Impact of nucleic acid sequencing on viroid biology

Abstract: The early 1970s marked two breakthroughs in the field of biology: (i) The development of nucleotide sequencing technology; and, (ii) the discovery of the viroids. The first DNA sequences were obtained by two-dimensional chromatography which was later replaced by sequencing using electrophoresis technique. The subsequent development of fluorescence-based sequencing method which made DNA sequencing not only easier, but many orders of magnitude faster. The knowledge of DNA sequences has become an indispensable tool for both basic and applied research. It has shed light biology of viroids, the highly structured, circular, single-stranded non-coding RNA molecules that infect numerous economically important plants. Our understanding of viroid molecular biology and biochemistry has been intimately associated with the evolution of nucleic acid sequencing technologies. With the development of the next-generation sequence method, viroid research exponentially progressed, notably in the areas of the molecular mechanisms of viroids and viroid diseases, viroid pathogenesis, viroid quasi-species, viroid adaptability, and viroid–host interactions, to name a few examples. In this review, the progress in the understanding of viroid biology in conjunction with the improvements in nucleotide sequencing technology is summarized. The future of viroid research with respect to the use of third-generation sequencing technology is also briefly envisaged

Détermination de la structure de tous les viroïdes

Les viroïdes sont des agents pathogènes subviraux qui infectent des plantes importantes en agriculture. Jusqu’à aujourd’hui, une trentaine d’espèces ont été découvertes. Celles-ci sont composées d’un brin d’ARN circulaire de longueur variant selon l'espèce de 245 à 400 nucléotides qui ne codent pour aucune protéine. Chaque viroïde dépend de sa structure pour interagir avec son hôte et effectuer toutes les étapes de son cycle biologique. Il est donc de la plus haute importance de bien la connaître. À ce jour, la plupart des études présentent la structure des viroïdes par une prédiction bio-informatique. Au début de mes études, les structures de seulement deux viroïdes étaient connues en solution. Leurs structures avaient été étudiées par cartographie enzymatique ou chimique, cependant ces techniques sont longues et fastidieuses. Malgré cela, des motifs importants et non prédits par les prédictions bio-informatiques ont été découverts. Ces résultats ont renforcé la nécessité de découvrir la structure des viroïdes en solution. C’est pour cette raison que la structure de chaque espèce de viroïdes a été étudiée dans cette thèse. Pour relever ce défi, la technique de SHAPE a été adaptée pour la cartographie rapide et précise des viroïdes. L’efficacité de la technique a été confirmée en comparant les résultats obtenus par SHAPE avec ceux des viroïdes étudiés précédemment. Par la suite, les deux polarités de toutes les espèces de la famille des Avsunviroidae ont été caractérisées. De plus, les structures des membres de la seconde famille de viroïdes nommée Pospiviroidae ont aussi été étudiées. En dernier lieu, lors d'infections virales chez la plante, des particules à ARN circulaire et simple brin peuvent co-infecter les plantes avec certains virus ; ce sont des ARN satellites. Étant très semblables aux viroïdes, deux représentants ont été étudiés afin de comparer leurs structures à celles des viroïdes. Chaque ARN cartographié en solution a précisé de façon non négligeable le modèle de la structure secondaire par rapport à ceux proposés par la prédiction bio-informatique seule. De plus, des motifs tertiaires ont aussi été trouvés pour quelques-uns de ces ARN. L’ensemble du travail a aussi permis de proposer des améliorations à la classification des viroïdes et de classer de nouvelles espèces. Pour terminer, ce compendium de structures des viroïdes servira de point de départ pour étudier les motifs structuraux importants pour leur biologie

Replicación de los viroides nucleares: motivos estructurales y enzimas implicados en el procesamiento in vivo de sus intermediarios oligoméricos.

