Cerebrovascular endothelial cells form transient Notch‐dependent cystic structures in zebrafish

We identify a novel endothelial membrane behaviour in transgenic zebrafish. Cerebral blood vessels extrude large transient spherical structures that persist for an average of 23 min before regressing into the parent vessel. We term these structures “kugeln”, after the German for sphere. Kugeln are only observed arising from the cerebral vessels and are present as late as 28 days post fertilization. Kugeln do not communicate with the vessel lumen and can form in the absence of blood flow. They contain little or no cytoplasm, but the majority are highly positive for nitric oxide reactivity. Kugeln do not interact with brain lymphatic endothelial cells (BLECs) and can form in their absence, nor do they perform a scavenging role or interact with macrophages. Inhibition of actin polymerization, Myosin II, or Notch signalling reduces kugel formation, while inhibition of VEGF or Wnt dysregulation (either inhibition or activation) increases kugel formation. Kugeln represent a novel Notch‐dependent NO‐containing endothelial organelle restricted to the cerebral vessels, of currently unknown function

Enhancement and Segmentation Workflow for the Developing Zebrafish Vasculature †

Zebrafish have become an established in vivo vertebrate model to study cardiovascular development and disease. However, most published studies of the zebrafish vascular architecture rely on subjective visual assessment, rather than objective quantification. In this paper, we used state-of-the-art light sheet fluorescence microscopy to visualize the vasculature in transgenic fluorescent reporter zebrafish. Analysis of image quality, vascular enhancement methods, and segmentation approaches were performed in the framework of the open-source software Fiji to allow dissemination and reproducibility. Here, we build on a previously developed image processing pipeline; evaluate its applicability to a wider range of data; apply and evaluate an alternative vascular enhancement method; and, finally, suggest a work-flow for successful segmentation of the embryonic zebrafish vasculature

Structure-function properties of the gastrodigestive and hepatic systems of zebrafish (Danio rerio)

While they lack mammal-specific organs, zebrafish provide a high degree of resemblance in their genetic profile, molecular mechanisms and organ physiology to humans and have been established as an excellent complementary platform to rodents. However, their use in gastroenterology and hepatology is under-utilised, conceivably due to a lack of digestive system ultrastructural details as most anatomical studies were performed by light and fluorescence imaging. This thesis provides detailed insights into the structure and function of the zebrafish digestive system, particularly the liver. Multimodal bio-imaging approaches were developed in order to investigate the hepatic ultrastructure and function. Using a protocol that renders samples compatible with multiple imaging platforms, we produce a detailed map of the zebrafish gastrodigestive system from organ to subcellular levels. Findings were compared with the rodent/human counterparts and while some differences exist between the zebrafish and the rodent/human hepatic parenchymal cells and biliary system organisations, many similarities, at the sub/cellular levels, were also demonstrated. Using advances in genetics and a protocol that retains endogenous fluorescence within zebrafish at the same time as ultrastructure for electron microscopy, we further investigated key hepatic functional properties (e.g. macromolecular transport routes) by performing albumin injections and studying the liver macrophages. While we demonstrated similarities in the albumin uptake pathway and in the morphology of liver macrophages in zebrafish, we reveal that zebrafish liver macrophages lack of phagocytic function (a key aspect in rodents and human), which may limit their use in hepatic-immune diseases studies. Altogether, our studies provide new insights and novel protocols for the analysis of the zebrafish liver and lay a foundation to further evaluate uptake routes for gastro-digestive research and drug delivery in various diseases

Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays

The formation of new blood vessels, or angiogenesis, is a complex process that plays important roles in growth and development, tissue and organ regeneration, as well as numerous pathological conditions. Angiogenesis undergoes multiple discrete steps that can be individually evaluated and quantified by a large number of bioassays. These independent assessments hold advantages but also have limitations. This article describes in vivo, ex vivo, and in vitro bioassays that are available for the evaluation of angiogenesis and highlights critical aspects that are relevant for their execution and proper interpretation. As such, this collaborative work is the first edition of consensus guidelines on angiogenesis bioassays to serve for current and future reference

