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Population analysis of Hyla arborea and Hyla meridionalis (Amphibia, Anura) in Portugal:a molecular genetic and bioacoustic approach
Tese de doutoramento, Biologia (Biodiversidade), Universidade de Lisboa, Faculdade de CiĂȘncias, 2013The focus of this work is on the species of Hylids (Amphibia, Anura) present in Portugal, Hyla meridionalis and Hyla arborea (=H. molleri), to examine the geographic patterns of genetic and mating calls diversity. The aim is to determine the patterns of variation of genetic and bioacoustic markers between populations, exploring how the current distribution patterns were influenced by the origins, colonization events of both species, and finally their evolutive history. For comparison and biogeographically integrative reasons, information from outside Portugal is used. The genetic and bioacoustic analyses revealed different diversity patterns among the studied populations of both species. Iberian H. arborea is highly divergent from European taxon, supporting the ressurection of H. molleri species. Within Iberia two distinct groups, âNorthâ and âSouthâ, were identified, having the southern one higher haplotype diversity, a pattern seen in other Iberian amphibians. A different pattern was however seen at the bioacoustic level. Populations did not cluster into groups, and no significant differences were found between populations. In H. meridionalis COI analysis corroborated previous results, with three well differentiated clades identified, all with little genetic diversity within groups. Tunisia and Algeria specimens were highly divergent from all other, suggesting an ancient split between the two lineages. Advertisement calls showed little diversity between populations. In syntopy, the presence of males of the other species calling apparently has little effect on advertisement calls: only frequencies and call duration of H. meridionalis were significantly smaller in sympatry. Being unlikely the hypothesis of reproductive character displacement of mating calls. This, together with the absence of F1 hybrids in the studied sites (although earlier studies have reported their presence) and of any sign of introgression in adults and tadpoles, suggests a rare occurrence of heterospecific mating, and that advertisement calls are an effective premating barrier.As relas do gĂ©nero Hyla da Europa e do Norte de Ăfrica pentencentes Ă famĂlia Hylidae, da ordem dos Anuros, repartem-se por duas espĂ©cies na PenĂnsula IbĂ©rica, a rela-europeia, Hyla arborea e a rela-meridional, H. meridionalis. Durante muito tempo estas duas espĂ©cies, bem como outras do mesmo gĂ©nero que habitam o continente europeu, eram consideradas meras subspĂ©cies de H. arborea. Estudos morfolĂłgicos, genĂ©ticos e bioacĂșsticos foram contudo determinando a atribuição do seu carĂĄcter de espĂ©cie a muitas destas formas. Actualmente sĂŁo 16 reconhecidas espĂ©cies repartidas por dois grandes grupos, H. arborea e H. japonica, correspondentes aos extremos da sua ĂĄrea de distribuição global, uma a ocidente da EurĂĄsia e outro no seu extremo Oriental. Considerada uma espĂ©cie distinta da sua congĂ©nere por critĂ©rios morfolĂłgicos, imunolĂłgicos e bioacĂșsticos (estes Ășltimos salienta-se serviriam de base ao seu reconhecimento original. A H. meridionalis, Ă© peculiarmente o Ășnico HilĂdeo que ocorre em Ăfrica. As chamadas de acasalamento dos machos, comparadas com as da H. arborea, sĂŁo mais longas (aproximadamente cinco vezes para a mesma temperatura ambiental) e mais graves (as suas frequĂȘncias sĂŁo relativamente mais baixas). Estudos genĂ©ticos recentes baseados na anĂĄlise de ADN mitocondrial e nuclear, sugerirem que a H. meridionalis se caracteriza por uma baixa diversidade genĂ©tica patente nas amostras provenientes dos dois clados bem diferenciados: 1) um ocidental que inlcui Marrocos, o Sudoeste da Europa (incluindo a PenĂnsula IbĂ©rica) e as ilhas CanĂĄrias e 2) um oriental que inclui a TunĂsia. As amostras pertencentes Ă TunĂsia formariam um clado altamente divergente das restantes, o que sugere ter havido uma separação bastante