Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels

Important modulatory roles have been attributed to presynaptic NMDA receptors (NMDARs) located on cerebellar interneuron terminals. Evidence supporting a presynaptic location includes an increase in the frequency of mini events following the application of NMDA and gold particle-labelled NMDA receptor antibody localisation. However, more recent work, using calcium indicators, casts doubt on the idea of presynaptic NMDARs because basket cell varicosities did not show the expected calcium rise following either the local iontophoresis of L-aspartate or the two-photon uncaging of glutamate. (In theory such calcium imaging is sensitive enough to detect the calcium rise from even a single activated receptor.) It has therefore been suggested that the effects of NMDA are mediated via the activation of somatodendritic channels, which subsequently cause a subthreshold depolarization of the axon. Here we report results from a vibrodissociated preparation of cerebellar Purkinje cells, in which the interneuron cell bodies are no longer connected but many of their terminal varicosities remain attached and functional. This preparation can retain both inhibitory and excitatory inputs. We find that the application of NMDA increases the frequency of both types of synaptic event. The characteristics of these events suggest they can originate from interneuron, parallel fiber and even climbing fiber terminals. Interestingly, retrograde signalling seems to activate only the inhibitory terminals. Finally, antibody staining of these cells shows NMDAR-like immunoreactivity co-localised with synaptic markers. Since the Purkinje cells show no evidence of postsynaptic NMDAR-mediated currents, we conclude that functional NMDA receptors are located on presynaptic terminals

A scanning ion conductance microscopy assay to investigate interactions between cell penetrating peptides and pore-suspending membranes

Die Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (scanning ion conductance microscopy, SICM) stellt eine kontaktfreie Methode zur Ermittlung sowohl der Topographie als auch lokalen Ionenleitfähigkeit einer Oberfläche dar. Besonders vorteilhaft ist die Vermeidung mechanischer Beeinflussung bei der Untersuchung flexibler Strukturen, z.B. Lipiddoppelschichten wie Zellen oder künstlich erzeugter Lipidmembranen. Porenüberspannende Membranen (pore-suspending membranes, PSMs) verbinden als ein Beispiel für Modellsysteme eine hohe Stabilität mit lateraler Mobilität und dem Vorhandensein wässriger Kompartimente ober- und unterhalb der Doppelschicht, wie sie auch in der Natur gefunden werden. Ein wichtiges Forschungsgebiet stellt die Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden, besonders zellpenetrierenden Peptiden (cell penetrating peptides, CPPs), mit Lipiden und anderen Membranbestandteilen dar. Häufig untersuchte Beispiele sind Melittin, Hauptbestandteil des Giftes der Honigbiene Apis mellifera, sowie Penetratin, dritte Helix der Antennapedia Homöodomäne von Drosophila melanogaster. Generalisierte Protokolle zur Herstellung lösungsmittelfreier PSMs werden vorgestellt. Riesige unilamellare Vesikel (giant unilamellar vesicles, GUVs) unterschiedlicher Lipidzusammensetzung wurden hierzu auf porösem Siliziumnitrid (Si3N4), welches mit Cholesterylpolyethylenoxythiol (CPEO3, hydrophob) bzw. Mercaptoethanol (ME, hydrophil) funktionalisiert worden war, gespreitet. Verwendet wurden GUVs aus reinen Phosphatidylcholin (PC)-Lipiden sowie aus Mischungen von PC-Lipiden mit Cholesterol und PC-Lipiden mit Phosphatidylserin (PS)-Lipiden. Der Erfolg des Spreitvorgangs wurde durch Abbilden mittels konfokaler Rasterlasermikroskopie (confocal laser scanning microscopy, CLSM) und SICM verifiziert. Der Hauptteil dieser Arbeit behandelte die Entwicklung und Anwendung CLSM- und SICM-basierter CPP-Titrationsassays zur Aufklärung des Einflusses der Substratfunktionalisierung und der Lipidzusammensetzung der Membranen auf die Wechselwirkung zwischen Melittin bzw. Penetratin und den Lipiddoppelschichten. CLSM-Experimente wurden mit Melittin auf allen zur Verfügung stehenden PSMs sowohl auf hydrophob als auch hydrophil funktiona-lisierten Substraten durchgeführt, während Penetratin auf den drei unterschiedlichen PSMs auf hydrophil funktionalisierten Substraten verwendet wurde. Ein Reißen der Membranen wurde im Fall hydrophil funktionalisierter Substrate für beide Peptide im Bereich von 1–3 µM beobachtet. Bei hydrophob funktionalisierten Substraten induzierte eine dreifach geringere Melittinkonzentration die Zerstörung der Membranen. Sowohl auf hydrophob als auch auf hydrophil funktionalisierten Substraten wurde bei einem Cholesterolanteil von 10% eine Erhöhung der zum Reißen notwendigen Melittinkonzentratin erhalten, während bei 20% PS-Anteil eine Verschiebung zu geringeren Konzentrationen evident wurde. SICM-Experimente wurden mit Melittin auf PC/Cholesterol-PSMs auf hydrophob und hydrophil funktionalisierten Substraten und mit reinen PC-PSMs auf hydrophil funktionalisierten Membranen durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Konzentrationsunterschiede beobachtet; die gefundenen Konzentrationsbereiche jedoch stimmten mit denen der CLSM-Experimente überein. Darüberhinaus wurde vor dem Reißen der Membranen ein Ansteigen der Porentiefe gefunden, das mit einer erhöhten Membranpermeabilität korrespondiert

