Alteration of Epigenetic Regulation by Long Noncoding RNAs in Cancer

Long noncoding RNAs (lncRNAs) are important regulators of the epigenetic status of the human genome. Besides their participation to normal physiology, lncRNA expression and function have been already associated to many diseases, including cancer. By interacting with epigenetic regulators and by controlling chromatin topology, their misregulation may result in an aberrant regulation of gene expression that may contribute to tumorigenesis. Here, we review the functional role and mechanisms of action of lncRNAs implicated in the aberrant epigenetic regulation that has characterized cancer development and progression

Epigenetic regulation of neuroblastoma development

In recent years, technological advances have enabled a detailed landscaping of the epigenome and the mechanisms of epigenetic regulation that drive normal cell function, development and cancer. Rather than merely a structural entity to support genome compaction, we now look at chromatin as a very dynamic and essential constellation that is actively participating in the tight orchestration of transcriptional regulation as well as DNA replication and repair. The unique feature of chromatin flexibility enabling fast switches towards more or less restricted epigenetic cellular states is, not surprisingly, intimately connected to cancer development and treatment resistance, and the central role of epigenetic alterations in cancer is illustrated by the finding that up to 50% of all mutations across cancer entities affect proteins controlling the chromatin status. We summarize recent insights into epigenetic rewiring underlying neuroblastoma (NB) tumor formation ranging from changes in DNA methylation patterns and mutations in epigenetic regulators to global effects on transcriptional regulatory circuits that involve key players in NB oncogenesis. Insights into the disruption of the homeostatic epigenetic balance contributing to developmental arrest of sympathetic progenitor cells and subsequent NB oncogenesis are rapidly growing and will be exploited towards the development of novel therapeutic strategies to increase current survival rates of patients with high-risk NB

Identification of long non-coding RNAs involved in neuronal development and intellectual disability

Recently, exome sequencing led to the identification of causal mutations in 16–31% of patients with intellectual disability (ID), leaving the underlying cause for many patients unidentified. In this context, the noncoding part of the human genome remains largely unexplored. For many long non-coding RNAs (lncRNAs) a crucial role in neurodevelopment and hence the human brain is anticipated. Here we aimed at identifying lncRNAs associated with neuronal development and ID. Therefore, we applied an integrated genomics approach, harnessing several public epigenetic datasets. We found that the presence of neuron-specific H3K4me3 confers the highest specificity for genes involved in neurodevelopment and ID. Based on the presence of this feature and GWAS hits for CNS disorders, we identified 53 candidate lncRNA genes. Extensive expression profiling on human brain samples and other tissues, followed by Gene Set Enrichment Analysis indicates that at least 24 of these lncRNAs are indeed implicated in processes such as synaptic transmission, nervous system development and neurogenesis. The bidirectional or antisense overlapping orientation relative to multiple coding genes involved in neuronal processes supports these results. In conclusion, we identified several lncRNA genes putatively involved in neurodevelopment and CNS disorders, providing a resource for functional studies

Functional implications of long non-coding RNAs in the pancreatic islets of Langerhans.

Type-2 diabetes (T2D) is a complex disease characterized by insulin resistance in target tissues and impaired insulin release from pancreatic beta cells. As central tissue of glucose homeostasis, the pancreatic islet continues to be an important focus of research to understand the pathophysiology of the disease. The increased access to human pancreatic islets has resulted in improved knowledge of islet function, and together with advances in RNA sequencing and related technologies, revealed the transcriptional and epigenetic landscape of human islet cells. The discovery of thousands of long non-coding RNA (lncRNA) transcripts highly enriched in the pancreatic islet and/or specifically expressed in the beta-cells, points to yet another layer of gene regulation of many hitherto unknown mechanistic principles governing islet cell functions. Here we review fundamental islet physiology and propose functional implications of the lncRNAs in islet development and endocrine cell functions. We also take into account important differences between rodent and human islets in terms of morphology and function, and suggest how species-specific lncRNAs may partly influence gene regulation to define the unique phenotypic identity of an organism and the functions of its constituent cells. The implication of primate-specific lncRNAs will be far-reaching in all aspects of diabetes research, but most importantly in the identification and development of novel targets to improve pancreatic islet cell functions as a therapeutic approach to treat T2D

Examples of sequence conservation analyses capture a subset of mouse long non-coding RNAs sharing homology with fish conserved genomic elements