antiga destas duas linhagens. A presente distribuição da espĂ©cie teria resultado de dois grandes eventos de dispersĂŁo a partir do Norte de Ăfrica provavelmente recentes (e a introdução, mediada por humanos ou em âjangadasâ naturais arrastadas por correntes, nas Ilhas CanĂĄrias e na Madeira). Um primeiro evento de dispersĂŁo, mais antigo, teria ocorrido com a colonização do Sul da PenĂnsula IbĂ©rica por indĂviduos vindos originalmente do Sul de Marrocos, que teriam migrado primeiro para o Norte de Marrocos e daĂ para a PenĂnsula IbĂ©rica. Num segundo evento, mais recente, como atrĂĄs referimos, alguns elementos provenientes do Norte de Marrocos teriam sido introduzidos na costa mediterrĂąnica de França e daĂ migrado para Norte, Este e Sul, ocupando o Sul de França e o Nordeste de Espanha. As diferenças encontradas entre estes indivĂduos e os do primeiro evento de expansĂŁo (pertencem a dois grupos distintos), podem ser resultado de uma recolonização do Norte de Marrocos, apĂłs a primeira dispersĂŁo para o continente europeu, por uma população com algum grau de diferenciação genĂ©tica em relação aos primeiros. Quanto Ă H. arborea, os seus estudos sĂŁo geralmente mais abrangentes do ponto de vista geogrĂĄfico, uma vez que a distribuição da espĂ©cie se estende desde a Europa Central atĂ© Ă PensĂnsula IbĂ©rica. Recentemente, a descrição da variabilidade genĂ©tica ao nĂvel dos ADN mitocondrial e nuclear, de muitas das suas populaçÔes europeias, demonstrou a existĂȘncia de grupos altamente diferenciados e com uma forte associação com a sua distribuição geogrĂĄfica. Alguns desses grupos correspondem a espĂ©cies actualmente aceites como espĂ©cies distintas de que falĂĄmos, como sĂŁo os casos da H. sarda (endĂ©mica da Sardenha e da CĂłrsega), H. orientalis (presente na Europa do Leste, nomeadamente, UcrĂąnia, RomĂ©nia e Turquia), H. savignyi (MĂ©dio Oriente, incluindo Chipre, Turquia, SĂria, IrĂŁo e Iraque), e da H. intermedia (sul de ItĂĄlia, na PenĂnsula Apenina e na SicĂlia). Um dos resultados concordantes nos vĂĄrios estudos realizados foi a acentuada diferenciação genĂ©tica entre H. arborea da Europa Central e a da PenĂnsula IbĂ©rica, tendo sido, por isso, proposta a ressureição, da antiga sugestĂŁo, do carĂĄcter de espĂ©cie distinta para a forma da PenĂnsula IbĂ©rica, Hyla molleri Bedriaga 1890. Na PenĂnsula IbĂ©rica estas duas espĂ©cies ocorrem em simpatria numa vasta ĂĄrea das suas distribuiçÔes geogrĂĄficas, e sĂŁo conhecidas vĂĄrias situaçÔes de sintopia em que indĂviduos das duas espĂ©cies partilham o mesmo charco (ou outra zona hĂșmida). AtravĂ©s do canto de acasalamento, foram detectados hĂbridos (machos, dados serem estes os Ășnicos a emitir chamadas) em Portugal e Espanha. Todos os hĂbridos encontrados apresentavam caracterĂsticas intermĂ©dias Ă s das espĂ©cies parentais relativamente Ă s chamadas de acasalamento, aos padrĂ”es de variação de aloenzimas (hĂbrido encontrado em Portugal). A nĂvel morfolĂłgico, a banda lateral em alguns elementos estendia-se atĂ© metade dos flancos ou apresentava um âescudoâ rudimentar na regiĂŁo inguinal (tĂpico da H. arborea). Todos os indivĂduos hĂbridos capturados, revelaram ser estĂ©reis, com testĂculos sem cĂ©lulas espermatogĂ©nicas. Com base nestes conhecimentos prĂ©vios, estabelecemos como objectivo central desta tese o aprofundar do estudo sobre a histĂłria evolutiva de H. arborea e H. meridionalis, na tentativa de avaliar, confirmando ou infirmando as hipĂłteses anteriormente formuladas com recurso a uma dupla abordagem genĂ©tica e bioacĂșstica, acerca dos vĂĄrios aspectos que poderiam informar o melhor conhecimento do que podemos considerar as suas filogeografias e interrelação no nosso territĂłrio. Assim, mais especificamente propusemo-nos 1) determinar os padrĂ”es biogeogrĂĄficos da diversidade genĂ©tica das populaçÔes das duas espĂ©cies na PensĂnsula IbĂ©rica (sobretudo em Portugal), utilizando diferentes marcadores moleculares, fazendo uma re-anĂĄlise dos padrĂ”es filogeogrĂĄficos, anteriormente propostos, ao nĂvel da Europa e do Norte de Ăfrica e uma anĂĄlise a uma escala mais fina dos padrĂ”es ibĂ©ricos e mais em