RESUMEN Los viroides, los agentes infecciosos más pequeños descritos hasta la fecha (246-401 nt), están constituidos únicamente por una molécula circular de RNA de simple cadena. A pesar de su tamaño y de no codificar proteínas son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en plantas susceptibles gracias a su capacidad para interaccionar con factores del huésped. Dichas propiedades biológicas y moleculares hacen de estos patógenos un excelente modelo para abordar el estudio de cuestiones básicas sobre la relación entre la estructura del RNA y su función. La replicación de los viroides transcurre según un mecanismo de círculo rodante en el que sólo intervienen intermediarios de RNA. Este proceso conlleva tres etapas: i) la transcripción reiterada del RNA circular monomérico infeccioso más abundante, al cual se la asigna arbitrariamente la polaridad positiva, ii) el corte de los RNAs oligoméricos de una o de ambas polaridades, y iii) la ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes. Mientras que para los viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae) se conoce el sitio de corte de los RNAs oligoméricos y la actividad catalítica implicada (ribozimas de cabeza de martillo que sus RNAs de ambas polaridades pueden adoptar), para los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) ambos aspectos son controvertidos. En el presente trabajo hemos abordado el estudio del procesamiento (corte de los RNAs oligoméricos de polaridad positiva y ligación de los RNAs monoméricos lineales) de los viroides nucleares utilizando una metodología in vivo basada en plantas de Arabidopsis thaliana que expresan transcritos diméricos de tres miembros de la familia Pospiviroidae. Mediante el análisis del extremo 5 de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo (en plantas transgénicas o en plantas huésped infectadas), hemos identificado el sitio de corte en un motivo conservado en la familia: la rama superior de la región central conservada (CCR, central conserved region). Las secuencias que la componen y las repeticiones invertidas que la flanquean pueden adoptar un plegamiento en horquilla o, alternativamente, una estructura de RNA bicatenario palindrómico en RNAs oligoméricos. El sitio de corte determinado se localiza en posiciones estructuralmente equivalentes en los tres viroides estudiados, lo que sugiere la implicación de una o de ambas estructuras en la etapa de corte. Los datos obtenidos con varias líneas transgénicas de A. thaliana que expresan cDNAs diméricos de uno de los tres viroides mutados en posiciones definidas de la CCR han permitido concluir que el sustrato de la reacción de corte debe ser la estructura de RNA bicatenario palindrómico y que el bucle E, presente en la conformación en varilla de algunos miembros de la familia, participa en la reacción de ligación aunque no es el único motivo estructural relevante. Es de destacar que el modelo propuesto en este trabajo es aplicable a todos los miembros de la familia Pospiviroidae, y difiere de los modelos previos basados en estudios in vitro que tienen una aplicación más restringida. Los sitios de corte en la conformación que contiene el RNA bicatenario palindrómico generan RNAs monoméricos lineales con extremos 3 con dos nucleótidos protuberantes, la huella característica de las RNasas III. La caracterización de los grupos químicos terminales de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo indica la presencia de extremos 5-P, 3-OH compatibles con la actividad de una enzima de esta familia y con una RNA ligasa distinta a la única caracterizada en plantas. __________________________________________________________________________________________________Viroids are small, circular, noncoding RNAs that currently are known to infect only plants. They also are the smallest self-replicating genetic units known. Without encoding proteins and requirement for helper viruses, these small RNAs contain all the information necessary to mediate intracellular trafficking and localization, replication, systemic trafficking, and pathogenicity. All or most of these functions likely result from direct interactions between distinct viroid RNA structural motifs and cellular factors. Viroids present a simple model system to address some basic questions about the RNA structurefunction relationships. Replication of viroids entails reiterative transcription of their incoming single-stranded circular genomes, to which the (+) polarity is arbitrarily assigned, cleavage of the oligomeric strands of one or both polarities to unit-length, and ligation to circular RNAs. While cleavage in chloroplastic viroids (family Avsunviroidae) is mediated by hammerhead ribozymes, where and how cleavage of oligomeric (+) RNAs of nuclear viroids (family Pospiviroidae) occurs in vivo remains controversial. In the present work we have re-examined this question in vivo, using transgenic Arabidopsis lines expressing three dimeric nuclear viroid RNAs and host plants infected. Using this methodology, we have mapped the processing site of these three members at equivalent positions of a conserved region (the hairpin I/double-stranded structure that the upper strand and flanking nucleotides of the central conserved region can form). Together with mapping the in vivo processing site, our results with sixteen mutants of one of these viroids support that cleavage is directed by an RNA motif conserved in all members of the family, and ligation by an extended conformation containing a motif termed loop E. These results have deep implications on the underlying mechanism of both processing reactions, which are most likely catalyzed by enzymes different from those generally assumed: cleavage by a member of the RNase III family, and ligation by an RNA ligase distinct from the only one characterized so far in plants, thus predicting the existence of a least a second plant RNA ligase

Le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd) un modèle pour mieux comprendre l'évolution et la biologie des viroïdes du groupe A

Les viroïdes sont de courts ARN simple brin circulaires (~300 nucléotides) qui infectent les plantes supérieures causant des pertes économiques importantes en agriculture. Ils se répliquent à l'intérieur des cellules infectées par un mécanisme en cercle roulant (Branch et Robertson, 1984). Leur génome ne code apparemment pour aucune protéine et ils sont ainsi dépendant [i.e. dépendants] de leur hôte pour assurer certaines étapes de leur cycle vital. On connaît aujourd'hui 29 espèces de viroïdes appartenant à deux groupes distincts. Les viroïdes du groupe B possèdent certains éléments de séquence et de structure qui sont conservés. Leur génome est subdivisé en 5 domaines caractéristiques auxquels on attribue certaines fonctions biologiques (Keese et Symons, 1985; Flores et al., 1997). Ces ARN se retrouvent au niveau du noyau des cellules infectées où ils seraient répliqués par l'ARN polymérase II. Les viroïdes du groupe A ne possèdent pas l'organisation génomique typique des viroïdes du groupe B et on ne dénote aucune conservation au niveau de leur séquence ou de leur structure. Ils sont caractérisés par la présence de motifs autocatalytiques (hammerhead) qui permettent la coupure des brins multimériques produits lors de la réplication en cercle roulant. Ces motifs autocatalytiques sont également présents chez certains ARN satellites de virus de plantes. Ces ARN diffèrent des viroïdes du groupe A puisqu'ils sont dépendant [i.e. dépendants] de la présence d'un virus associé pour leur réplication et leur propagation. Les nombreuses similarités entre ces ARN satellites et les viroïdes suggèrent une origine évolutive commune (Branch et al., 1990). La méconnaissance de la biologie des viroïdes du groupe A est en grande partie attribuable au peu d'ampleur des recherches entreprises sur ces agents pathogènes. En 1994, on ne connaissait que deux espèces appartenant à ce groupe, soit ASBVd et PLMVd. Nous avons donc initié des études visant à mieux comprendre certains aspects de leur biologie moléculaire, tels le cycle de réplication et la localisation cellulaire. Nous avons utilisé PLMVd comme modèle d'étude. Cet ARN de 338 nucléotides possède des motifs hammerhead qui assurent l'autocoupure des brins multimériques (Hernandez et Flores, 1992). La caractérisation in vitro des mécanismes régissant l'autocoupure et l'autoligation (Côté et Perreault, 1997) permet d'interpréter les particularités du cycle de réplication de PLMVd observées in vivo. L'identification éventuelle d'autres hammerhead dans les banques de données et leur caractérisation promet d'apporter des informations intéressantes afin de mieux comprendre l'origine et l'évolution de ces agents pathogènes des plantes."--Résumé abrégé par UM