieren und Zelltyp-speziefische Projektionen identifizieren. Ich konnte herausstellen, dass PV+ MS Projektionen hauptsächlich Interneurone im PaS inhibieren. Insbesondere Schicht I Interneurone stellen ein neues kortikales Ziel von PV+ MS Zellen dar. Im Gegensatz dazu werden Schicht I Interneurone des PaS durch cholinerge MS Projektionen depolarisiert wohingegen Zellen in tieferen Schichten depolarisiert oder hyperpolarisiert werden können. Um zu zeigen, dass man mit GABAergen Projektionen θ generieren kann, nahm ich das lokale Feldpotential (LFP) in Kopffixierten Mäusen auf und fand, dass man Oszillationen mit MS-Stimulation gleichschalten kann, jedoch eine Stimulation der Fasern im PaS nicht ausreichend ist. Das weist darauf hin, dass eine erhöhte PaS-Aktivität notwendig ist, um θ Oszillationen im PaS zu generieren. Zusammenfassend zeigt sich, dass eine Stimulation der PV+ Zellen im MS ausreichend ist, um im PaS Oszillationen zu generieren. Disinhibierung im PaS ist, ähnlich wie auch im MEC und Hippocampus, ein wahrscheinlicher Mechanismus. Weiterhin könnten jedoch neue Ziele von cholinergen und GABAergen Fasern in Schicht I bei der θ Generierung involviert sein. Ob θ Oszillationen durch cholinerge Projektionen gleichgeschaltet werden kann muss jedoch noch durch weitere Studien gezeigt werden

Apprendre de données positives et non étiquetées : application à la segmentation et la détection d'évènements calciques

Deux types de neurotransmission se produisent dans les neurones du cerveau : la transmission évoquée et la transmission spontanée. Contrairement à la transmission évoquée, le rôle de la transmission spontanée sur la plasticité synaptique - un mécanisme utilisé pour doter le cerveau de capacités d'apprentissage et de mémorisation - reste incertain. Les neurotransmissions spontanées sont localisées et se produisent aléatoirement dans les synapses des neurones. Lorsqu'un tel événement spontané se produit, ce que l'on appelle un influx synaptique miniature d'ions calcium (miniature Synaptic Ca²⁺ Transient, mSCT), des ions calcium messagers secondaires pénètrent dans la synapse, activant les voies de signalisation en aval de la plasticité synaptique. L'utilisation de l'imagerie calcique du neurone in vitro permet la visualisation spatiotemporelle de l'entrée des ions calcium. Les vidéos calciques qui en résultent permettent une étude quantitative de l'impact du mSCT sur la plasticité synaptique. Cependant, la localisation des mSCTs dans l'imagerie du calcium est difficile en raison de leur petite taille, de leur faible intensité par rapport au bruit de l'imagerie et de leur caractère aléatoire inhérent. Dans ce mémoire, nous présentons une méthode d'analyse quantitative à grande échelle des vidéos d'imagerie calcique limitant la variabilité induite par les interventions humaines pour obtenir des données probantes, dans le but de caractériser l'impact des mSCTs sur la plasticité synaptique. En nous basant sur un outil semi-automatique de détection à seuil d'intensité (Intensity Thresholded Detection, ITD), nous sommes capables de générer des données pour entraîner un réseau pleinement convolutionnel (Fully Convolutional Network, FCN) afin de détecter rapidement et automatiquement les mSCTs à partir de vidéos calciques. En utilisant les segmentations bruitées de l'ITD comme données d'entraînement, combinées à un schéma d'entraînement positif (P) et non étiqueté (Unlabeled, U), les performances du FCN surpassent ITD. Le FCN détecte des mSCTs de faible intensité non détectés auparavant par ITD et offre une segmentation supérieure à ITD. Nous avons ensuite caractérisé l'impact des paramètres PU tels que le nombre de P et le ratio P:U. Le FCN entraîné est intégré dans une routine tout-en-un pour permettre une analyse à grande échelle des mSCTs. La routine offre la détection, la segmentation, la caractérisation et la visualisation des mSCTs ainsi qu'une solution logicielle pour gérer plusieurs vidéos avec différentes métadonnées.Two types of neurotransmission occur in brain’s neurons: evoked transmission and spontaneous transmission. Unlike the former, the role of spontaneous transmission on synaptic plasticity –a mechanism used to endow the brain learning and memory abilities – remain unclear. Spontaneous neurotransmissions are localized and randomly happening in neuron’s synapses. When such spontaneous events happen, so-called miniature synaptic Ca²⁺ transients(mSCT), second messenger calcium ions entered the spine, activating downstream signaling pathways of synaptic plasticity. Using calcium imaging of in vitro neuron enable spatiotemporal visual-ization of the entry of calcium ions. Resulting calcium videos enable quantitative study of mSCT’s impact on synaptic plasticity. However, mSCT localization in calcium imaging can be challenging due to their small size, their low intensity compared with the imaging noise and their inherent randomness. In this master’s thesis, we present a method for quantitative high-through put analysis of calcium imaging videos that limits the variability induced by human interventions to obtain evidence for characterizing the impact of mSCTs on synaptic plasticity. Based on a semi-automatic intensity thresholded detection (ITD) tool, we are able to generate data to train a fully convolutional neural network (FCN) to rapidly and automaticaly detect mSCT from calcium videos. Using ITD noisy segmentations as training data combine with a positive and unlabeled (PU) training schema, we leveraged FCN performances and could even detect previously undetected low instensity mSCTs missed by ITD. The FCN also provide better segmentation than ITD. We then characterized the impact of PU parameters such as the number of P and the ratio P:U. The trained FCN is bundled in a all-in-one pipeline to permit a high-thoughtput analysis of mSCT. The pipeline offers detection, segmentation,characterization and visualization of mSCTs as well as a software solution to manage multiple videos with different metadatas

SamuROI, a Python-Based Software Tool for Visualization and Analysis of Dynamic Time Series Imaging at Multiple Spatial Scales

The measurement of activity in vivo and in vitro has shifted from electrical to optical methods. While the indicators for imaging activity have improved significantly over the last decade, tools for analysing optical data have not kept pace. Most available analysis tools are limited in their flexibility and applicability to datasets obtained at different spatial scales. Here, we present SamuROI (Structured analysis of multiple user-defined ROIs), an open source Python-based analysis environment for imaging data. SamuROI simplifies exploratory analysis and visualization of image series of fluorescence changes in complex structures over time and is readily applicable at different spatial scales. In this paper, we show the utility of SamuROI in Ca2+-imaging based applications at three spatial scales: the micro-scale (i.e., sub-cellular compartments including cell bodies, dendrites and spines); the meso-scale, (i.e., whole cell and population imaging with single-cell resolution); and the macro-scale (i.e., imaging of changes in bulk fluorescence in large brain areas, without cellular resolution). The software described here provides a graphical user interface for intuitive data exploration and region of interest (ROI) management that can be used interactively within Jupyter Notebook: a publicly available interactive Python platform that allows simple integration of our software with existing tools for automated ROI generation and post-processing, as well as custom analysis pipelines. SamuROI software, source code and installation instructions are publicly available on GitHub and documentation is available online. SamuROI reduces the energy barrier for manual exploration and semi-automated analysis of spatially complex Ca2+ imaging datasets, particularly when these have been acquired at different spatial scales