LDL favours metastatic spread of triple negative breast cancer

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2019O cancro da mama é o mais frequente entre mulheres em todo o mundo e é responsável pela maioria da mortalidade associada a cancro, no sexo feminino. As metástases são a principal causa de mortalidade, representando até 90% das mortes por cancro da mama. O cancro da mama metastático tem mau prognóstico, embora haja diferenças significativas consoante o subtipo considerado. O cancro da mama triplo negativo metastático tem um tempo médio de sobrevida extraordinariamente inferior aos restantes, devido à ausência de receptores moleculares e terapêuticas dirigidas, à heterogeneidade molecular e à tendência para metastizar ou recidivar. A metastização ocorre segundo a cascata de invasão-metástase, que tem várias etapas: invasão local, intravasão, sobrevivência em circulação, extravasão, sobrevivência no microambiente secundário e proliferação para formar metástases. É imperativo compreender os mecanismos alterados na base da metastização do cancro de mama triplo negativo, isolar potenciais alvos terapêuticos e marcadores de prognóstico. O LDL é uma lipoproteína de baixa densidade que transporta triglicéridos e colesterol esterificado do fígado para os tecidos periféricos. Níveis plasmáticos elevados de LDL estão associados a menor tempo livre de doença e maior progressão tumoral, em cancro de mama. A molécula de LDL tem impacto em várias etapas da cascata invasão-metástase. Destaca-se a promoção da perda de adesão à matriz, o aumento da invasão e migração, a estimulação de mecanismos que facilitam a intravasão e extravasão, bem como o aumento do número e tamanho de metástases pulmonares, em ratos hipercolesterolémicos, e nódulos linfáticos metastáticos, em pacientes com níveis plasmáticos de LDL aumentados. Nos carcinomas, a transição epitélio-mesenquimatosa está associada a facilidade em progredir na cascata metastática e o LDL induz a expressão de factores de transcrição que promovem este processo. O metabolismo lipídico, em particular, altera-se substancialmente em tumores em progressão, como o triplo negativo. As células de cancro de mama triplo negativo têm alterações a vários níveis de regulação lipídica, aumentando o uptake de lípidos, facilitando o transporte intracelular de ácidos gordos e a activação necessária para armazenar lípidos em lipid droplets ou encaminhá-los para membranas lipídicas e para a oxidação de ácidos gordos. Além disso, apesar de serem globalmente mais glicolíticas, subsets de células triplo negativo têm demonstrado ser capazes de recorrer à utilização de oxidação de ácidos gordos e têm vários genes associados a esta via alterados. A elevada quantidade de energia providenciada por esta oxidação é vantajosa para a sobrevivência em ambientes com nutrientes mais limitados, como em perda de adesão. De facto, a desregulação de alguns destes genes está associada a progressão metastática e a pior prognóstico em cancro triplo negativo. O microambiente tumoral no cancro da mama promove a progressão tumoral, contribuindo para a inflamação tumoral crónica (particularmente no caso da obesidade e dislipidemia), participa em permuta de metabolitos e fornece lípidos, que são transferidos para as células cancerígenas. São conhecidas várias alterações mitocondriais, em células invasivas e metastáticas de cancro da mama, como a expressão e activação de proteínas associadas a fissão e biogénese mitocondrial. Como consequência, estas células têm uma rede mitocondrial com maior massa, mais fragmentada, e as mitocôndrias são transportadas para regiões distantes do núcleo, incluindo protusões citoplasmáticas, onde promovem a migração. Em circulação, estas células têm menor acesso a nutrientes, menor necessidade de captar substratos para metabolismo anabólico e maior necessidade energética, portanto o metabolismo energético é mais dependente da respiração mitocondrial e os genes associados à glicólise são sub-expressos. Apesar de evidência recente sugerir que a exposição a LDL induz a agressividade de células TNBC ao modular a morfologia mitocondrial e o metabolismo, o mecanismo exacto destas alterações e as implicações para a progressão do cancro da mama, permanecem desconhecidos. Nesta dissertação, propusemo-nos estudar 1) se células de cancro da mama triplo-negativo após exposição a LDL têm um comportamento mais agressivo num organismo vivo, 2) se há invasão diferencial em órgãos secundários e 3) se as adaptações mitocondriais estariam correlacionadas com comportamento invasivo e tropismo diferencial. Para abordar estas questões, a linha celular humana de cancro da mama triplo negativo MDA-MB-231 foi cultivada em meio suplementado com LDL ou meio de crescimento normal. As células foram transfectadas com o marcador de mitocôndrias Mito-YFP, marcadas com DiI (MDA-MB-231controlo) ou com Cy5 (MDA-MB-231LDL), e xenotransplantadas em zebrafish com 2 dias