particular dos de Portugal; 2) paralelamente procurĂĄmos investigar quais os padrĂ”es geogrĂĄficos da diversidade bioacĂșstica em Portugal ao nĂvel dos cantos de acasalamento dos machos de ambas as espĂ©cies, pelas potencialidades que este tipo de abordagem oferece em termos de contribuiçÔes de Ăndole ecolĂłgica e evolutiva; e 3) tentar obter informação acerca das relaçÔes interespecĂficas atravĂ©s da anĂĄlise integrada de dados genĂ©ticos e bioacĂșsticos, explorando aspectos ligados a eventuais processos de hibridação/introgressĂŁo das duas espĂ©cies e correlativamente da ocorrĂȘncia de fenĂłmenos de âdeslocação de caracteresâ. Nestas espĂ©cies para conseguirmos concretizar os objectivos propostos apostĂĄmos numa abordagem dupla e complementar, baseada na anĂĄlise de dados genĂ©tico-moleculares e bioacĂșsticos. Para fazer face Ă parca amostragem, em estudos destas espĂ©cies, efectuados em Portugal, o esforço de amostragem (para recolha de tecido e para gravaçÔes ĂĄudio dos cantos de acasalamento) foi significativamente aumentado, tentando-se cobrir uma ĂĄrea bastante mais abrangente da ĂĄrea de distribuição das espĂ©cies. A amostragem de campo decorreu entre 2005-2010. Recolheram-se amostras de tecido de indivĂduos adultos e de girinos e foram gravados os cantos de acasalamento dos machos de ambas as espĂ©cies. Para completar a cobertura geogrĂĄfica no que refere a recolha de amostras para ulterior estudos genĂ©ticos, foram aproveitadas amostras cedidas por outros investigadores, bem como se usaram as sequĂȘncias jĂĄ publicadas em estudos anteriores. O gene escolhido do ADN mitocondrial foi o Citocromo Oxidase I (COI) dado ter jĂĄ sido utilizado noutros estudos para estas mesmas espĂ©cies. No que concerne ao estudo das interacçÔes das espĂ©cies, atravĂ©s da tĂ©cnica de RFLP (do inglĂȘs, âRestriction Fragment Length Polymorphismâ) testaram-se os indivĂduos provenientes de locais sintĂłpicos na busca de possĂveis hĂbridos F1 e, paralelamente, compararam-se os pĂąrametros dos cantos de acasalamento de machos de locais sintĂłpicos com os de locais alopĂĄtricos (que serviram de referĂȘncia). No que diz respeito Ă H. arborea, da anĂĄlise das sequĂȘncias de COI obtidas, confirmou-se a grande divergĂȘncia entre o grupo europeu e ibĂ©rico, com um distĂąncia genĂ©tica (p-uncorrected) de 0.125. Da anĂĄlise destes dados resultou a obetnção de uma ĂĄrvore filogenĂ©tica robusta, em que estes dois clados sĂŁo suportados por elevados valores de bootstrap. Corrobora-se assim a proposta expressa em estudos anteriores de revalidar a espĂ©cie IbĂ©rica, H. molleri. Analisando separadamente as sequĂȘncias obtidas de elementos da PenĂnsula IbĂ©rica obtiveram-se dois âgruposâ, aqui denominados por âNorteâ e âSulâ, mas sem grande suporte ao nĂvel da ĂĄrvore filogenĂ©tica. Os haplĂłtipos pertenecentes ao grupo do âNorteâ distribuem-se na sua maioria a Norte do rio Mondego e no Noroeste de Espanha; os haplĂłtipos do grupo âSulâ ocupam as ĂĄreas a sul do rio Mondego e a costa AtlĂąntica Nordeste da IbĂ©ria. O Ășltimo grupo apresenta uma diversidade haplotĂpica mais elevada que o grupo âNorteâ, contrariando resultados de estudos anteriores efectuados para esta espĂ©cie, mas que estĂŁo de acordo com estudos efectuados sobre outros anfĂbios ibĂ©ricos/portugueses. Ao nĂvel da acĂșstica nĂŁo se observou este padrĂŁo com uma divisĂŁo Norte-Sul. Pelo contrĂĄrio os parĂąmetros dos cantos de acasalamento revelaram-se homogĂ©neos entre os vĂĄrios locais amostrados, excepção feita ao local amostrado na Serra da Estrela (CFO) cujos valores da duração dos âgrupos de chamadasâ e o nĂșmero de chamadas por âgrupo de chamadasâ sĂŁo significativamente maiores que os dos demais locais amostrados. Esta diferença, nĂŁo reflectida ao nĂvel do ADN mitocondrial, poderia ser explicada pela altitude, tratando-se de um local acima dos 1500 m. Seria importante, no entanto, amostrar outros locais a altitudes semelhantes para comparar os cantos. Os padrĂ”es de diversidade genĂ©tica de H. meridionalis estudados atravĂ©s da sequenciação do gene COI, revelaram a existĂȘncia de dois clados robustos com elevados valores de bootstrap, um