Background: Long non-coding RNAs (lncRNA) are a major class of non-coding RNAs. They are involved in diverse intra-cellular mechanisms like molecular scaffolding, splicing and DNA methylation. Through these mechanisms they are reported to play a role in cellular differentiation and development. They show an enriched expression in the brain where they are implicated in maintaining cellular identity, homeostasis, stress responses and plasticity. Low sequence conservation and lack of functional annotations make it difficult to identify homologs of mammalian lncRNAs in other vertebrates. A computational evaluation of the lncRNAs through systematic conservation analyses of both sequences as well as their genomic architecture is required.Results: Our results show that a subset of mouse candidate lncRNAs could be distinguished from random sequences based on their alignment with zebrafish phastCons elements. Using ROC analyses we were able to define a measure to select significantly conserved lncRNAs. Indeed, starting from ~2,800 mouse lncRNAs we could predict that between 4 and 11% present conserved sequence fragments in fish genomes. Gene ontology (GO) enrichment analyses of protein coding genes, proximal to the region of conservation, in both organisms highlighted similar GO classes like regulation of transcription and central nervous system development. The proximal coding genes in both the species show enrichment of their expression in brain. In summary, we show that interesting genomic regions in zebrafish could be marked based on their sequence homology to a mouse lncRNA, overlap with ESTs and proximity to genes involved in nervous system development.Conclusions: Conservation at the sequence level can identify a subset of putative lncRNA orthologs. The similar protein-coding neighborhood and transcriptional information about the conserved candidates provide support to the hypothesis that they share functional homology. The pipeline herein presented represents a proof of principle showing that a portion between 4 and 11% of lncRNAs retains region of conservation between mammals and fishes. We believe this study will result useful as a reference to analyze the conservation of lncRNAs in newly sequenced genomes and transcriptomes. \uc2\ua9 2013 Basu et al.; licensee BioMed Central Ltd

SINEUPs, a new class of antisense long non-coding RNAs that enhance synthesis of target proteins in cells: molecular mechanisms and applications

Thanks to continuous advances in sequencing technologies, we know that a huge number of non-coding RNAs are transcribed from mammalian genomes. Of these, long non-coding RNAs (lncRNAs) represent the widest and most heterogeneous class. An increasing number of studies are unveiling lncRNA functions, supporting their active role in regulating gene expression. Regardless of lncRNAs specific functional features, their organization into discrete domains seems to represent a common denominator. Through such domains lncRNAs can recruit and coordinate the activity of multiple effectors, thus working as \u201cflexible modular scaffolds\u201d. This model has globally driven towards the quest for regulatory elements within lncRNAs, with a special attention on functional cues deriving from RNA folding. Since transposable elements (TEs) represent 40% of nucleotides of lncRNA sequences, they have been proposed as candidate functional modules. Carrieri and colleagues recently reported that an embedded inverted SINEB2 element acts as a functional domain in antisense (AS) Uchl1, an AS lncRNA able to increase translation of partially-overlapping protein-coding sense Uchl1 mRNA. AS Uchl1 regulatory properties depend on two RNA domains. A 5' overlapping sequence to the sense transcript is the Binding Domain (BD) and drives specificity of action. An embedded inverted SINEB2 element functions as Effector Domain (ED) conferring translational activation power. AS Uchl1 is the representative member of a new class of lncRNAs, named SINEUPs, as they rely on a SINEB2 element to UP-regulate translation. AS Uchl1 activity can be transferred to a synthetic construct by manipulating the AS sequence in the BD, suggesting the potential use of AS Uchl1- derived synthetic SINEUPs as tools to increase translation of selected targets. This work was the first example of a specific biological function assigned to an embedded TE leading to the hypothesis that embedded TEs provide functional modules to lncRNAs. A major limit to the application of SINEUPs is represented by the poor knowledge of the basic mechanisms underlying the biological activity of the ED. A crucial challenge becomes the identification of secondary structures that may confer characteristic protein binding properties. Protein partners would modulate SINEUPs action and contribute to achieve specific functional outputs. In this thesis, I focus on understanding the molecular basis of SINEUPs activity in cells and I discuss the potential applications of synthetic SINEUPs as translation enhancers. First, I investigated the structural basis for translation activation mediated by the ED of SINEUPs. I pointed out that specific structural regions, containing a short terminal hairpin, are involved in the ability of natural and synthetic SINEUPs to increase translation of target mRNAs. Next, I identified protein partners modulating the activity of SINEUPs in cells. I found that AS Uchl1 interacts with the interleukin enhancer-binding factor 3 (ILF3) and that the presence of the inverted SINEB2 favors binding in vivo. In particular, I demonstrated that the AS Uchl1-embedded TEs, inverted SINEB2 and Alu, direct AS Uchl1 localization to ILF3-containing complexes, thus contributing to AS Uchl1 bias towards nuclear localization. I thus suggest that nuclear retention could represent a possible mechanism regulating SINEUP activity. I also validated the scalability of synthetic SINEUPs as tools to increase protein synthesis of targets of choice. I showed that SINEUP technology can be adapted to a broader number of targets, with interesting potential applications in different fields, from biotechnology to therapy. SINEUPs function in an array of cell lines and can be efficiently directed toward N-terminally tagged proteins. Their biological activity is retained in a miniaturized version within the range of small RNAs length. Their modular structure can be exploited to successfully design synthetic SINEUPs against selected endogenous targets, supporting their efficacy as tools to modulate gene expression in vitro and in vivo. Hence, I propose SINEUPs as versatile tools to enhance translation of mRNAs of choice

