BIOPHOTONICS IN BIOPHARMACEUTICAL APPLICATIONS

Biopharmaceutical products are composed of complex or ordinate combinations of proteins, lipids, sugars, and nucleic acids or living cells or tissues. Due to the intrinsic variability of biological systems and the complexity of the bioprocesses involved in the production of these products, new technologies are required to monitor and characterize, the production processes and the final products. Biophotonic techniques, particularly Raman and Infrared (IR) spectroscopy are rapid, robust, operator independent, non-destructive and label free, thus particularly suitable for these purposes. This dissertation first investigates the use of biophotonic techniques in research of Extracellular Vesicles (EVs). EVs act as intercellular messengers and therefore have considerable potential in drug delivery system, diagnostic biomarker, or therapeutic agent. Subsequently highlighting the need and potential of a new kind of time gated Raman spectrometer to be created. Raman and IR spectroscopy are methods able to characterize and assess the quality of EV suspensions with different degree of purity. These vibrational spectroscopic techniques show different intrinsic advantages, as they are label free and operator independent methods. Particularly, Raman might be the most suitable technology since it is less sensitive to water compared to IR. Raman spectroscopy reveals the information on the chemical composition and physical status of the analyte. However, it does not provide information of the analyte environment which the spectrofluorometer can gather. EVs studied by spectrofluorometer are required to be labelled with a fluorescent dye. Results obtained by fluorescence lifetime imaging spectroscopy underline that the cell uptake of the fluorescently labelled EVs is feasible. Attention must be paid to the efficacy of the labelling and further to the elimination of the unbound dye since the labelling may severely compromise the results or lead to wrong conclusions on EV functionality. The combined advantage of Raman spectroscopy and fluorescence decay are obtained by a previously in-house developed time resolved Raman spectrometer. Thanks to the peculiar sensor of the spectrometer, the width of the time gate can be modified which is used to separate the Raman signal from the fluorescence tail. The modifications can be done even in the data post-processing phase, to obtain the best possible Raman signal-to-noise ratios. The simultaneously detected Raman spectra and time-resolved fluorescence decay curves are used to study the diffusion of small molecular drugs in a hydrogel. The data reveal the chemical composition, physical status, and the interaction with the environment of the samples. Taken together the obtained results suggest that the quality of EV suspensions can be assessed by Raman spectroscopy and their cell uptake detected by fluorescence lifetime spectroscopy. Both Raman spectra and fluorescence decay can be measured simultaneously by a second generation of time-resolved Raman spectrometer.Biofarmaseuttiset tuotteet koostuvat proteiinien, lipidien, sokereiden ja nukleiinihappojen tai elävien solujen tai kudosten järjestäytyneistä tai monimutkaisista yhdistelmistä. Biologisten järjestelmien luontaisen vaihtelevuuden ja näiden tuotteiden valmistukseen liittyvien bioprosessien monimutkaisuuden vuoksi tarvitaan uusia teknologioita tuotantoprosessien ja lopputuotteiden seurantaa ja karakterisointia varten. Biofotoniset tekniikat, erityisesti Raman- ja Infrapuna (IR) -spektroskopia ovat nopeita, luotettavia, hellävaraisia, leimattomia ja käyttäjästä riippumattomia tekniikoita, jotka soveltuvat erityisen hyvin biofarmaseuttisten tuotteiden määritykseen. Tämä väitöskirjan alussa tutkitaan biofotonisten tekniikoiden käyttöä solunulkoisten vesikkeleiden (EV:iden) tutkimuksessa. EV:t toimivat solujenvälisessä viestinnässä ja siksi niillä on huomattava potentiaali lääkekehityksessä, diagnostisina biomarkkerina ja terapeuttisina tekijöinä. Myöhemmin tutkimuksessa korostetaan uudenlaisen aikaerotteisen Raman-spektrometrin tarvetta ja mahdollisuuksia biofarmaseuttisten tuotteiden määrityksessä. Raman- ja IR-spektroskopia ovat menetelmiä, joilla voidaan karakterisoida ja arvioida eri puhtausasteen omaavia EV-näytteiden laatua. Nämä värähtelyspektroskooppiset tekniikat ovat leimattomia ja käyttäjästä riippumattomia menetelmiä. Verrattuna IR-spektroskopiaan, Raman on luonteeltaan mahdollisesti käyttökelpoisin tekniikka EV:iden karakterisointiin, sillä veden läsnäolo näytteessä ei häiritse mittausta. Raman-spektroskopian avulla saadaan tietoa analyytin kemiallisesta koostumuksesta sekä fysikaalisesta tilasta ja spektrofluorometrin avulla saadaan kerättyä informaatiota analyytin ympäristöstä, mihin Raman ei puolestaan pysty. Spektrofluorometrillä tutkitut EV:t on leimattava fluoresoivalla väriaineella ja fluoresenssin eliniän kuvantamisspektroskopialla saadut tulokset korostavat, että fluoresenssileimattujen EV:iden soluunotto on mahdollista. Leimauksen tehokkuuteen ja sitoutumattoman väriaineen eliminointiin on kiinnitettävä huomiota, sillä virheellinen leimaus voi väärentää tuloksia tai johtaa virheellisiin johtopäätöksiin EV:iden funktionaalisuudesta. Talon sisällä rakennetun laitteiston avulla on saatu yhdistettyä Raman-spektroskopia ja fluoresenssin eliniän vaimeneminen. Spektrometrin omalaatuisen anturin ansiosta kuvantamisen aikaikkunaa pystytään muokkaamaan, minkä avulla Raman-signaali pystytään erottamaan fluoresenssisignaalista. Muutokset voidaan tehdä myös datan jälkikäsittelyvaiheessa parhaan mahdollisen Raman-signaali-kohinasuhteen saamiseksi. Pienmolekyylisten lääkkeiden diffuusion tutkimiseen hydrogeelissä voidaan käyttää samanaikaisesti havaittuja Raman-spektrejä ja aikaerotteisia fluoresenssin vaimenemiskäyriä. Kerätty aineisto paljastaa näytteiden kemiallisen koostumuksen, fysikaalisen tilan ja vuorovaikutuksen ympäristön kanssa. Yhdessä saadut tulokset viittaavat siihen, että EV-suspensioiden laatua voidaan arvioida Raman-spektroskopialla ja niiden soluunotto havaita fluoresenssielinaikaspektroskopialla, kun Raman-spektri ja fluoresenssin heikkeneminen voidaan mitata samanaikaisesti toisen sukupolven aikaerotteisella Raman-spektrometrillä