incluindo haplĂłtipos da regiĂŁo da TunĂsia e ArgĂ©lia (TA) e outro que se subdivide em trĂȘs subclados distintos, um de Marrocos Central (CM), e os outros dois subclados que partilham haplĂłtipos com o Norte de Ăfrica e a Europa. Um deles, denominando por âNorte de Marrocosâ (NM) inclui haplĂłtipos de amostras provenientes do Norte de Marrocos e, na Europa, do Nordeste IbĂ©rico, Sul de França e ItĂĄlia, e tambĂ©m das ilhas CanĂĄrias. O outro subclado denominado âSudoesteâ inclui haplĂłtipos do sudoeste de Marrocos e do sudoeste da PenĂnsula IbĂ©rica. Estes resultados estĂŁo de acordo com os obtidos em estudos anteriores, e em conjunto com a baixa diversidade genĂ©tica encontrada nos grupos IbĂ©ricos quando comparados com os Africanos bem como a presença de haplĂłtipos partilhados dos dois lados do Estreito de Gibraltar, vĂȘm ao encontro da hipĂłtese de ter havido uma colonização recente da PenĂnsula IbĂ©rica. A divergĂȘncia entre o clado TA e os demais sugere uma divergĂȘncia jĂĄ antiga destes grupos, sendo atĂ© possĂvel que se trate de um grupo tĂŁo diferenciado que possa pertencer a uma subespĂ©cie ou atĂ© espĂ©cie distinta. No subclado NM a presença de haplĂłtipos partilhados aponta para uma colonização mais recente da IbĂ©ria que a do subclado SW, em que nĂŁo hĂĄ partilha de haplĂłtipos entre a IbĂ©ria e Ăfrica. No entanto, em qualquer dos casos, os baixos valores de diversidades haplotĂpica suportam a hipĂłtese de uma colonização recente, pĂłs abertura do Estreito de Gibraltar (~5.33 Mya, apĂłs a Grande Crise MessiĂąnica durante a qual o MediterrĂąneo ocidental secou), levando a supor que ou os animais terĂŁo usado âjangadasâ naturais ou entĂŁo teriam sido transportados por humanos. Os cantos de acasalamento dos machos seguem este padrĂŁo de baixa diversidade entre populaçÔes, observado ao nĂvel do ADN mitocondrial, nĂŁo se verificando diferenças significativas. No que respeita ao nĂvel do estudo da interacção das duas espĂ©cies, ao contrĂĄrio do esperado, nĂŁo foram encontrados elementos relevantes, nomeadamente da ocorrĂȘncia de hĂbridos na natureza. Apesar do esforço de amostragem efectuado nas zona sintĂłpicas, a anĂĄlise de RFLP nĂŁo revelou a presença de nenhum hĂbrido F1 ou retrocruzamento. Igualmente, da anĂĄlise dos parĂąmetros dos cantos de acasalamento nĂŁo se encontraram quaisquer indicĂos que pudessem apontar nesse sentido. No entanto, a anĂĄlise dos cantos mostrou que quando em simpatria os machos de H. meridionalis alteram alguns dos parĂąmetros das suas chamadas de acasalamento. Quer a frequĂȘncia fundamental quer a frequĂȘncia dominante apresentam valores mĂ©dios mais baixos em situaçÔes de sintopia, assim como na duração das chamadas que foi, em mĂ©dia, inferior. SerĂĄ difĂcil justificar com certeza a razĂŁo para estas diferenças, sendo que estudos sobre as preferĂȘncias fonotĂĄcticas de fĂȘmeas e experiĂȘncias de playback com machos poderĂŁo ajudar a esclarecer esta matĂ©ria. No seu conjunto, os resultados obtidos realçam a importĂąncia da utilização de duplas abordagens como utilizĂĄmos, em que vias, em princĂpio, mais ou menos independentes, sĂŁo usadas de forma complementar para tentar responder Ă s questĂ”es referentes Ă determinação dos padrĂ”es espaciais e temporais da estrutura populacional destas espĂ©cies (e dos anuros e outros vertebrados em geral). O que fica ainda por esclarecer obriga Ă realização, idealmente num futuro prĂłximo, de estudos utilizando de forma efectiva vĂĄrios marcadores moleculares nomeadamente microssatĂ©lites, em particular no caso da H. arborea/H. molleri para tentar discernir qual a zona de fronteira entre as espĂ©cies e esclarecer melhor a estruturação populacional evidenciada pela existĂȘncia dos dois grupos, âNorteâ e âSulâ. O uso de microssatĂ©lites e outros marcadores nucleares irĂĄ favorecer o estudo ainda mais aprofundado de potenciais casos de hibridação/introgressĂŁo, utilizando-se a acĂșstica para explorar o valor que representam os cantos de acasalamento como barreira reprodutiva eficaz entre as espĂ©cies.Fundação para a CiĂȘncia e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/16446/2004