Retrotransposons as drivers of Mammalian brain evolution

Retrotransposons, a large and diverse class of transposable elements that are still active in humans, represent a remarkable force of genomic innovation underlying mammalian evolution. Among the features distinguishing mammals from all other vertebrates, the presence of a neocor-tex with a peculiar neuronal organization, composition and connectivity is perhaps the one that, by affecting the cognitive abilities of mammals, contributed mostly to their evolutionary success. Among mammals, hominids and especially humans display an extraordinarily expanded cortical volume, an enrichment of the repertoire of neural cell types and more elaborate patterns of neuronal connectivity. Retrotransposon-derived sequences have recently been implicated in multiple layers of gene regulation in the brain, from transcriptional and post-transcriptional control to both local and large-scale three-dimensional chromatin organization. Accordingly, an increasing variety of neurodevelopmental and neurodegenerative conditions are being recognized to be associated with retrotransposon dysregulation. We review here a large body of recent studies lending support to the idea that retrotransposon-dependent evolutionary novelties were crucial for the emergence of mammalian, primate and human peculiarities of brain morphology and function

From Junk to Function: LncRNAs in CNS Health and Disease

Recent advances in RNA sequencing technologies helped to uncover the existence of tens of thousands of long non-coding RNAs (lncRNAs) that arise from the dark matter of the genome. These lncRNAs were originally thought to be transcriptional noise but an increasing number of studies demonstrate that these transcripts can modulate protein-coding gene expression by a wide variety of transcriptional and post-transcriptional mechanisms. The spatiotemporal regulation of lncRNA expression is particularly evident in the central nervous system, suggesting that they may directly contribute to specific brain processes, including neurogenesis and cellular homeostasis. Not surprisingly, lncRNAs are therefore gaining attention as putative novel therapeutic targets for disorders of the brain. In this review, we summarize the recent insights into the functions of lncRNAs in the brain, their role in neuronal maintenance, and their potential contribution to disease. We conclude this review by postulating how these RNA molecules can be targeted for the treatment of yet incurable neurological disorders

Ο ρόλος των μακρών RNAs που δεν κωδικοποιούν για πρωτεΐνες (lncRNAs) στην ανάπτυξη του εγκεφάλου των θηλαστικών