Making sense of light: the use of optical spectroscopy techniques in plant sciences and agriculture

As a result of the development of non-invasive optical spectroscopy, the number of prospective technologies of plant monitoring is growing. Being implemented in devices with different functions and hardware, these technologies are increasingly using the most advanced data processing algorithms, including machine learning and more available computing power each time. Optical spectroscopy is widely used to evaluate plant tissues, diagnose crops, and study the response of plants to biotic and abiotic stress. Spectral methods can also assist in remote and non-invasive assessment of the physiology of photosynthetic biofilms and the impact of plant species on biodiversity and ecosystem stability. The emergence of high-throughput technologies for plant phenotyping and the accompanying need for methods for rapid and non-contact assessment of plant productivity has generated renewed interest in the application of optical spectroscopy in fundamental plant sciences and agriculture. In this perspective paper, starting with a brief overview of the scientific and technological backgrounds of optical spectroscopy and current mainstream techniques and applications, we foresee the future development of this family of optical spectroscopic methodologies.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Electric field enhancement with plasmonic colloidal nanoantennas excited by a silicon nitride waveguide

We investigate the feasibility of CMOS-compatible optical structures to develop novel integrated spectroscopy systems. We show that local field enhancement is achievable utilizing dimers of plasmonic nanospheres that can be assembled from colloidal solutions on top of a CMOS-compatible optical waveguide. The resonant dimer nanoantennas are excited by modes guided in the integrated silicon nitride waveguide. Simulations show that 100 fold electric field enhancement builds up in the dimer gap as compared to the waveguide evanescent field amplitude at the same location. We investigate how the field enhancement depends on dimer location, orientation, distance and excited waveguide modes

Development of a handheld fiber-optic probe-based raman imaging instrumentation: raman chemlighter

