Fluoro-substituted prolines as structural labels for solid state ¹⁹F-NMR of polypeptides

Proline substitution useful for the solid state NMR structure analysis was explored on two peptides: gramicidin S and SAP. Corresponding microbiologial and conformational effects were correlated with the solid state NMR response

Computational studies of protein posttranslational modification : glycosylation of oligoproline and collagen peptides

xvi, 238 leaves : ill. ; 29 cmGlycosylation is the most complex posttranslational modification of proteins and has consequences on protein structure and function. In particular, the hydroxyproline (Hyp) rich glycoproteins (HRGPs) of plants are heavily glycosylated. On the other hand, glycosylation has not been observed in animal collagen despite the high occurrence of Hyp residues. This thesis uses computational chemistry to provide molecular level information about the structural effects of Hyp glycosylation to help understand the biological implications of the modification and explain the lack of glycosylation in animals. Initially, the nature of the glycosidic linkage between Hyp and galactose was determined. The theoretical results were validated by comparing to the recent experimental data, which helped understand other experimental observations. Subsequently, contiguous and non-contiguous glycosylation of a nonaproline oligopeptide was considered, which revealed that contiguous glycosylation increases the stability of the all trans polyproline II (PPII) conformation, while non-contiguous glycosylation leads to loss of PPII content. Sophisticated modeling suggested that this difference arises since peptide–solvent interactions stabilize the PPII conformation in the contiguously glycosylated peptide, while sugar–peptide backbone interactions that stabilize the cis conformations of some residues are stronger in the non-contiguously glycosylated peptide. Finally, the effects of Hyp glycosylation on the collagen triple helix were assessed, where it was determined that glycosylation makes the monomeric state more stable and hence hinders triple helix formation, which agrees with experimental results and highlights that the synergy between computation and experiments is necessary to understand complex glycosylation in nature

Enantioselective separation of fluorescence tagged amino acids using chiral anion exchangers