Με την έλευση και διάδοση των τεχνολογιών αλληλούχισης νέας γενιάς, ένας αυξανόμενος αριθμός πρώην άγνωστων ρυθμιστικών ειδών RNA έχει έρθει στο προσκήνιο. Μεταξύ αυτών, βρέθηκαν μακρά RNA μόρια που δεν κωδικοποιούν για πρωτεΐνες (long non-coding RNAs – lncRNAs), τα οποία συμμετέχουν στον έλεγχο της πολυδυναμίας των βλαστικών κυττάρων, την καρκινογένεση, την ανάπτυξη και τη λειτουργία πολλών ιστών και οργάνων. Παρόλο που χιλιάδες lncRNAs εκφράζονται στον εγκέφαλο των ενήλικων θηλαστικών με ειδικά και συγκεκριμένα μοτίβα έκφρασης, παραμένουν ελάχιστα αναγνωρισμένα και χαρακτηρισμένα, ενώ οι ρόλοι τους στην ανάπτυξη του εγκεφάλου δεν έχουν ακόμη μελετηθεί. Η αντίληψη ότι το γονιδίωμα ασκεί τις λειτουργίες του μόνο μέσω πρωτεϊνών και τυπικών γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες εμφανίζεται προοδευτικά ως μια μάλλον αφελής απλοποίηση ενός σύνθετου και γοητευτικού συστήματος που βρίθει βρόγχων και δικτύων και που περιλαμβάνει επίσης μόρια RNA εκτός από πρωτεΐνες. Πράγματι, η γνώση μας για τη δραστηριότητα, τη ρύθμιση και την αρχιτεκτονική των γονιδιωμάτων των θηλαστικών έχει αναβαθμιστεί πλήρως μετά από τις τελευταίες εξελίξεις στις τεχνολογίες αλληλούχισης και στα δεδομένα που αποκτήθηκαν από μελέτες μεγάλης κλίμακας όπως το ENCODE και το FANTOM. Επιπλέον, οι συγκρίσεις μεταξύ μεταγραφωμάτων και γονιδιωμάτων θηλαστικών έχουν δείξει ότι περίπου τα δύο τρίτα του γονιδιωματικού DNA μεταγράφονται, αλλά μόνο λιγότερο από το 2% μεταφράζεται τελικά σε πρωτεΐνες. Επιπλέον, ακόμη και αν ληφθούν υπόψη τα παράγωγα που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα και από μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις, το επίπεδο της πολυπλοκότητας των οργανισμών μεταξύ των ευκαρυωτικών συσχετίζεται καλύτερα με το κλάσμα των RNAs που δεν κωδικοποιούν για πρωτεΐνες παρά με το άθροισμα των γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες. Εκτός από την ήδη γνωστή πληθώρα και πολυπλοκότητα που επιτυγχάνεται από τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, τα ρυθμιστικά τους στοιχεία και τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις, έχει αναγνωριστεί ένας εκπληκτικός αριθμός μη κωδικοποιητικών RNA (ncRNAs). Αυτά τα ncRNAs ταξινομούνται σε μικρά (scnRNAs) και μακριά (lncRNAs) μη κωδικοποιητικά RNA, τα οποία διαφέρουν κυρίως σε μέγεθος, αλλά και σε λειτουργία. Τα περισσότερα από τα sncRNA λειτουργούν ως ρυθμιστές σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο στο κυτταρόπλασμα, ενώ τα lncRNAs δρουν σε ένα πιο ευρύ και ποικίλο εύρος λειτουργιών. Στην πραγματικότητα, διαπιστώθηκε ότι οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που περιλαμβάνουν lncRNAs επηρεάζουν εκτενώς τη γονιδιακή ρύθμιση μεμονωμένων γονιδίων και γονιδιακών δικτύων σε μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. Επομένως, τα lncRNAs παρέχουν στα κύτταρα ένα επιπλέον εργαλείο για τον έλεγχο της χωροχρονικής ρύθμισης των γονιδίων, μια κρίσιμη απαίτηση για τα νευρικά βλαστικά κύτταρα κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Ο κύριος στόχος αυτής της διδακτορικής διατριβής είναι η καλύτερη κατανόηση της εμπλοκής των lncRNAs στην ανάπτυξη του εγκεφάλου των θηλαστικών και ειδικά στα γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα που ορίζουν την ταυτότητα των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, οι συγκεκριμένοι στόχοι αυτής της διατριβής περιλαμβάνουν: α) Ταυτοποίηση lncRNAs που εκφράζονται σε νευρικά κύτταρα και χαρακτηρισμός των αλλαγών στο προφίλ έκφρασης αυτών των lncRNAs κατά την ανάπτυξη εγκεφάλου μυός (και πιο συγκεκριμένα του τελεγκεφάλου). β) Αξιολόγηση της σημαντικότητας των lncRNAs που προσδιορίστηκαν στον προηγούμενο στόχο και συγκεκριμένα αν απαιτούνται για την ανάπτυξη του εγκεφάλου μυός. Εδώ σκοπεύουμε να εξετάσουμε με συνολικό τρόπο το ρόλο των lncRNAs που προέκυψαν από τον προηγούμενο στόχο στον έλεγχο των ιδιοτήτων των νευρικών βλαστικών κυττάρων μυός. Έχουμε αναπτύξει πειραματικά συστήματα για την απομόνωση, την καλλιέργεια και τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων από το εμβρυϊκό κεντρικό νευρικό σύστημα μυών και έχουμε χρησιμοποιήσει αυτά τα συστήματα για να μελετήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την κυτταρική εξειδίκευση και τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Αυτός ο στόχος περιλαμβάνει δύο συγκεκριμένους υπο - στόχους: 1: Υπερέκφραση επιλεγμένων lncRNAs και ανάλυση της επίδρασης της υπερέκφρασής τους σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων. 2: Αποσιώπηση επιλεγμένων lncRNAs χρησιμοποιώντας ένα σύστημα CRISPR-dCas9-KRAB και ανάλυση της επίδρασης της αποσιώπησής τους σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων. Ο απώτερος στόχος αυτής της διατριβής είναι να παρέχει πληροφορίες για τη συμμετοχή των lncRNAs στην οργανογένεση και να συμβάλλει στην κατανόηση του τρόπου με τον οποίο τα lncRNAs και τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες σχηματίζουν ρυθμιστικά δίκτυα με σημαντικές λειτουργίες στα νευρικά κύτταρα. Η κατανόηση του ρόλου των lncRNAs στην οργανογένεση του εγκεφάλου θα μπορούσε να επιφέρει σημαντικότατες προσθήκες στις βασικές αρχές της αναπτυξιακής / κυτταρικής βιολογίας και της νευροεπιστήμης. Για να αντιμετωπίσουμε λοιπόν το βασικό μας ερώτημα, αρχικά πραγματοποιήσαμε RNA-Seq ανάλυση στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα εμβρύων μυός. Με βάση αυτήν την ανάλυση, εντοπίσαμε πολλά lncRNAs με υψηλά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα του νευρικού συστήματος. Εστιάσαμε σε lncRNAs, τα οποία μεταγράφονται από γονιδιωματικούς τόπους σε κοντινή απόσταση με γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες και πιο συγκεκριμένα, σε κοντινή απόσταση με γονίδια που κωδικοποιούν για μεταγραφικούς παράγοντες με κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του εγκεφάλου. Βασιζόμενοι και στη σχετική βιβλιογραφία που πρότεινε ως πιθανό μηχανισμό δράσης των lncRNAs την in cis επίδρασή τους σε διπλανά γονίδια, υποθέσαμε ότι αυτά τα lncRNAs μπορεί να εμπλέκονται στη ρύθμιση των γειτονικών τους γονιδίων που κωδικοποιούν για σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Για να ελέγξουμε αυτήν την αρχική μας υπόθεση, μελετήσαμε τις αλλαγές στα προφίλ έκφρασης κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου μυός ενός αριθμού ζευγαριών lncRNAs και γειτονικών γονιδίων για μεταγραφικούς παράγοντες με real time-qPCR. Από αυτήν τη μελέτη, προέκυψαν ενδιαφέροντα τέτοια ζεύγη, τα οποία αναλύσαμε περαιτέρω με in situ υβριδισμούς σε ιστούς διάφορων αναπτυξιακών σταδίων εμβρυικού εγκεφάλου μυός και κατόπιν υπερέκφρασης των εν λόγω lncRNAs στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος Ν2Α. Αυτά τα πειράματα, έδωσαν αρκετές πληροφορίες, ώστε αρχικά να εστιάσουμε το ενδιαφέρον μας στο lncRNA TCONS_00034309, που ονομάστηκε από εμάς ως Lacuna. Επομένως, συνεχίσαμε με ex vivo μελέτες υπερέκφρασης και αποσιώπησης του Lacuna σε νευρικά βλαστικά κύτταρα, ώστε να μελετήσουμε το λειτουργικό ρόλο του στη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων και τη σχέση του με το μεταγραφικό παράγοντα Tbr2 ή Eomes, έναν κρίσιμο ρυθμιστή της νευρογένεσης και συγκεκριμένα της μετάβασης από ενδιάμεσο προγονικό κύτταρο σε μετα-μιτωτικό νευρώνα. Πιο συγκεκριμένα, το γονίδιο που κωδικοποιεί για το Lacuna βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9, μόνο περίπου 1kb μακριά από το γονίδιο που κωδικοποιεί για το μεταγραφικό παράγοντα Tbr2 / Eomes. Το μετάγραφο αποτελείται από 3 εξώνια και έχει συνολικό μήκος 1661 νουκλεοτιδίων, όπως επιβεβαιώνεται από τη στρατηγική χαρτογράφησης που ακολουθήσαμε. Το Lacuna εκφράζεται διαφορικά στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο μυός με υψηλότερη έκφραση κατά τη διάρκεια των εμβρυϊκών ημερών Ε15 και Ε16. Οι in situ υβριδισμοί που πραγματοποιήσαμε για το Lacuna σε ιστούς εμβρυικού εγκεφάλου μυός έδειξαν ειδική έκφραση στην κοιλιακή στιβάδα και στη φλοιική πλάκα του αναπτυσσόμενου φλοιού εγκεφάλου μυός. Η υποκυτταρική κλασμάτωση των νευρικών βλαστικών κυττάρων και η επακόλουθη real time-qPCR αποκάλυψαν ότι το Lacuna βρίσκεται τόσο στο κυτοσόλιο όσο και στον πυρήνα, υποδηλώνοντας την πιθανότητα να λειτουργεί τόσο in cis όσο και in trans. Για να αποσαφηνίσουμε περαιτέρω το λειτουργικό ρόλο του Lacuna, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα καλλιέργειας για πρωτογενή νευρικά βλαστικά / προγονικά κύτταρα, όπου τα προγονικά / βλαστικά κύτταρα απομονώνονται από φλοιούς εμβρυικών εγκεφάλων μυός κατά την εμβρυική ημέρα Ε14.5 και στη συνέχεια, καλλιεργούνται κατάλληλα για να σχηματίσουν νευροσφαίρες. Παρουσία αυξητικών παραγόντων, τα νευρικά βλαστικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται, ενώ απουσία αυξητικών παραγόντων, διαφοροποιούνται σε νευρώνες και αστροκύτταρα. Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα καλλιέργειας και μετά από υπερέκφραση του lncRNA Lacuna και ανοσοφθορισμούς, είδαμε ότι η νευρογένεση μειώνεται σημαντικά (δείκτες β-III τουμπουλίνη και NeuN) και ο πληθυσμός Olig2+ αυξάνεται στα κύτταρα που υπερεκφράζουν το Lacuna σε σύγκριση με τις καλλιέργειες ελέγχου. Από την άλλη πλευρά, η αστρογλοιογένεση δεν φαίνεται να επηρεάζεται, καθώς και ο πολλαπλασιασμός (δείκτης BrdU +) και η απόπτωση (δείκτης διασπασμένης κασπάσης 3), αλλά η νεστίνη, ένας δείκτης της πολυδυναμίας των νευρικών βλαστικών κυττάρων, αυξάνεται. Επιπλέον, ο πληθυσμός των κυττάρων που είναι TBR2 / EOMES + και η γονιδιακή έκφραση του παράγοντα Tbr2 / Eomes δεν επηρεάζονται από την υπερέκφραση του Lacuna, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επίδραση του Lacuna στις διαδικασίες της νευρογένεσης είναι ανεξάρτητη από το Tbr2 και υπαινίσσεται μια πιθανή in trans δράση του lncRNA Lacuna. Για να διαλευκάνουμε περαιτέρω το ρόλο του Lacuna στη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων, πραγματοποιήσαμε πειράματα αποσιώπησης του Lacuna στο ίδιο σύστημα καλλιέργειας, χρησιμοποιώντας ένα CRISPR-dCas9-KRAB Effector Σύστημα για την καταστολή της μεταγραφής του Lacuna. Αυτό το σύστημα είναι πολύ αποτελεσματικό στην αποσιώπηση γονιδίων που κωδικοποιούν για lncRNAs και επιλύει το ζήτημα αν τα παρατηρούμενα φαινόμενα αυτών των αποσιωπήσεων είναι αποτέλεσμα της απουσίας του lncRNA μορίου ή του αντίστοιχου DNA. Ο μηχανισμός δράσης αυτού του συστήματος δεν επηρεάζει καθόλου την DNA αλληλουχία. Η dCas9 μαζί με το μεταγραφικό καταστολέα KRAB οδηγούνται στο γονίδιο επιλογής από ειδικά σχεδιασμένα gRNA μόρια και έτσι επιτυγχάνεται η καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου επιλογής. Αφού επιβεβαιώσαμε την αποτελεσματικότητα της τεχνικής (το Lacuna καταστέλλεται σημαντικά), επαληθεύσαμε επίσης ότι το σύστημα δεν επηρεάζει γενικά το γενετικό τόπο (τα γειτονικά γονίδια Golga4 και Gm33460 δεν επηρεάζονται). Αντιθέτως, η αποσιώπηση του Lacuna σε νευρικά βλαστικά κύτταρα παρουσία αυξητικών παραγόντων οδηγεί σε δραματική μείωση της έκφρασης του γονιδίου Tbr2 / Eomes, γεγονός που υποδηλώνει ότι το