Raman systems based on handheld fiber-optic probes offer advantages in terms of smaller sizes and easier access to the measurement sites, which are favorable for biomedical and clinical applications in the complex environment. However, there are several common drawbacks of applying probes for many applications: (1) The fixed working distance requires the user to maintain a certain working distance to acquire higher Raman signals; (2) The single-point-measurement ability restricts realizing a mapping or scanning procedure; (3) Lack of real-time data processing and a straightforward co-registering method to link the Raman information with the respective measurement position. The thesis proposed and experimentally demonstrated various approaches to overcome these drawbacks. A handheld fiber-optic Raman probe with an autofocus unit was presented to overcome the problem arising from using fixed-focus lenses, by using a liquid lens as the objective lens, which allows dynamical adjustment of the focal length of the probe. An implementation of a computer vision-based positional tracking to co-register the regular Raman spectroscopic measurements with the spatial location enables fast recording of a Raman image from a large tissue sample by combining positional tracking of the laser spot through brightfield images. The visualization of the Raman image has been extended to augmented and mixed reality and combined with a 3D reconstruction method and projector-based visualization to offer an intuitive and easily understandable way of presenting the Raman image. All these advances are substantial and highly beneficial to further drive the clinical translation of Raman spectroscopy as potential image-guided instrumentation

Biosensors for studies on adhesion-mediated cellular responses to their microenvironment

Cells interact with their microenvironment by constantly sensing mechanical and chemical cues converting them into biochemical signals. These processes allow cells to respond and adapt to changes in their environment, and are crucial for most cellular functions. Understanding the mechanism underlying this complex interplay at the cell-matrix interface is of fundamental value to decipher key biochemical and mechanical factors regulating cell fate. The combination of material science and surface chemistry aided in the creation of controllable environments to study cell mechanosensing and mechanotransduction. Biologically inspired materials tailored with specific bioactive molecules, desired physical properties and tunable topography have emerged as suitable tools to study cell behavior. Among these materials, synthetic cell interfaces with built-in sensing capabilities are highly advantageous to measure biophysical and biochemical interaction between cells and their environment. In this review, we discuss the design of micro and nanostructured biomaterials engineered not only to mimic the structure, properties, and function of the cellular microenvironment, but also to obtain quantitative information on how cells sense and probe specific adhesive cues from the extracellular domain. This type of responsive biointerfaces provides a readout of mechanics, biochemistry, and electrical activity in real time allowing observation of cellular processes with molecular specificity. Specifically designed sensors based on advanced optical and electrochemical readout are discussed. We further provide an insight into the emerging role of multifunctional micro and nanosensors to control and monitor cell functions by means of material design.Fil: Saffioti, Nicolas Andres. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de San Martin. Instituto de Nanosistemas; ArgentinaFil: Cavalcanti Adam, Elisabetta Ada. Max Planck Institute for Medical Research. Department Of Cellular Biophysics; AlemaniaFil: Pallarola, Diego Andres. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de San Martin. Instituto de Nanosistemas; Argentin

Raman Spectroscopy and Surface Plasmon Resonance as Photonic Tools for Biopharmaceutical Applications

