A Novel Role for Stat1 in Phagosome Acidification and Natural Host Resistance to Intracellular Infection by Leishmania major

Intracellular parasites of the genus Leishmania generate severe diseases in humans, which are associated with a failure of the infected host to induce a protective interferon γ (IFNγ)-mediated immune response. We tested the role of the JAK/STAT1 signaling pathway in Leishmania pathogenesis by utilizing knockout mice lacking the signal transducer and activator of transcription 1 (Stat1) and derived macrophages. Unexpectedly, infection of Stat1-deficient macrophages in vitro with promastigotes from Leishmania major and attenuated LPG1 knockout mutants (lpg−) specifically lacking lipophosphoglycan (LPG) resulted in a twofold increased intracellular growth, which was independent of IFNγ and associated with a substantial increase in phagosomal pH. Phagosomes in Stat1−/− macrophages showed normal maturation as judged by the accumulation of the lysosomal marker protein rab7, and provided normal vATPase activity, but were defective in the anion conductive pathway required for full vesicular acidification. Our results suggest a role of acidic pH in the control of intracellular Leishmania growth early during infection and identify for the first time an unexpected role of Stat1 in natural anti-microbial resistance independent from its function as IFNγ-induced signal transducer. This novel Stat1 function may have important implications to studies of other pathogens, as the acidic phagolysosomal pH plays an important role in antigen processing and the uncoating process of many viruses

The links between membrane actin assembly by mycobacterial phagosomes and phagosome maturation, macrophage activation and pathogen killing

Tese de doutoramento em Farmácia (Biologia e Genética Molecular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Farmácia, 2008A infecção pelo Mycobacterium tuberculosis e por outra micobactérias pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC) é eficazmente controlada pelo sistema imunitário do hospedeiro em 90% dos casos. Contudo, embora os mediadores do sistema imunitário envolvidos neste processo estejam devidamente identificados e se saiba que o IFN desempenha um papel central é dificíl prever o desfecho de umainfecção por micobactérias. Por esta razão é premente estudar a interacçãomicobactéria-hospedeiro ao nível molecular de forma a identificar potenciais alvosterapêuticos para o controlo da tuberculose.As micobactérias são microrganismos intracelulares facultativos que sobrevivem nosmacrófagos alveolares ao nível dos fagossomas. Os macrófagos são células fagocíticasprofissionais com capacidade para eliminar invasores através da resposta imune inata.Esta inclui mecanismos como a produção de espécies radicalares de oxigénio e azoto, amaturação do fagossoma em fagolisossoma, produção de quimiocinas e a apresentaçãode antigénios micobacterianos ao sistema imunitário que resulta no desenvolvimento deuma imunidade adaptativa. As micobactérias patogénicas não só forçam a sua entradanos macrófagos como são capazes de persistir intracelularmente resistindo aos váriosmecanismos bactericidas dos macrófagos. A inibição da maturação do fagossoma emfagolisossoma pelas micobactérias patogénicas é apontada, à mais de três décadas,como a principal razão para o sucesso destes patogenes.Uma vez que a capacidade de subverter os mecanismos bactericidas dos macrófagos écaracterística das micobactérias patogénicas iniciamos este estudo com um parentedistante do M. tuberculosis, o M. smegmatis. Nesta parte do trabalho pretendemosidentificar os mecanismos bactericidas do macrófago activados por uma micobactérianão patogénica no decorrer da infecção que resultam na eliminação da mesma.Utilizando macrófagos de ratinho (J774 e BMM) verificamos que o M. smegmatisapresenta um perfil de sobrevivência intermédio entre o de uma micobactérias decrescimento lento como o M. tuberculosis e o apresentado por bactérias de crescimentorápido como a E. coli ou o Streptococcus. Estas últimas são eliminadas pelosmacrófagos em 4 h, enquanto que o M. smegmatis sobrevive intracelularmente até 48 hapresentando mesmo ciclos de multiplicação intracelular.viiPara verificar se este perfil de sobrevivência se deve apenas à micobactéria ou se ohospedeiro também desempenha um papel importante no desfecho da infecção usámosmacrófagos de vários hospedeiros . Em macrófagos de ratinho Raw e em macrófagosisolados do sangue periférico de voluntários saudáveis (HMDM) verificamos que o M.smegmatis era eliminado de uma forma contínua ao longo de 48 h.Assim, tomando partido da capacidade de replicação de M. smegmatis em J774 e dasvantagens técnicas proporcionadas por uma linha celular de rato iniciámos umaabordagem sitemática dos mecanismos envolvidos na eliminação desta micobactérianão patogénica de crescimento rápido pelos macrófagos ao longo de 24 h.O sistema estudado revelou-se extremamente dinâmico envolvendo um período inicialde morte (1-4 h), seguido de um período de replicação (4-8 h) e dois períodos de morte(8-12 h e 12-24 h). A