Lacuna είναι απαραίτητο για την έκφραση του Tbr2 / Eomes σε νευρικά βλαστικά κύτταρα. Επιπλέον, απουσία αυξητικών παραγόντων, η αποσιώπηση του Lacuna προάγει σημαντικά τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων σε μετα-μιτωτικούς νευρώνες (δείκτης β-III τουμπουλίνης και δείκτης NeuN) και σε αστροκύτταρα (δείκτης GFAP), ενώ ο πληθυσμός των προγονικών κυττάρων που είναι Olig2 + και ο πληθυσμός των βλαστικών κυττάρων που είναι νεστίνη+ μειώνονται. Σε αυτές τις συνθήκες, όπου τα νευρικά βλαστικά κύτταρα έχουν καλλιεργηθεί απουσία αυξητικών παραγόντων, ο μεταγραφικός παράγοντας Tbr2 / Eomes δεν εκφράζεται, καθώς τα περισσότερα από τα κύτταρα έχουν ήδη επιλέξει κυτταρική μοίρα ή απλούστερα, έχουν ξεκινήσει τη διαφοροποίησή τους, υποδηλώνοντας ότι το Lacuna έχει μια δράση in trans που αναστέλλει τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Ένα άλλο lncRNA που προσέλκυσε την προσοχή μας είναι το Lockd, ένα lncRNA που έχει ήδη μελετηθεί σε μια κυτταρική σειρά ερυθροκυττάρων. Το Lockd είναι ένα lncRNA αποτελούμενο από 434 νουκλεοτίδια και βρίσκεται περίπου 4 kb μακριά από το γονίδιο Cdkn1b. Το γονίδιο Cdkn1b κωδικοποιεί για το p27, έναν καλά μελετημένο κυκλίνο – εξαρτώμενο αναστολέα κινάσης. Το p27 έχει μελετηθεί εκτενώς στο νευρικό σύστημα και έχει καθιερωθεί ως σημαντικός παράγοντας στην προώθηση της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο, στη νευρωνική διαφοροποίηση και στη μετανάστευση των νευρικών κυττάρων. Είναι πολύ ενδιαφέρον ότι τόσο το Lockd όσο και το p27 εκφράζονται διαφορικά κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου του μυός, αλλά τα προφίλ έκφρασής τους είναι ουσιαστικά αντίθετα. Λόγω της εγγύτητας των γενετικών τόπων του Lockd και του p27 και λόγω της συμμετοχής του p27 στη διαδικασία για την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο, αρχικά χρησιμοποιήσαμε N2A κύτταρα, μια ταχέως αναπτυσσόμενη κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος μυός για να μελετήσουμε το Lockd και την πιθανή του σχέση με το p27. Πράγματι, κατά την υπερέκφραση του lncRNA Lockd στην κυτταρική σειρά Ν2Α, ο πολλαπλασιασμός αυξάνεται σημαντικά σε σχέση με τις συνθήκες ελέγχου. Επιπλέον, υπό τις ίδιες συνθήκες, η έκφραση του p27 καταστέλλεται σημαντικά, προτείνοντας ότι το Lockd καταστέλλει την έκφραση του p27, το οποίο με τη σειρά του οδηγεί σε αυξημένο πολλαπλασιασμό, καθώς το p27 προάγει φυσιολογικά την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο. Καθώς ο πολλαπλασιασμός είναι μια εξαιρετικά κρίσιμη διαδικασία για τα νευρικά βλαστικά κύτταρα κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου, εξετάσαμε επίσης την έκφραση του Lockd σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων. Όντως, το Lockd εκφράζεται σε καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων, αλλά το πιο ενδιαφέρον στοιχείο είναι ότι η γονιδιακή του έκφραση μειώνεται σημαντικά σε συνθήκες καλλιέργειας χωρίς αυξητικούς παράγοντες σε σύγκριση με την καλλιέργεια παρουσία αυξητικών παραγόντων. Επιπλέον, κατά την υπερέκφραση του Lockd που πραγματοποιήσαμε σε νευρικά βλαστικά κύτταρα, ο πολλαπλασιασμός αυξάνεται και η έκφραση του p27 καταστέλλεται, όπως παρατηρήσαμε στα πειράματα με την κυτταρική σειρά Ν2Α. Αυτά τα πρώτα ευρήματα αποκαλύπτουν μια συναρπαστική σχέση του Lockd με το p27, αλλά και ένα σημαντικό ρόλο αυτού του lncRNA στον πολλαπλασιασμό των Ν2Α κυττάρων και των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Εν κατακλείδι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα lncRNAs είναι νέοι βασικοί παράγοντες στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εγκεφάλου και παρέχουμε τουλάχιστον δύο τέτοια παραδείγματα. Το Lacuna, ένα νέο lncRNA, είναι απαραίτητο για την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Tbr2 / Eomes και αναστέλλει τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων και το Lockd, ένα ήδη μελετημένο lncRNA σε άλλο σύστημα, επηρεάζει αρνητικά την έκφραση του p27 και προάγει τον πολλαπλασιασμό. Η μελέτη μας παρέχει πληροφορίες για τη συμμετοχή των lncRNAs στην οργανογένεση του κεντρικού νευρικού συστήματος και δείχνει ότι τα lncRNAs μαζί με τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες σχηματίζουν ρυθμιστικά δίκτυα με σημαντικές λειτουργίες στα νευρικά βλαστικά κύτταρα και στην ανάπτυξη του εγκεφάλου.With the advent of new generation sequencing technologies, a growing list of formerly unknown regulatory RNA species have come into spotlight. Among them, long non-coding RNAs (lncRNAs) have been found to control stem cell pluripotency, carcinogenesis, development and function of several tissues and organs. Although thousands of lncRNAs are expressed in adult mammalian brain in a highly patterned and specific manner, they remain poorly characterized and their roles in brain development have not yet been studied. To tackle this question, we initially performed RNA-Seq analysis in the developing nervous system of mouse embryo at embryonic day E12.5. Based on this analysis, we identified many lncRNAs highly expressed in neural cells. We focused on lncRNAs, which are transcribed from genomic loci in close proximity with protein coding genes, encoding for critical transcription factors (TFs) in brain development. We hypothesized that these lncRNAs may be implicated in the regulation of neighboring TF genes. To this end, we characterized the changes in the expression profiles of a number of lncRNAs-TF pairs during development of mouse brain with real time-qPCR