Biophotonics is an emerging area of scientific research that uses light of photons to probe biological specimens, such as tissues, cells and molecules. The field of biophotonics is broad and considerably multidisciplinary. Therefore the prerequisite for understanding biophotonics is the capability to integrate the fundamental knowledge of the physics of light with perspectives of engineering of devices and instruments used to generate, modify, and manipulate light. Also, the fundamentals of biology and medicine are essential particularly comprehension of the biochemical and cellular phenomena that occur in living systems, and how such phenomena can be scaled up to concern the physiology of organisms, for example humans. Biological pathways and processes differ in the healthy and diseased state, and that is why it is essential to develop understanding of pathophysiology and various states of disease such as cancer, neurodegenerative disease or infectious states. Consequently, solid insights into the functions of medical treatments, including biopharmaceutics, are needed. Raman and surface plasmon resonance (SPR) are both light-based technologies enabling label-free measurements with high sensitivity. The primary aim of this Thesis was to tackle the emerging hardships encountered in the fundamental biopharmaceutical research, clinical settings, or in the pharmaceutical industry by introducing applications and data analysis methods based on the cutting edge Raman and SPR technologies. These techniques represent the biophotonic cornerstones as tools for biopharmaceutical applications throughout this Thesis. The scope of this Thesis was essentially broad. First, small drug molecules were investigated with state-of-the-art time-gated Raman technology, showing that the interfering photoluminescent backgrounds can be effectively suppressed thus improving the acquired Raman data significantly. Additionally, EVs were studied with laser tweezers Raman spectroscopy (LTRS) as larger scale analytes and representatives of a highly interesting topic in the current nanomedical field. When Raman data from several different types of single EVs was examined using sophisticated data analysis, distinct subpopulations were observed, and the differences could be related to the biochemical compositions of the vesicle membranes. For the first time, the study showed the importance of measuring single EVs instead of a pool of vesicles. Multi-parametric SPR (MP-SPR) technology was harnessed to develop applications and data analysis methods for small and larger scale analytes. Hence, a new small drug molecule, spin-labeled fluorene (SLF), was investigated in the context of Alzheimer s disease (AD) particularly its potential to interfere with the detrimental amyloid peptide aggregation processes. The developed bio-functional in vitro platform in combination with rigorous data analysis and computational simulations demonstrated the capabilities of SLF when it was employed in various biomimetic aggregation schemes. Moreover, liposomes were examined with the MP-SPR as larger scale nanomedical particles for the purposes of safe and effective nanocarrier development. The administration of a liposomal nanocarrier into the blood circulation was mimicked in the designed bionanophotonic in vitro schemes. Undiluted serum was made to interact with immobilized model liposomes in dynamic flow conditions. The findings revealed that the variation in surface chemistries of the liposomes plays a role when serum essentially immune system components are interacting with the liposomes. In particular, distinct soft and hard protein coronas were observed and characterized during the interactions. Collectively, the results and findings in this Thesis underline the broad potential of biophotonics for biopharmaceutical applications. The technical improvements in instrumentation, and creativity in the application and data analysis development make the future of biophotonics bright.Biofotoniikka on kasvava tieteenala, jossa valon fotoneja käytetään biologisten kohteiden tutkimiseen. Esimerkkeinä kudokset, solut ja molekyylit. Biofotoniikka tieteenalana on huomattavan poikkitieteellinen. Valon tuottamiseksi ja muokkaamiseksi tarvitaan perustavanlaatuista tietoa fysiikasta sekä teknisiä taitoja laitteiden suunnittelemiseksi. Lisäksi biologian, ja lääketieteen perusteet ovat olennainen osa biofotoniikkaa. Erityisen