Im Zuge der Masterarbeit wurde die Enantiomerentrennung von Aminosäuren (AS) unter Verwendung von auf Chinin/Chinidin-basierenden chiralen stationären Phasen untersucht. Die AS wurden N-terminal funktionalisiert, um auf einer Anionenaustauschersäule retardiert zu werden. Dafür wurde ein weit verbreiteter Fluoreszenztag, 6-Aminoquinolin succinimid carbamate (AQC), verwendet. Demgegenüber wurde ein weiteres Label, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), eingesetzt und die Ergebnisse bezüglich ihrer chromatographischen Leistung, wie Enantioselektivität, Auflösung und Retentionsverhalten, verglichen. AQC wurde über eine Harnstoffgruppe und FITC über eine Thioharnstoffgruppe an ein primäres oder sekundäres Amin des Analyten gebunden. Diese Arten von chemischen Brückengruppen wurde bislang noch nicht in Kombination mit Chinin/Chinidin basierenden chiralen stationären Phasen zur enantioselektiven Trennung untersucht. Die verwendeten Substanzen, Aminosäuren, sind mit Ausnahme von Glycin von Natur aus chiral, und kommen beinahe ausschließlich in der (S)- bzw. L-Form vor. Die Spanne von Analyten umfasste die proteinogenen AS, sowie eine Reihe von nicht proteinogenen AS, wie Aminophosphonsäuren, Phenylalaninderivaten- bzw deren Analoga, Sulfon,- als auch Phosphonsäuren, Dipeptide, Phenylalanine- und Alaninpeptide. Die chirale Trennung wurde über Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) durchgeführt. Der chirale Selektor, Chinin/Chinidine, wurde an der C9 Position mit einer tert-Butylcarbamatgruppe versehen. Diese Modifikation führte zu einer sehr hohen Enantioselektivität gegenüber chiralen Molekülen. Betreffend der Wahl eines N-terminalen AS-tags kann das AQC Reagenz als sehr brauchbar eingestuft werden. Mit Ausnahme von Asparagrinsäure, wurden alle proteinogenen AS aufgetrennt. Spezielle Trennungsprobleme, wie die Separation von Stereoisomeren, wurden untersucht. So konnten alle vier Stereoisomere des 4-Hydroxyprolins basislinien rein getrennt werden. Die Threonin Stereoisomere, Threonine, allo-Threonin und Homoserin, wurden aufgelöst, mit der Ausnahme von den ersten beiden eluierenden Enantiomeren, welche kaum retardiert wurden und als eine Analytbande eluierten. Isoleucin Stereoisomere wurden dagegen viel schlechter aufgelöst. Dies kann darauf zurück geführt werden, dass das zweite Stereozentrum in der hydrophoben Seitenkette lokalisiert ist. Die hydrophoben Wechselwirkungen mit dem chiralen Selektor haben aber keinen Anteil an der chiralen Erkennung. Dem zugrunde liegend kann erklärt werden wieso für Isoleucin keine Basislinientrennung bewerkstelligt werden konnte. Schwer zu trennende Dipeptide wie Glycylprolin und Glycylphenylalanine konnten basislinienrein aufgelöst werden. Die Untersuchung von Alaninpeptiden sollte weiteren Aufschluss über die Leistungskraft der AS-label geben und auch über den chiralen Erkennungmechanismus weitere Erkenntnisse liefern. Die erzielten Ergebnisse ergänzen frühere Untersuchungen zu Alaninpeptiden und vervollständigen das erarbeitete Konzept der chiralen Erkennung von Peptiden mit mehreren Stereozentren. Die Abhängigkeit der Enantiomerentrennungen bezüglich des Abstandes der Schutzgruppe zu dem chiralen Zentrum wurden untersucht, ebenso der Einfuss einer achiralen Brücke, wie der eines Glycinrestes in solch einem Peptid. Die Auftrennung der Phenylalaninpeptide war ein weiterer Leistungstest für das angewandte Label. Aufgrund von durchgehend erzielten Basislinientrennungen, mit Ausnahme einiger Stereoisomer der Tri- und Tetrapeptiden, konnte dieser Derivatisierungsreagenz große Komplementariät zu dem tert-butyl-carbamate Chinineselektor zugesprochen werden. Generell stellt die AQC Gruppe, aufgrund von guten Trennleistungen, eine Erweiterung der möglichen N-terminalen Schutzgruppen dar. FITC konnte ebenfalls alle proteinogenen Aminoäuren derivatisieren und die Enantiomere wurden mit ähnlicher Trennleistung wie für die AQC-Derivate aufgetrennt. Die Enantioselekitivität war durschnittlich etwas geringer als bei AQC. Aufgrund von der weitaus kostengünstigeren Verfügbarkeit von FITC, war auch diese fluoreszenz aktive Gruppe sehr attraktiv. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil dieser Masterarbeit war die Synthese und Charakterisierung von auf Chinin basierenden Sulfobetain modifizierten chiralen Selektoren. Drei chirale stationäre Phasen dieses Typus wurden mittels einer Alkylierung unter Verwendung eines Propylsultons hergestellt. Die Alkylierung am Quinucelodinring des nativen Chinins führte zum Selektor der Säule CSP 3. Die gleiche Modifikation wurde an einem tert-butyl carbamate modifizierten Chininanalogon durchgeführt und führte zu CSP 4. Die Alkylierung am Quinolinring des tert-butyl carbamate Analogons ergab CSP 5. Die Säulen wurden auf ihre Fähigkeit zur Enantiomerentrennung getested. Es wurde festgestellt, das die Modifikation an einem der beiden enthaltenen Stickstoffatome unter Einführung einer Sulfonsäuregruppe die Fähigkeit zur Enantiodiskriminierung stark verringert, beziehungsweise völlig auslöscht. Nur für einige Analyte konnte eine Antrennung der Enantiomere erzielt werden. Grundsätzlich kann