síntese de óxido nítrico (NO) constitui o primeiro mecanismo dedefesa dos macrófagos mas a sua acção está circunscrita à primeira fase de morte. Aorganização de uma rede de actina e a fusão com organelos endocíticos tardioscoincidem com a primeira e última fase de morte. A reciclagem de marcadores de fasefluida e membranar do fagossoma coincidem com a fase de replicação micobacteriana(4-8 h). A acidificação e a aquisição de sub-unidades da bomba protónica (V-ATPase)pelo fagossoma apresentam um perfil diferente e coincidente com as fases tardias demorte. Além do mais, a colocalização da V-ATPase não é coincidente com a dosmarcadores característicos de endossomas tardios e lisosomas. A MAP cinase p38 écrucial para a regulação de todos os processos investigados, excepto a produção de NO,funcionando alternadamente a favor do hospedeiro ou do patogene. Um modelomatemático suporta a hipótese de que períodos alternados de actividade bactericida dacélula são mais eficazes para a elimição total de parasitas intracelulares do que umaactividade contínua.Umas vez definidos os perfis de sobrevivência/ morte intracelular de uma micobactérianão patogénica de crescimento rápido resolvemos estender a mesma abordagem amicobactérias de crescimento lento avirulentas (Mycobacterium bovis BCG) ouvirulentas (M. bovis). Neste estudo foram utilizados macrófagos de ratinho (J774, Raw eBMM) e de dois hospedeiros naturais de M. bovis. Os macrófagos humanos utilizadosforam isolados a partir do sangue periférico ou da linha celular THP-1. Os macrófagosde bovino foram isolados a partir do sangue periférico de animais saudáveis (BMDM).O estudo dos perfis de sobrevivência demonstrou que o BCG é eliminado de uma formaviiicontínua em todos os macrófagos excepto nos HMDM onde após um ciclo de replicaçãoatinge um estádio estacionário ao fim de 3 dias de infecção. Os perfis de sobrevivênciaobservados para o M. bovis são distintos dos do BCG. A micobactéria virulentapermanece num estado de latência ou consegue replicar-se activamente em todos osmacrófagos estudados. Em nenhum dos casos se observou a eliminação destamicobactéria pelos macrófagos.Os macrófagos de ratinho J774 e os HMDM foram escolhidos para a realização deestudos mais detalhados. A nossa escolha recaiu nestas células porque apresentamperfis de sobrevivência distintos para as duas micobactérias utilizadas. O facto de seremde hospedeiros distintos (rato e Homem) permitiu avaliar a importância do hospedeirono desfecho da infecção.A produção de NO pelos macrófagos de ratinho desempenha um papel importante nocontrolo das infecções por estas micobactérias. À semelhança do anteriormenteobservado com M. smegmatis, a acção do NO e dos radicais reactivos de azoto (RNI)está limitada aos estádios precoces da infecção (3h-3dias) embora seja possível detectara produção de NO até ao sétimo dia de infecção. Em nenhum momento da infecção foipossível detectar uma associação entre a membrana do fagossoma micobacteriano e asintetase inductível do óxido nítrico (iNOS).Nas células humanas não foi possível detectar a produção de NO ao longo da infecção oque pode, pelo menos parcialmente, explicar a diferença observada nos perfis desobrevivência.As micobactérias patogénicas são conhecidas por bloquearem a fusão do fagossomacom o lisossoma evitando desta forma a exposição a alguns dos agentes bactericidasmais potentes do macrófago. Por esta razão, a acidificação do fagossoma contendoM.bovis spp e a sua fusão com vesículas endocíticas tardias e/ou lisossomas foi seguidaao longo de 7 dias. Os resultados obtidos demonstram que as duas micobactérias sãocapazes de interferir com a maturação do fagossoma. O fagossoma micobacteriano nãoadquire marcadores de maturação de fase tardia como a V-ATPase ou o ácido liso-bisfosfatídico(LBPA), não acidifica o suficiente para acumular o corante acidotrópicolysotracker ou fundir com endossomas tardios e/ou lisossomas. Contudo, o maissurpreendente nestes resultados é o facto de duas micobactérias com perfis desobrevivência distintos apresentarem perfis de aquisição de marcadores de maturaçãosemelhantes. Embora, não nos seja possível apresentar evidências experimentaisdirectas uma diferente sensibilidade das duas estirpes de micobactérias à acção deixefectores como os RNI e o hidrogenião podem explicar estes resultados. In vitro aestirpe virulenta de M. bovis revelou ser mais resistente à acção do pH ácido e do NO doque o BCG. A realização de estudos em culturas de macrófagos com inibidores dabomba protónica e da iNOS confirmaram os resultados obtidos in vitro.A última parte do trabalho consistiu na modulação da resposta inflamatória dosmacrófagos e no estudo do seu impacto nas infeções por micobactérias. A modulação dosistema foi efectuada através da adição de lípidos. A nossa escolha recaiu sobre estassubstâncias porque (i) existem estudos epidemiológicos que suportam a associação entreuma dieta rica em lípidos omega-3 e uma elevada incidência de tuberculose, (ii) estudosanteriores em culturas celulares infectadas com o bacilo da tuberculose demonstraramque o tratamento com estes lípidos