Prediction of a common structural scaffold for proteasome lid, COP9-signalosome and eIF3 complexes

BACKGROUND: The 'lid' subcomplex of the 26S proteasome and the COP9 signalosome (CSN complex) share a common architecture consisting of six subunits harbouring a so-called PCI domain (proteasome, CSN, eIF3) at their C-terminus, plus two subunits containing MPN domains (Mpr1/Pad1 N-terminal). The translation initiation complex eIF3 also contains PCI- and MPN-domain proteins, but seems to deviate from the 6+2 stoichiometry. Initially, the PCI domain was defined as the region of detectable sequence similarity between the components mentioned above. RESULTS: During an exhaustive bioinformatical analysis of proteasome components, we detected multiple instances of tetratrico-peptide repeats (TPR) in the N-terminal region of most PCI proteins, suggesting that their homology is not restricted to the PCI domain. We also detected a previously unrecognized PCI domain in the eIF3 component eIF3k, a protein whose 3D-structure has been determined recently. By using profile-guided alignment techniques, we show that the structural elements found in eIF3k are most likely conserved in all PCI proteins, resulting in a structural model for the canonical PCI domain. CONCLUSION: Our model predicts that the homology domain PCI is not a true domain in the structural sense but rather consists of two subdomains: a C-terminal 'winged helix' domain with a key role in PCI:PCI interaction, preceded by a helical repeat region. The TPR-like repeats detected in the N-terminal region of PCI proteins most likely form an uninterrupted extension of the repeats found within the PCI domain boundaries. This model allows an interpretation of several puzzling experimental results

The proteasome lid triggers COP9 signalosome activity during the transition of Saccharomyces cerevisiae cells into quiescence.

The class of Cullin–RING E3 ligases (CRLs) selectively ubiquitinate a large portion of proteins targeted for proteolysis by the 26S proteasome. Before degradation, ubiquitin molecules are removed from their conjugated proteins by deubiquitinating enzymes, a handful of which are associated with the proteasome. The CRL activity is triggered by modification of the Cullin subunit with the ubiquitin-like protein, NEDD8 (also known as Rub1 in Saccharomyces cerevisiae). Cullin modification is then reversed by hydrolytic action of the COP9 signalosome (CSN). As the NEDD8– Rub1 catalytic cycle is not essential for the viability of S. cerevisiae, this organism is a useful model system to study the alteration of Rub1–CRL conjugation patterns. In this study, we describe two distinct mutants of Rpn11, a proteasome-associated deubiquitinating enzyme, both of which exhibit a biochemical phenotype characterized by high accumulation of Rub1-modified Cdc53–Cullin1 (yCul1) upon entry into quiescence in S. cerevisiae. Further characterization revealed proteasome 19S-lid-associated deubiquitination activity that authorizes the hydrolysis of Rub1 from yCul1 by the CSN complex. Thus, our results suggest a negative feedback mechanism via proteasome capacity on upstream ubiquitinating enzymes

Structural Organization of the 19S Proteasome Lid: Insights from MS of Intact Complexes

The 26S proteasome contains a 19S regulatory particle that selects and unfolds ubiquitinated substrates for degradation in the 20S catalytic particle. To date there are no high-resolution structures of the 19S assembly, nor of the lid or base subcomplexes that constitute the 19S. Mass spectra of the intact lid complex from Saccharomyces cerevisiae show that eight of the nine subunits are present stoichiometrically and that a stable tetrameric subcomplex forms in solution. Application of tandem mass spectrometry to the intact lid complex reveals the subunit architecture, while the coupling of a cross-linking approach identifies further interaction partners. Taking together our results with previous analyses we are able to construct a comprehensive interaction map. In summary, our findings allow us to identify a scaffold for the assembly of the particle and to propose a regulatory mechanism that prevents exposure of the active site until assembly is complete. More generally, the results highlight the potential of mass spectrometry to add crucial insight into the structural organization of an endogenous, wild-type complex

The Translation Initiation Factor 3f (eIF3f) Exhibits a Deubiquitinase Activity Regulating Notch Activation

The translation initiation factor complex eIF3f has an intrinsic deubiquitinase activity and regulates the Notch signaling pathway

Phosphorylation dependent stability control of the deneddylase DenA and its impact on Aspergillus nidulans development