der Ort der Modifkation, als auch die eingeführte Gruppe dafür verantwortlich gemacht werden. Die Sulfonsäuregruppe und das quaternäre Amin stellen intramolekulare Gegenionen dar und ihre Ladungen können sich gegenseitig abdecken. Die Säulen wurden daraufhin auf ihre Anwendbarkeit in den hydrophilen Interaktionsmodus (HILIC) untersucht. Generell wurden dem Selektormolekül zwei Ladungen zugefügt, wodurch die Polarität des Gesamtmoleküls wesentlich gesteigert wurde. In Bezug auf die Anwendung als HILIC Säulen konnte ermittelt werden, dass eine grundsätzliche Retention von polaren und geladenen Analyten, Nukleoside, Nukleotide, Alkaloide, Säuren, Basen und amphotere Verbindungen, stattfindet. Die Selektivität bezüglich Nukleosiden und Nukleotiden war begrenzt, wogegen geladene und zwitterionische Verbindugen mit hoher Selektivität als auch Effizienz getrennt wurden. Die Modifikation an den Stickstoffatomen des Chinins, unter Einführung einer zweiten starken Ionenaustauschgruppe, führte zu einer Verminderung des chiralen Erkennungssystems. Diese Modifizerung des Chinins war daher nicht zielführend um die chirale Erkennung zu verändern oder zu verstärken. Als HILIC Säulen konnten die Sulfobetainphasen Verwendung finden. Eine höhere Selektorbeladung, sowie die Einführung einer zweite Alkylierung mit einem Akylsulfon, oder einer anderen, mehr HILIC taugliche Gruppe am C9-Atom des Chinins könnte zu mehr Effizienz der Auftrennung von HILIC Verbindungen führen. Die Retention von Analyten auf CSP 3 wurde durch hydrophobe als auch hydrophile Inkremente hervorgerufen. Es wurde auch hydrophiles Retentionsinkrement des tert-butyl carbamat Chininselektors festgestellt, das zu moderaten Retentionen von hydrophilen Substanzen im HILIC Modus führte.The enantioselective separation of fluorescent labelled amino acids and peptides was investigated. A set of amino acids, all proteinogenic, many non-proteinogenic and dipeptides of biological, pharmaceutical or chemical interest were selected for the investigation. tert-Butyl carbamate-modified quinine/quinidine based chiral stationary phases (CSPs) were used for enantioseparations. Most of the analytes were N-terminal labelled with 6-aminoquinolyl-succinimidyl carbamate (AQC), a common fluorescent tag for quantitative amino acid analysis. As an easy derivatization procedure allowing sensitive quantification, AQC was often used in chiral separation studies. A comparison with fluoresceine-isothiocyanate (FITC) was conducted in the present study, concerning their chromatographic performance on an anion-exchanger-type CSP. FITC was found to yield equal chiral separation potential compared to AQC. Besides the proteinogenic amino acids, the separation of AQC-tagged stereoisomers of 4-hydroxyproline, threonine and isoleucine, of dipeptides like phenyalaninoylglycine and glycoylphenylalanine or prolinoylglycine and glycoylproline was investigated. Further, the separation performance of the AQC reagent was explored using a set of alanine peptides. All-D/all-L peptides up to the hexamer were separated. The investigation of the influence on chiral recognition of one or two non-chiral linkers in di- and tripeptides, namely glycine subunits, either N- or C-terminal located was also part of this study. Enantiomerically pure phenylalanine peptides up to pentamers were also separated. These very lipophilic compounds were known to exhibit an unfavourable character related to chiral separations. The separation of stereoisomers of tri- and tetrapeptides of the before mentioned alanine and phenylalanine peptides was also investigated. The performance of the tert-butyl carbamate modified quinine/quinidine based CSPs was explored, as well as the influence of the stereochemistry on the N- or C-terminus of peptides on chiral recognition. The second part of the master thesis was the synthesis and application of sulfobetaine-type quinine-based chiral stationary phases. A set of native or derivatized amino acids was analyzed with different types of mobile phase. It was found that the alkylation of the nitrogen atoms, either on the quinuclidine or the quinoline ring, had led to strongly reduced or even diminished chiral discrimination behaviour of the quinine selector. The sulfobetaine-type columns were also investigated concerning their applicability in the hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) mode. A set of typical HILIC compounds, polar and/or charged substances were separated using mobile phases with different compositions and adjusted pH values. The retention mechanism of the columns was found to be a mixed mode, containing hydrophobic and hydrophilic retention increments. The study also showed that the tert-butyl carbamate quinine-based CSPs has also a hydrophilic retention increment. It was shown that the synthesized sulfobetaine columns can be used as HILIC columns for the separation of highly polar substances. The present master thesis showed the applicability of a fluorescent tag, based on a carbamate linkage group, for the enantioselective separation of amino acids and related compounds on a quinine-based anion exchange-type chiral stationary phase