pós-fertilização. Aos 4 dias pós-injecção(6 dias pós-fertilização)a capacidade de células MDA-MB-231LDL e MDA-MB-231controlmigrarem para locais distantes em zebrafish foi analisada usando um microscópio widefield. De acordo com nossos resultados, células MDA-MB-231LDL têm migração diferencial estatisticamente significativa em geral (Qui-quadrado p=0.0347) e particularmente para locais distantes, como barbata dorsal (teste de Fisher, p=0.042), músculo dorsal (p=0.05), notocorda (p=0.023) e barbatana anal (p=0.008). Contudo, como o sistema wide field apresenta algumas limitações, quantificámos a capacidade de invasão e colonização de células TNBC em zebrafish com um sistema confocal spinning disk. Analogamente à análise anterior, os resultados revelaram uma tendência para migração diferencial em geral das células MDA-MB-231LDL (Qui-quadrado, p=0.06, n=11). Estes resultados mostram ainda que células 1) MDA-MB-231LDL são capazes de migrar para todos os órgãos analisados, ao contrário das MDA-MB-231control; 2) órgãos mais vascularizados foram invadidos por células de ambas as condições, com as células MDA-MB-231controla infiltrarem mais frequentemente zonas muito vascularizadas, especialmente CHT (teste de Fisher, p=0,02); 3) órgãos menos vascularizados foram invadidos preferencialmente pelas células MDA-MB-231LDL. Entre estes, determinados órgãos são vascularizados apenas por uma artéria (olho, teste de Fisher, p=0,0075) ou eram justamente ventrais relativamente a CHT (barbatana anal) e foram invadidos pelo controle MDA-MB-231; mas outros (notocorda, barbatana ventral, barbatana dorsal, barbatana caudal) não têm vasos nos estudos angiográficos e nas nossas larvas Tg (fli1: efe) a 6dpf e foram exclusivamente infiltrados por células MDA-MB-231LDL. Estes resultados sugerem que as células de ambas as condições são capazes de realizar os três primeiros passos da cascata invasão-metástase (invasão, intravasão, sobrevivência em circulação) mas a exposição a LDL acelera uma ou mais etapas da cascata metastática, facilitando a migração para áreas periféricas e não vascularizadas. Interrogámo-nos porque é que as células MDA-MB-231LDLtêm propriedades migratórias aceleradas, mais invasivas ou menos dependentes da vascularização. Para compreender o panorama geral de migrações contámos as massas tumorais (clusters > 20 células) e as células disseminadas dentro do zebrafish, excluindo células em massas tumorais. Encontrámos uma maior proporção de células MDA-MB-231LDLque células controlo no intestino (qui-quadrado, p 20 células) foram detectadas dentro dos órgãos previamente analisados e quantificadas. Os resultados mostram que MDA-MB-231LDL foram capazes de crescer oito massas celulares tumorais e MDA-MB-231 control foram capazes de crescer sete. De entre estes, contabilizaram-se cinco massas de células tumorais distantes para ambas as condições. Não houve diferença no número de massas distantes ou diferença relevante no número de massas globais. Como a massa mitocondrial, a biogénese e a dinâmica foram previamente implicadas na aquisição de maior capacidade migratória, decidimos estudar o impacto do LDL na distribuição da rede mitocondrial, usando o sinal de Mito-YFP como marcação mitocondrial e recorrendo a microscopia confocal point scanning. A análise qualitativa de distribuição de rede mitocondrial mostrou que 54.7% das células MDA-MB-231LDL adquirem uma distribuição filamentosa diferindo das células MDA-MB-231 control que maioritariamente têm uma distribuição perinuclear (Fisher Test, p=0.0429) Esta diferença advém das células MDA-MB-231LDL que migraram (intestine, cérebro, swim bladder), é estatisticamente significativa no cérebro (p=0.0152), que revelou aumentou de tropismo e maior número de células MDA-MB-231LDL. De acordo com a literatura, o transporte de mitocôndrias para a periferia do citoplasma é uma das alterações das células transformadas que confere propriedades invasivas e migratórias. Os resultados mostram que o LDL promove a aquisição de uma rede filamentosa, que é compatível com maior distribuição de mitocôndrias às periferias incluindo protusões citoplasmáticas. Para estudar quantitativamente a rede mitocondrial, as imagens obtidas com o sistema confocal point scanning foram convertidas em projecções de máxima intensidade e os canais de Mito-YFP e DiI ou Cy5 foram processados como imagens binárias. Quantificámos o número de partículas Mito-YFP, que representa a massa mitocondrial. Os resultados mostram um aumento generalizado do número de partículas Mito-YFP nas células MDA-MB-231 expostas a LDL em relação às controlo (Student T-test, p<0.0001), que foi estatisticamente significativo no PVS (p=0.0304), intestino (p=0.0022)e cérebro (p=0.0456), podendo assim concluir que a exposição a LDL induz um aumento de massa mitocondrial. Também quantificámos a área média de Mito-YFP por célula, uma medida de área de distribuição de rede mitocondrial na célula, que mostra um tendência para estar