Zusammenfassung Ein fehlerhafter Proteinabbau führt in höheren Eukaryoten zu diversen Krankheiten wie z.B. neurodegenerativen Störungen und Krebs. Es ist daher bedeutend die Regulationsmechanismen des Proteinabbaus zu verstehen. Intrazelluläre Proteine werden spezifisch durch das Ubiquitin-Proteasome System abgebaut. Cullin-RING Ligasen, welche durch das ubiquitin-ähnliche Protein Nedd8 aktiviert werden, binden und markieren das Zielprotein mit Ubiquitin. Diese ubiquitinierten Proteine werden durch das 26S Proteasome abgebaut. Die zwei Deneddylasen DenA und COP9 Signalosome (CSN) entfernen Nedd8 von unterschiedlichen Substraten. Diese Arbeit zeigt im Modellorganismus Aspergillus nidulans, dass DenA aus einer Kernfraktion sowie einer dynamischen zytoplasmatischen Subpopulation besteht. Zudem wird (A) das Zusammenspiel zwischen DenA und CSN im Kern untersucht und (B) die bisher unbekannte Phosphatase DipA, welche an der Regulation des zytoplasmatischen DenA und an der Zelldifferenzierung beteiligt ist, charakterisiert. (A) Eine erhöhte DenA Konzentration kann teilweise das Fehlen eines aktiven CSN kompensieren, indem es der Akkumulation an neddylierten Proteinen und damit CSN assoziierten Entwicklungsstörungen entgegenwirkt. Beide pilzlichen Deneddylasen haben somit unterschiedliche aber auch überlappende Funktionen. Zusätzlich zeigt sich, dass die DenA Kernfraktion, welche mit dem CSN interagiert, in der pilzlichen Entwicklung durch fünf benachbarte CSN Untereinheiten destabilisiert wird. Da diese Untereinheiten eine funktionelle Oberfläche bilden ist anzunehmen, dass die Interaktion von DenA mit dieser Oberfläche wichtig für die Stabilitätskontrolle der DenA Kernsubpopulation ist. (B) Zytoplasmatisches DenA wird zusammen mit DipA transportiert und akkumuliert an den Septen. Fehlt DipA erhöht sich die DenA Stabilität. Somit spielt DipA eine wichtige Rolle in der zytoplasmatischen DenA Stabilitätskontrolle. Zusätzlich führt das Fehlen von DipA zu einer erhöhten Septenbildung und Defekten in der lichtabhängigen Zellentwicklung des Pilzes. DipA wird somit, neben der DenA Stabilitätskontrolle, für die Zelldifferenzierung benötigt. Die Stabilität der zwei DenA Subpopulationen wird zusätzlich durch Phosphorylierung reguliert. Während vegetativen Bedingungen wird DenA durch die Phosphorylierung von S243 und S245 stabilisiert, was für die Initiierung der nachfolgenden asexuellen Entwicklung wichtig ist. Anschließend wird DenA durch eine Änderung des Phosphorylierungsmusters destabilisiert und abgebaut. Zusammenfassend zeigt diese Studie Einblicke in komplexe Mechanismen des DenA Proteinabbaus, welche womöglich auch in höheren Eukaryoten relevant sind.Summary Malfunctioning protein degradation in higher eukaryotes is associated with numerous diseases, including neurodegenerative disorders and cancer. Understanding regulation mechanisms of protein degradation is thus of particular importance. The ubiquitin- proteasome system selectively degrades intracellular proteins. Cullin-RING ligases, activated by the ubiquitin-like protein Nedd8, recognize target proteins and mediate the transfer of ubiquitin onto the protein. Ubiquitinated proteins are recognized and degraded by the 26S proteasome. The two deneddylases DenA and COP9 signalosome (CSN) remove Nedd8 from different kinds of substrates. For the model organism Aspergillus nidulans, this study reveals that cellular DenA consists of a nuclear and a dynamic cytoplasmatic subpopulation. This study further provides (A) detailed information on the interplay between nuclear DenA and CSN, and (B) uncovers a hitherto uncharacterized phosphatase, DipA, which plays an important role in regulating cytoplasmatic DenA, as well as cell development. (A) An increased amount of DenA partially compensates the lack of a functional CSN. DenA counteracts the accumulation of neddylated proteins and CSN associated developmental defects. This suggests that both fungal deneddylases have different but also overlapping functions. Further, nuclear DenA physically interacts with CSN and is destabilized during fungal development by five of the eight CSN subunits. These subunits form a functional surface on the CSN, and interaction of DenA with this surface seems an important step in regulating the stability of nuclear DenA. (B) Cytoplasmatic DenA is co-transported with DipA and enriched at septa. Deletion of dipA results in increased DenA stability. This suggests that DipA destabilizes DenA and thus plays a role in cytoplasmatic DenA stability control. In addition, deletion of dipA impacts cell development, which manifests itself in an increased amount of septa and defects in light regulated fungal development. This indicates that - beyond DenA stability control - DipA is important for cell differentiation. The stability of DenA is further regulated via phosphorylation. During vegetative growth, DenA is stabilized by phosphorylation at positions S243 and S245, which is required for initiating subsequent asexual development. After this initiation a change in the phosphorylation pattern of DenA is observed, which destabilizes the protein and results in DenA degradation in later asexual development. In summary, this study provides insights into complex mechanisms of DenA protein degradation, which might also be relevant for higher eukaryotes.  