The influence of solvent representation on nuclear shielding calculations of protonation states of small biological molecules

In this study, we assess the influence of solvation on the accuracy and reliability of isotropic nuclear magnetic shielding calculations for amino acids in comparison to experimental data. We focus particularly on the performance of solvation methods for different protonation states, as biological molecules occur almost exclusively in aqueous solution and are subject to protonation with pH. We identify significant shortcomings of current implicit solvent models and present a hybrid solvation approach that improves agreement with experimental data by taking into account the presence of direct interactions between amino acid protonation state and water molecules

Investigating The Structural And Physiochemical Properties Of Collagen Mimetic Peptides With Modified Backbones

Collagen is the most abundant protein found in mammalian systems and is critically important in a myriad of different regulatory pathways, prompting widespread effort to model and understand collagen-protein interactions. A network of hydrogen bonds, non-covalent interactions, sterics, and stereoelectronic effects hold collagen’s unique triple-helical quaternary structure together. The highly repetitive primary structure, generalized by a three amino acid triplet: (Xaa-Yaa-Glycine), is critical for this uncommon structural assembly.Our lab has been investigating how the incorporation of aza-glycine (azGly, azG) and aza- proline (azPro, azP) residues affect the triple-helical structure and thermal stability of collagen mimetic peptides (CMPs). Although we have previously shown azGly and azPro incorporation can affect the triple-helical thermal stability of CMPs, the model systems used were quite limited in scope. Herein, the impact of azGly and azPro incorporation on CMP stability and structure is demonstrated to be dependent on a variety of different factors. This was accomplished through the synthesis of peptide libraries containing these aza-amino acids, evaluation of CMP thermal stabilities along with refolding times, and by solving high-resolution crystallographic structures of triple-helical structures. Futhermore, we optimize the synthesis of azGly-containing CMPs, evaluate the binding of azGly-containing CMPs to a target protein, and investigate an alternative CMP model system. Collectively, this body of work reports the first comprehensive set of design guidelines for incorporating azGly and azPro residues into CMPs and sets the stage for the utilization and application of aza-collagen peptides within biologically relevant systems

Synthèse en phase solide de pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones modulateurs du système urotensinergétique