aumentada em células MDA-MB-231LDL (Student T-test, p=0.0723), atingindo significância estatística no cérebro (p=0.0237) e na swim bladder(p=0.0283), o que sugere que a exposição a LDL promove o aumento da área de distribuição da rede mitocondrial. Por fim, quantificámos a área de Mito-YFP por partícula, que é uma medida indirecta do tamanho de cada mitocôndria. Os nossos resultados mostraram uma tendência para redução de área de Mito-YFP por partícula que apenas alcançou significância estatística no intestino (Student T-test, p=0.0237). Estes resultados sugerem que globalmente, o LDL parece induzir um aumento do número de mitocôndrias, embora com menor tamanho e uma maior área de distribuição da rede mitocondrial na célula. A literatura sugere que células tumorais em migração apresentam aumento de biogénese mitocondrial e fissão da rede e a exposição a LDL parece aumentar este fenótipo. O transporte de mitocôndrias para as protusões citoplasmáticas também aumenta as capacidades invasivas e migratórias. Curiosamente, a exposição a LDL aumentou da área de distribuição mitocondrial, o que se pode reflectir uma maior distribuição de mitocôndrias à periferia contribuindo para as características migratórias e invasivas das células MDA-MB-231.Em suma, as células de cancro de mama triplo negativo estimuladas com LDL têm aumento de propriedades invasivas emigratórias em zebrafish xenotransplantados, que parecem estar associadas a transformações nas próprias células cancerígenas, que as terão dotado de maior capacidade de extravasão e sobrevivência à distância. O LDL induziu adaptações mitocondriais, nomeadamente disposição de rede filamentosa, aumento da massa mitocondrial, mas menor massa por mitocôndria. Estas transformações mitocondriais parecem ser um dos mecanismos pelos quais o LDL induz aumento de invasão, migração ou sobrevivência à distância nas células MDA-MB-231. Estudos futuros são necessários para confirmar estas hipóteses, nomeadamente o uso de larvas Tg (fli1:eGFP) xenotransplantadas separadamente com células MDA-MB-231LDL ou MDA-MB-231 control com término da experiência a time-points posteriores (como 6 dpf) para avaliar o desenvolvimento de massas tumorais mais consideráveis, o tropismo, sobrevivência celular, rede mitocondrial e interacção das células com o endotélio. Ensaios que quantifiquem a utilização de oxidação de ácidos gordos pelas células TNBC e que clarifiquem a relação das mitocôndrias com as protusões citoplasmáticas irão também ajudar a esclarecer o papel do metabolismo lipídico na agressividade das células TNBC. Elucidar estas questões será determinante para identificar alvos terapêuticos eficazes em cancro TNBC metastático, a fim de melhorar o outcome destas doentes.Background: Breast cancer (BC) is the leading cause of cancer related death in women worldwide and metastasis account for the majority of mortality. Particularly, triple negative breast cancer (TNBC) has remarkably poor prognosis when metastasis develop. Dyslipidemia and mitochondrial adaptations have been implicated in metastatic progression. In this study, we explore the role of LDL and mitochondria in TNBC invasion-metastasis cascade, aiming at identifying new targets and prognostic markers that impact clinical management. Methods: MDA-MB-231 human TNBC cell line was cultured in normal growth medium or supplemented with LDL. DiI-labelled-MDA-MB-231 (control) or Cy5-labelled-MBA-231 (LDL) cells transfected with Mito-YFP were xenotransplanted into the perivitelline sac of 2 days-postfertilization (pdf) zebrafish larvae. After injection, larvae at 1, 4, 5 days pos-injection (dpi) were fixed, stained for GFP and mounted. Tropism was studied using widefield and spinning disk confocal acquisitions. Mitochondrial network quantification was analysed with point scanning confocal images. Fisher Test, and chi-square, chi-square only and student T-test were applied for statistical analysis and p-values<0.05 were considered statistically significant. Results: MDA-MB-231LDL cells showed differential invasion potential (widefield analysis, Chi-square, p=0.0347, n=25 larvae; spinning disk analysis, Chi-square p=0.06, n=11 larvae), with cells disseminating to all organs in both analyses, contrary to MDA-MB-231control cells. MDA-MB-231LDL cells diverged from control and migrated more to less vascularised organs as well as exclusively infiltrated organs where no vessels are found at 6dpf. Mitochondrial network of disseminated MDA-MB-231LDL cells had increased filamentous distribution across the cells, displaying more but smaller Mito-YFP particles, which according to literature is associated with migration and invasion. Conclusions: Our results show that LDL exposure promotes invasion and survival of TNBC cells at distant sites and induce mitochondrial adaptations, i.e., increased mass, along with widespread of network across the cell, a metabolic feature with potential therapeutic application for metastatic TNBC