Structural and functional characterization of Rpn12 identifies residues required for Rpn10 proteasome incorporation

The ubiquitin–proteasome system targets selected proteins for degradation by the 26S proteasome. Rpn12 is an essential component of the 19S regulatory particle and plays a role in recruiting the extrinsic ubiquitin receptor Rpn10. In the present paper we report the crystal structure of Rpn12, a proteasomal PCI-domain-containing protein. The structure helps to define a core structural motif for the PCI domain and identifies potential sites through which Rpn12 might form protein–protein interactions. We demonstrate that mutating residues at one of these sites impairs Rpn12 binding to Rpn10 in vitro and reduces Rpn10 incorporation into proteasomes in vivo

The sumoylation and neddylation networks in Aspergillus nidulans development

Proteine können post-translational durch Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Proteine modifiziert werden. Dies erfordert die Aktivität dreier Enzyme. Das Protein wird durch ein E1 Enzym aktiviert, an ein E2 Enzym übertragen und im letzten Schritt mit der Hilfe von E3 Ligasen kovalent an das Substrat gebunden. Dieser Prozess der posttranslationalen Modifikation ist reversibel durch Isopeptidasen. Zu der Proteinfamilie gehören unter anderem Sumo und Nedd8. Beide Proteine sind im Modellorganismus Aspergillus nidulans konserviert. Während die Deletion des nedd8 Homologs neddH zum Zelltod führt, können Pilze ohne SumO überleben. Diese Stämme weisen jedoch Defekte in der sexuellen und asexuellen Entwicklung auf. In dieser Arbeit wurde die NeddH E3 Ligase DcnA/RbxA untersucht. DcnA interagierte mit der Neddylierungs-Maschinerie und die Deletion des Gens führte zu einer leichten Reduktion der Neddylierung von Cullinen. Diese verminderte Neddylierung hatte jedoch keine Auswirkungen auf die pilzliche Entwicklung unter Laborbedingungen. Das RING-finger Protein RbxA zeigt eine E3 Ligaseaktivität sowohl in der Ubiquitinierung als auch in der Neddylierung. Eine Deletion des betreffenden Gens führte zum Zelltod. In einer vorangegangenen Studie mit einem Stamm mit Defekt in der Isopeptidase CSN wurden Substratadaptoren des SCF Ubiquitin-E3-Ligase Komplexes (Fbox-Proteine) identifiziert. In dieser Arbeit wurde festgestellt, dass die biochemische Anreicherung von Fbox15 nicht auf eine generelle Stabilisierung des Proteins zurückzuführen ist, sondern wahrscheinlich auf eine Stabilisierung des SCF Komplexes mit Fbox15. Zusätzlich wurde der Prozess der Sumoylierung in A. nidulans untersucht. Unter normalen Wachstumsbedingungen ist nur ein kleiner Anteil der zellulären Proteine sumoyliert. Um diesen zu erhöhen, wurden die zwei SumO Isopeptidasen UlpA und UlpB untersucht. Durch biochemische Experimente im Wildtyp und einem Stamm, welchem die Isopeptidase UlpA fehlt, konnte ein komplexes SumO Netzwerk identifiziert werden. Zu diesem gehören neben den sumoylierenden Enzymen (E1, E2 und E3), Histon modifizierende Enzyme/Enzymkomplexe, andere Transkriptionsregulatoren, Proteine, die eine Rolle in der RNA-Reifung oder Stressantwort spielen, sowie Wechselwirkungen mit den Prozessen der Ubiquitinierung und Neddylierung. Eine wichtige Schnittstelle zwischen Sumoylierung und Histonmodifikation könnte hierbei der COMPASS Komplex sein. Dieser Komplex ist involviert in Histonmethylierung und damit in die Regulation der Transkription. Um ein besseres Verständnis für die Rolle des Komplexes in der Regulation der pilzlichen Entwicklung zu bekommen, wurde die Kerneinheit SetA deletiert. Der resultierende Stamm zeigte Defekte in der frühen sexuellen Entwicklung, im Koloniewachstum und Sekundärmetabolismus. SetA wurde als wichtiger Faktor für die richtige Positionierung der asexuellen Sporenträger identifiziert