Les pyrrolodiazépinones ont des activités biologiques intéressantes sur différents récepteurs biologiques, ce qui en font une cible de choix pour développer de nouvelles petites molécules biologiquement actives. Une méthodologie en solution a été développée pour synthétiser des pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones, qui utilise la réaction de Pictet-Spengler pour former le cycle diazépinone, comme réaction clé. Il a été démontré que le pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-one mime un tour-γ inverse par l’analyse de cristaux par rayon X. Cette méthodologie a été transposée sur trois types de support, soit la résine de Merrifield, de Wang et un support soluble (TAP). Le système urotensinergétique joue un rôle dans certaines pathologies du système cardiovasculaire, comme l’hypertension artérielle, l’insuffisance cardiaque et l’athérosclérose. Le système urotensinergétique est exprimé dans le système circulatoire, extractoire et le système nerveux central et comprend l’UII, l’URP et le récepteur UT. L’UII et l’URP humains sont composés respectivement des séquences d’acides aminés : H-Glu-Thr-Pro-Asp-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH et H-Ala-c[Cys-Phe-Trp-LysTyr-Cys]-Val-OH. L’UII est le peptide vasoconstricteur le plus puissant connu à ce jour, dont l’URP est son isoforme. Les deux peptides ont des effets biologiques différents et on peut supposer qu’ils jouent un rôle distinct dans certaines pathologies. Il a été démontré que la partie active de l’UII est composée du tripeptide : Trp-Lys-Tyr. Dans l’URP, il a été démontré que ce tripeptide forme un tour-γ inverse, ce qui fait du récepteur UT une bonne cible biologique pour tester une librairie de pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones, reprenant le tripeptide Trp-Lys-Tyr. Dernièrement, l’équipe du professeur David Chatenet a mis au point un peptide, l’urocontrin en remplaçant le segment Trp par un groupement biphénylalanine, qui a démontré un comportement spécifique comme antagoniste du récepteur UT. La Librairie de pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones est basée sur la séquence TrpLys-Tyr de l’UII et de l’URP et de la séquence Trp-Lys-Bip de l’urocontrin. La synthèse de la librairie est faite sur la résine de Wang. La chaîne latérale de Tyr est mimée en utilisant la tyramine, Lys et Orn sont utilisés et la chaîne latérale de Trp a été reproduite II en utilisant le biphényle (comme dans l’urocontrin), le 1-naphthyle et le 2-naphthyle, sont introduits en employant les aldéhydes respectifs dans la réaction de Pictet-Spengler, ce qui donne les pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones insaturés et les saturés S- et R-. L’évaluation de l’activité biologique des pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones obtenues sur le récepteur UT se fait par des tests in vitro et ex vivo. Les tests in vitro consistent en un essai de liaisons sur des cellules CHO exprimant le récepteur UT en employant hUII-125I, comme contrôle radiomarqé. Les tests ex vivo sont effectués sur des aortes de rats pour mesurer la capacité à induire des contractions ou de moduler les contractions induites par hUII et URP. Certains R-pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones causent une réduction de 50% du signal radioactivité du hUII-125I. Les pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones ne montrent guère d’activité ex vivo, mais ils ont la capacité de moduler les contractions induites par l’hUII et l’URP. Par exemple, l’analogue Lys R-saturé avec le biphényle inhibe toutes les contractions de l’aorte à 14 µM avec un pKb de 5,54 à 4 µM, sans influencer les contractions de l’aorte induites par l’URP. Les pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones ont une sélectivité pour le système urotensinergétique et sont inactifs sur le récepteur de l’endotheline-1. Les pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones sont les premières petites molécules qui peuvent moduler l’activité biologique de l’UII et URP et offrir un potentiel intéressant comme outil pour étudier le système urotensinergétique.The pyrrolodiazepinones have interesting biological activities on various biological receptors, which makes them a prime target for developing new biologically active small molecules. A methodology in solution had been developed for synthesizing pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones, which utilized the Pictet-Spengler condensation as the key reaction to form the diazepinone ring. Pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones were found to mimic an inverse γ-turn conformation by X-ray crystallographic analysis. The methodology was subsequently implemented on three types of support: Merrifield resin, Wang resin and the soluble TAP support. The urotensinergic system plays a role in certain diseases of the cardiovascular system, such as hypertension, heart failure and atherosclerosis. The urotensinergic system is expressed in the circulatory system, excretory and central nervous systems and includes the endogenous ligands urotensin II (UII) and urotensin II-related peptide (URP), and the urotensin receptor UT. The ligands UII and human URP are composed of the respective amino acid sequences: H-Glu-Thr-Pro-Asp-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH and H-Ala-c[Cys-Phe-Lys-Tyr-Trp-Cys]-Val-OH. The peptide UII is the most potent vasoconstrictor known to date. The two peptides have different biological effects and may exhibit distinct roles in certain diseases. Their common Trp-Lys-Tyr sequence is believed to play an important role in the activity of UII and URP, and has been suggested to adopt an inverse γ-turn conformation. Notably, the laboratory of Professor David Chatenet developed the UT receptor antagonist peptide urocontrin by replacing the Trp residue by biphenylalanine (Bip) in URP. A library of pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-one analogs was thus designed to mimic the inverse γ-turn sequence and targeted against UT. The pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-one library was designed based on the Trp-Lys-Tyr sequence of UII and URP, and Trp-Lys-Bip sequence of urocontrin. The synthesis of the pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-one library was achieved on Wang resin. The side chain of Tyr was mimicked using tyramine, Lys and Orn were used as the basic amino acid component, and the side chain of Trp was replicated using biphenyl (as in urocontrin) 1-naphthyl and 2-naphthyl groups that were introduced by employing their respective aldehydes in a Pictet-Spengler reaction, which furnished unsaturated and saturated S- and R-pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones. Evaluation of the biological activity of the pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones on the UT receptor was performed in vitro and ex vivo. Tests in vitro measured binding in CHO-cells which expressed UT by employing hUII-125I as radiolabeled control. In rat aorta, ex vivo tests measured capacity to induce contraction, or modulate the contractions induced by hUII and URP. Certain R-pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones caused an up to 50% reduction of the radioactive signal of hUII-125I. Pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones exhibited little activity ex vivo; however, they modulated contractions induced by hUII and URP. For example, the saturated R-analog possessing lysine and a biphenyl side chain inhibited completely hUII-induced contractions of the aorta at 14 µM with a pKb of 5.54 at 4 µM, without influencing URP-induced contractions. Pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones were selective for the urotensinergic system and inactive on the related receptor endothelin-1. Pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones represent the first small molecules that can differently modulate the biological activities of UII and URP, and offer interesting potential as tools for studying the urotensinergic system