provocam efeitos semelhantes, (iii) os lípidos sãoimportantes para a regulação da nucleação da actina e consequentemente para amaturação do fagossoma em fagolisossoma.O tratamento das culturas de macrófagos com ácido eicosopentaenoico (EPA), ácidoaraquidónico (AA) e ceramida (Cer) produziram efeitos distintos. O lípido omega-3(EPA) estimula a sobrevivência do bacilo da tuberculose enquanto que o omega-6 (AA)e a ceramida exercem o efeito contrário. A ceramida foi incluída neste estudo por estarintimamente ligada com as vias biosintéticas do AA.A MAP cinase p38 é importante na sinalização pró-inflamatária durante as infecções bacterianas. Neste contexto resolvemos estudar o efeito dos diferentes lípidos na actividade desta cinase. Uma vez mais o EPA apresentou efeitos distintos do AA e da ceramida. O primeiro lípido não estimula a activação da p38 ao contrário do AA e da ceramida. A infecção das culturas de macrófagos com o bacilo da tuberculose alteraradicalmente a sinalização para a p38. O bacilo é capaz de bloquear a activação destacinase nos estádios precNon pathogenic mycobacteria are cleared from macrophages within 24 - 48 h while pathogenic mycobacteria can persist in the same cells for long periods of time. Using the non-pathogenic fast growing Mycobacterium smegmatis and two slow growing mycobacteria with distinct virulence (M. bovis BCG Pasteur and M. bovis) we start a systematic study to elucidate the role of different killing mechanisms during mycobacteria infection. Although all mycobacteria reside in phagosomes the acquisition of maturation markers were distinct for M. smegmatis and M. bovis spp. Thus different mycobacteria live and are killed in distinct compartments. Nevertheless, macrophage control of mycobacteria infections seems to follow a well established program where different killing mechanisms play a role at different times of infection. NO production is the first killing mechanism involved then phagossome maturation resulting in acidification of phagosome content and acquisition of lysosomal enzymes are also involved. Since inhibition of phagosome maturation plays a central role in mycobacteria pathogenesis we try to identify key regulators of this process. Previous studies shown that actin nucleation plays an important role in this process. In the present study we provide evidence that MAP kinase p38, a central player in the pro-inflamatory response to bacteria infection, regulates actin assembly by non-pathogenic mycobacteria containing phagosomes at early stages of infection. This kinase is a key regulator of all killing mechanisms except NO production. In the last part of the work we studied the modulation of the host defense mechanism by lipid treatment. This approach is supported by (i) the well established link between particular diets and tuberculosis incidence and (ii) recent results by Anes group showing that omega-3 and omega-6 lipids had opposite effects in M. tuberculosis survival in macrophages mediated probably by their ability to regulate actin nucleation and phagosome maturation. At the macrophage level, in general, the effects of Cer and/or AA were opposite to those of EPA, but in many infection stages these pro- and anti-inflammatory lipids were capable of reversing the signalling states between killing and survival. The effects of Cer and EPA were in part regulated by p38 MAP Kinase. These results argue against the idea of considering a simple recommended lipid-based diet against mycobacteria.Fundação para a Ciência e Tecnologia (Projectos: FEDER POCTI/BCI/38983/2001; POCI/BIABCM/55327/2004 e bolsa de doutoramento SFRH / BD / 14284 /2003

Synthetic pathogens for integrated biophysical and genetic dissection of antigen cross-presentation

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010The study of host-pathogen interactions is crucial to unveil the diversity of the immune response outcome. Dendritic Cells (DCs) play a central role in the initiation and regulation of T-Cell immunity, functioning as master switches that control whether the outcome of antigen presentation results in tolerance, or immunity. Antigen cross-presentation is a necessary mechanism to generate immunity against tumors, bacteria and viruses. In addition, it is extremely important to induce cytotoxic immunity by vaccination with antigens. Moreover, particulate antigens have been used in vaccine design tools as a platform to deliver different types of signals and in the modulation of DC-dependent immune responses. DCs express a series of different receptors that mediate the transfer of signals from the environment. Among them, Toll-Like Receptors (TLRs) play a critical role in the early innate immune response to invading pathogens. These receptors have the ability to recognize a broad range of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), turning them, key receptors in distinguishing between self/non-self antigens. The precise mechanisms underlying the crosstalk between TLRs and antigen presentation are not entirely understood. Therefore, the main goal of this project is to understand how TLR