and in situ hybridizations. In this study, we focused firstly on the functional role of lncRNA TCONS_00034309, named by us as Lacuna, in the differentiation of neural stem cells and its relation to Tbr2 transcription factor, a critical regulator of neurogenesis, by ex vivo overexpression and knockdown studies. More specifically, Lacuna gene is on chromosome 9, around 1kb away from Tbr2/Eomes gene. Its transcript consists of 3 exons and a total length of 1661 nt, as confirmed by our mapping strategy. Lacuna is differentially expressed in the developing mouse brain with higher expression during embryonic days E15 and E16. In situ hybridizations showed specific expression in the ventricular zone and cortical plate of the developing mouse cortex. Subcellular fractionation of neural stem cells and subsequent real time-qPCR revealed that Lacuna is found both in the cytosol and the nucleus, suggesting the possibility that it functions both in cis (affecting the neighboring gene) and in trans (affecting distal gene/genes or being involved in cytoplasmic processes). To further clarify the functional role of Lacuna, we used a culture system for primary neural stem/progenitor cells, where progenitor/stem cells are isolated from mouse embryonic cortices of E14.5 and then, cultured appropriately to form neurospheres. In the presence of growth factors, neural stem cells (NSCs) are proliferating, whereas in the absence of growth factors, NSCs are differentiating into neurons and astrocytes. Using this culture system and upon overexpression of Lacuna, neurogenesis is significantly reduced (b-III tubulin and NeuN markers) and Olig2+ population is increased. On the other hand, astrogliogenesis doesn’t seem affected, as well as proliferation (BrdU+ index) and apoptosis (cleaved caspase 3+ index), but Nestin, a marker of neural cell stemness, is increased. Moreover, TBR2/EOMES+ population and Tbr2/Eomes expression are not affected by Lacuna overexpression, indicating that the effect on neurogenetic events is Tbr2 independent and suggesting a possible in trans action of Lacuna lncRNA. In order to further elucidate this, we performed knock-down experiments in the same culture system, using a CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to repress the transcription of Lacuna. After confirming the effectiveness of the technique (Lacuna is significantly repressed), we also confirmed that the system does not affect the locus in general (the neighboring genes Golga4 and Gm33460 are unaffected). Of note, knockdown of Lacuna in NSCs in the presence of growth factors results in dramatic downregulation of Tbr2/Eomes gene, suggesting that Lacuna is necessary for Tbr2 expression in NSCs. Furthermore, in the absence of growth factors, Lacuna knockdown significantly promotes the differentiation of NSCs into both neurons (b-III tubulin+ index and NeuN+ index) and astrocytes (GFAP+ index), whereas the Olig2+ progenitor population and the Nestin+ cells are decreased. In this setup, Tbr2 is not expressed, as most of the cells have already been committed to a cell fate, suggesting that Lacuna has an in trans, differentiation-inhibiting action in NSCs. Another lncRNA that drew our attention is Lockd, a lncRNA that was already studied in an erythroid cell line. Lockd is a 434 nt lncRNA located 4 kb away from Cdkn1b gene. Cdkn1b encodes for p27, a well studied cyclin-dependent kinase inhibitor. p27 is extensively studied in the nervous system, with established roles in promoting cell cycle exit, neuronal differentiation and migration. Intriguingly, both Lockd and p27 are differentially expressed during mouse brain development, but their expression profiles are opposite. Due to the proximity of Lockd and p27 loci and the involvement of p27 in cell cycle exit events, we first used N2A cells, a fast-growing mouse neuroblastoma cell line, to study Lockd and its relation to p27. Indeed, upon overexpression of Lockd lncRNA in N2A cells, proliferation is significantly increased. Furthermore, under the same conditions, p27 expression is repressed, proposing that Lockd inhibits expression of p27, which in turn results in increased proliferation, as p27 physiologically promotes cell cycle exiting. As proliferation is a crucial process in brain development and neural stem cells, we also examined Lockd expression in NSCs cultures. In fact, Lockd is expressed in NSC cultures, but more interestingly, it is significantly downregulated in minus growth factors conditions in comparison to plus growth factors conditions. Additionally, upon overexpression of Lockd in NSCs, proliferation is increased and p27 expression is repressed, as in N2A cells. These primary findings reveal an exciting relation of Lockd with p27, but also an important role of this lncRNA in the proliferation of N2A cells and neural stem cells. To conclude, our data suggest that lncRNAs are new key players in differentiation and proliferation during brain development and we provided at least two such examples. Lacuna, a novel lncRNA, is necessary for Tbr2 expression and inhibits differentiation of NSCs and Lockd, an already studied lncRNA in another system, affects negatively p27 expression and promotes proliferation. Our study provides insights into the involvement of lncRNAs in organogenesis of the CNS and shows that lncRNAs and protein-coding genes form regulatory networks with important functions in neural stem cells and brain development