Fast Specimen Boundary Tracking and Local Imaging with Scanning Probe Microscopy

An efficient and adaptive boundary tracking method is developed to confine area of interest for high-efficiency local scanning. By using a boundary point determination criterion, the scanning tip is steered with a sinusoidal waveform while estimating azimuth angle and radius ratio of each boundary point to accurately track the boundary of targets. A local scan region and path are subsequently planned based on the prior knowledge of boundary tracking to reduce the scan time. Boundary tracking and local scanning methods have great potential not only for fast dimension measurement but also for sample surface topography and physical characterization, with only scanning region of interest. The performance of the proposed methods was verified by using the alternate current mode scanning ion-conductance microscopy, tapping, and PeakForce modulation atomic force microscopy. Experimental results of single/multitarget boundary tracking and local scanning of target structures with complex boundaries demonstrate the flexibility and validity of the proposed method

Development of scanning ion conductance microscopy for biomedical applications

Imperial Users onl

A new view of electrochemistry at highly oriented pyrolytic graphite

Major new insights on electrochemical processes at graphite electrodes are reported, following extensive investigations of two of the most studied redox couples, Fe(CN)64–/3– and Ru(NH3)63+/2+. Experiments have been carried out on five different grades of highly oriented pyrolytic graphite (HOPG) that vary in step-edge height and surface coverage. Significantly, the same electrochemical characteristic is observed on all surfaces, independent of surface quality: initial cyclic voltammetry (CV) is close to reversible on freshly cleaved surfaces (>400 measurements for Fe(CN)64–/3– and >100 for Ru(NH3)63+/2+), in marked contrast to previous studies that have found very slow electron transfer (ET) kinetics, with an interpretation that ET only occurs at step edges. Significantly, high spatial resolution electrochemical imaging with scanning electrochemical cell microscopy, on the highest quality mechanically cleaved HOPG, demonstrates definitively that the pristine basal surface supports fast ET, and that ET is not confined to step edges. However, the history of the HOPG surface strongly influences the electrochemical behavior. Thus, Fe(CN)64–/3– shows markedly diminished ET kinetics with either extended exposure of the HOPG surface to the ambient environment or repeated CV measurements. In situ atomic force microscopy (AFM) reveals that the deterioration in apparent ET kinetics is coupled with the deposition of material on the HOPG electrode, while conducting-AFM highlights that, after cleaving, the local surface conductivity of HOPG deteriorates significantly with time. These observations and new insights are not only important for graphite, but have significant implications for electrochemistry at related carbon materials such as graphene and carbon nanotubes