Expanding the complexity and functional diversity of bis-amino acid building blocks

We are developing a unique approach to the synthesis of macromolecules with programmable shape. These scaffolds are assembled from stereochemically pure orthogonally protected bis-amino acids that are interconnected by two amide bonds. This ladder-like arrangement restricts the conformational flexibility of bis-amino acids to a large extent which in turn drastically reduces the number of allowed conformations for an oligomer. As a result, significantly lesser computing power is needed for the final three-dimensional structure prediction. Several stereochemically pure bis-amino acid monomers have been synthesized by our research group and incorporated into a number of homo- and hetero-oligomers.In this dissertation we present the synthesis of a new pipecolic acid-based bis-amino acid building block pip5(2S5S). Assembly of this monomer into a short spiroladder oligomer utilizing solid-phase synthesis followed by in situ activation by dicyclohexylcarbodiimide and N-hydroxysuccinimide has been demonstrated. The structure of the oligomer was determined in aqueous solution using two-dimensional NMR. We report improved conditions for rapidly and simultaneously closing multiple diketopiperazines on solid support. These new conditions involve either heating of a suspension of solid supported amino-tetrafluoropropyl esters in acetic acid/triethylamine catalyst solution in a microwave oven or continuous flow of catalyst solution through the resin, heated in a special flow cell apparatus.Finally, the synthesis of the first functionalized bis-amino acid monomer proAc(2S3S4R) that carries an acetyl side chain is presented. This monomer was incorporated into a short oligomer and the solution phase structure was determined using two-dimensional nuclear magnetic resonance. The solution structure confirmed the intended connectivity and stereochemistry of the oligomer. This first functionalized bis-amino acid represents a milestone towards functionalized bis-peptide nanostructures for catalytic, molecular recognition and nanotechnology applications