Decoding the role of the lncRNA HOTAIRM1 in human motor neurons

The mammalian genome produces thousands of long non-coding RNAs (lncRNAs), which have been demonstrated to be fundamental in the control of many biological processes. These molecules play a crucial role in the multilayered regulation of physiological and disease-related gene expression programs, having significant implications in shaping central nervous system (CNS) complexity. Neuronal differentiation is a timely and spatially regulated process, relying on precisely orchestrated gene expression control. The coordinated activity of transcription factors and non-coding RNAs (ncRNAs), organized in intricate regulatory networks, drives cell fate specification ensuring correct and specific neuronal functions. We previously described,1 at both the molecular and functional level, the lncRNA nHOTAIRM1 as a neuronal-enriched transcript, which is upregulated during in vitro neuronal differentiation and highly expressed in post-mitotic motor neurons (MNs). We demonstrated that the nuclear nHOTAIRM1, even if much less abundant than its cytoplasmic counterpart, it is involved in the achievement of correct neuronal differentiation timing as an epigenetic regulator of NEUROG2 expression.1 Remarkably, among all human brain tissues, nHOTAIRM1 is specifically expressed in the spinal cord. Consistently, we found that nHOTAIRM1 accumulates in MN-enriched ventral spinal cord lineages differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs).1 All this evidence prompted us to further investigate the role of the highly expressed nHOTAIRM1 specifically on MN generation and/or function, to ultimately determine whether its deregulation affects MN differentiation and activity. To experimentally address these questions, here we applied a genome editing-based loss-of-function approach to a model system that efficiently recapitulates spinal MN differentiation, and we identified key nHOTAIRM1 target genes implicated in MN maturation, morphology and activity. Our findings allowed us to conclude that nHOTAIRM1 directs multiple crucial aspects of MN physiology, from their development to the acquisition of appropriate morphological features and motor function