tärkeää on ymmärrys biofysiikasta ja -kemiasta sekä molekyyli- ja solutason ilmiöistä, jotka tapahtuvat elävissä systeemeissä. Tämän väitöstyön tavoitteena oli kehittää biofotonisia tekniikoita, menetelmiä ja data-analytiikkaa nykyisen biofarmaseuttisen tutkimuksen haasteisiin. Olemassa olevien in vitro menetelmien, eli esimerkiksi koeputkessa tai maljassa tehtävien biologisten mallisysteemien ongelmana on usein se, että tulosten siirrettävyys kliinisiin tutkimuksiin ja lopullisiksi lääkevalmisteiksi ei ole suoraviivaista. Esimerkiksi leima-aineiden, kuten fluoresoivien tai radioaktiivisten molekyylien lisääminen tutkittaviin kohteisiin saattaa muuttaa niiden fysikaalista ja kemiallista käyttäytymistä elävässä ympäristössä. Raman-spektroskopia ja pintaplasmoniresonanssi ovat molemmat valoon perustuvia teknologioita, joilla mittauksia voidaan suorittaa ilman leima-aineita ja korkealla herkkyydellä. Molemmista teknologioista käytettiin kehityksen kärjessä olevia instrumentteja. Ne edustivat tässä työssä biofotonisia tekniikoita, joita täydennettiin perinteisillä tutkimusmetodeilla. Väitöstyössä tutkittiin aluksi pienlääkeaineita kiinteässä olomuodossaan Raman-spektroskopian avulla. Raman-spektroskopialla voidaan mitata erittäin tarkasti tutkittavien molekyylien kemiallinen rakenne. Tavallisesti Raman-tutkimusten ongelmana on kuitenkin voimakas fotoluminesenssi, joka tuottaa häiritsevän taustasignaalin ja haittaa Raman-spektrien tulkintaa. Uudella aika-portti Raman-tekniikalla pystyttiin erottelemaan Raman- ja fotoluminesenssisignaalit tehokkaasti. Tämä mahdollisti vaikeasti mitattavien lääkeaineiden Raman-spektrien mittaamisen ja tarkemman karakterisoinnin. Tutkimusten toisessa vaiheessa mitattiin ensimmäistä kertaa yksittäisiä ekstrasellulaarivesikkeleitä. Ekstrasellulaarivesikkelit ovat solujen tuottamia, kalvorakenteisia nanorakenteita, joiden läpimitta on noin 50 1000 nm. Niiden hyödyntäminen syöpädiagnostiikassa ja nanolääketieteellisinä lääkekantajina on kasvavan kiinnostuksen kohteena, mutta tutkimuksia rajoittaa vesikkeleiden biokemiallinen monimuotoisuus ja pieni koko. Mittaukset suoritettiin toisella uudentyyppisellä Raman-tekniikalla, laser-ansalla. Terveiden solujen ja syöpäsolujen tuottamien vesikkeleiden biokemiallista koostumusta arvioitiin kehitetyn monimuuttuja-analyysin keinoin ja havaittiin, että merkittävimmät erot vesikkeleiden välillä liittyivät niiden pintarakenteiden erilaisuuteen. Saaduilla tuloksilla on merkitystä vesikkeleiden funktioiden ymmärtämisessä ja niiden hyödyntämisessä nanolääketieteellisissä applikaatioissa. Väitöstutkimuksen kahdessa muussa osiossa kehitettiin pintaplasmoniresonanssiin pohjautuvia menetelmiä sekä data-analyysiä niin ikään pienlääkemolekyylien ja nanolääketieteellisten kohteiden tutkimukseen. Käytetty moderni pintaplasmoniresonanssitekniikka mahdollisti perinteisestä poikkeavan, perusteellisemman data-analyysin toteuttamisen. Ensin tarkasteltiin Alzheimerin taudin hoitoon kehitettyä uutta lääkemolekyyliä, jonka oli todettu hidastavan haitallista amyloid-peptidien yhteenliittymistä. Tutkimuksissa kehitetty bio-funktionaalinen in vitro alusta yhdessä tietokonesimulaatioiden kanssa osoitti, että tutkittu molekyyli vähensi selvästi amyloid-aggregaatiota. Analyysillä pystyttiin myös karakterisoimaan molekyylin interaktio-ominaisuuksia. Liposomit edustivat väitöstutkimuksen viimeisessä osuudessa nanolääketieteellisiä partikkeleita, joiden ominaisuuksia tutkittiin pintaplasmoniresonanssin avulla. Tällä hetkellä ainoat ihmiskäyttöön hyväksytyt nanolääkekantajat perustuvat liposomeihin. Kehitetyllä bionanofotonisella in vitro -alustalla matkittiin liposomikantajan annostelua verenkiertoon. Laimentamattoman seerumin annettiin vuorovaikuttaa sensoripinnalle immobilisoitujen liposomien kanssa dynaamisissa virtausolosuhteissa. Tulokset osoittivat, että liposomien pintakemialla on todennäköisesti vahva vaikutus siihen, miten seerumin komponentit, erityisesti immuunijärjestelmä, reagoivat annosteltuun liposomikantajaan. Havainnoilla on potentiaalista merkitystä turvallisten ja tehokkaiden lääkekantajien kehitystyössä. Yhteenvetona voidaan todeta, että biofotoniikkaa voidaan hyödyntää hyvin luovalla tavalla biofarmaseuttisiin applikaatioihin. Väitöstutkimuksen tulokset osoittavat, että kehitetyillä alustoilla ja data-analyysimenetelmillä on mahdollista parantaa nykyistä pienlääkekehitystä sekä nanolääketieteellistä tutkimusta