agonists coupled to particulate antigens influence antigen cross-presentation. In our studies, we have used newly synthesized particle antigens, denominated as 'synthetic pathogens', coupled with a model antigen (Ovalbumin - OVA), and/or a model ligand (TLR agonist). These particle platforms have distinct, well-defined physical and biochemical properties, and function as a novel approach to elucidate the intrinsic mechanism(s) of antigen cross-presentation. In addition, they represent a valuable and powerful tool, which might be explored for therapy applications. TLR4 is unique among TLRs as it can signal through both MyD88 and TRIF adaptors upon LPS stimulation, but mainly by the TRIF pathway when LipidA is the agonist. Our results revealed that when LPS is in the same cargo as the particle antigen, it impairs antigen cross-presentation and dictates a shift to MHC class- II presentation. This antigen cross-presentation abolishment is recovered on TLR4 deficient DCs and in the presence of the p38 MAPK pathway inhibitor, but not in the absence of the MyD88 adaptor. Moreover, LipidA reproduces the same phenotype as LPS, implicating the TLR4/TRIF-mediated signaling on particulate antigen cross-presentation impairment. Thus, here we describe a new mechanism of antigen selection in DCs for antigen cross-presentation that is dependent on the antigen based-environment. We show that the efficiency of presenting antigens from phagocytosed cargo is dependent on the presence of TLR ligands within the cargo. The influence of the compartmentalization on the crosstalk between the TLR-signaling and the antigen cross-presentation pathway(s), may constitute a tool used by DCs in order to discriminate the contents of phagosomes and present an appropriate immune response to specific stimuli. Therefore, DCs may have the “capacity” to decide which kind of destiny an antigen should have depending on the type and origin of the stimuli. In order to dissect the mechanisms behind the cross-presentation phenotype, we have addressed the role of particle LPS on several antigen presentation key steps. Our data show that LPS-containing phagosomes enhance phagosome maturation (higher levels of colocalization with lysosomes) characterized by higher rates of phagosomal acidification and a decrease of phagosomal reactive oxygen species (ROS) production. The induction of phagosome maturation mediated by LPS signaling seems to shut down the machinery for antigen release into the cytosol, where the epitopes for MHC class-I are predominantly generated by the proteasome. Moreover, lower levels of antigen degradation occur when LPS is in the same cargo as antigen, mainly in a proteasome-dependent manner. This phenotype mediated by particulate LPS stimulus seems to be related with lower levels of particle antigen cross-presentation. Therefore, we propose that antigen cross-presentation is enhanced during the brief period of time when phagosomal acidification is “sustained” and an immature phenotype is predominant, where endoplasmic reticulum machinery important for MHC class-I presentation probably is available. In addition this phenotype allows antigen escape into cytosol and the generation of epitopes for MHC class-I by the proteasome. On the other hand, antigen cross-presentation is impaired when a stimulus that induces phagosome maturation/acidification is in the same cargo as the antigen, producing a mature phenotype, allowing the generation of epitopes on the endocytic pathway that is compromised for MHC class-II antigen presentation. In order to address if the abolishment on antigen cross-presentation phenotype is transversal to others TLRs, studies were extended using different TLR specific agonists. When particle antigen contains TLR agonists that preferentially signal through MAPK/NF-kB pathways, antigen cross-presentation is induced. In contrast, in the presence of TLR agonists that preferentially signals through IFN-Type I pathway, particle antigen cross-presentation is inhibited. Therefore, a signaling pathway correlation may exist in the outcome of antigen presentation pathway(s) mediated by TLR agonist-containing particle antigens. In sum, this work shows for the first time the inhibitory effect of TLR4 signaling on cross-presentation when agonists are delivered in the same cargo as particulate antigen. This phenotype is likely to be mediated by TRIF-dependent signaling, mainly by p38 MAPK activation. This knowledge could have a major impact in the dissection of the antigen cross-presentation mechanism, which will be highly valuable for novel vaccine design inducing T-Cell responses of the desired type and specificity.O estudo das interações patogénio-hospedeiro é fundamental para a compreensão da diversidade da resposta imunitária e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. As células dendríticas (DCs) desempenham um papel central na iniciação e regulação da imunidade mediada por linfócitos T, funcionando como “interruptores”, que podem originar uma resposta de tolerância ou imunidade em relação a um determinado antigénio. O mecanismo de cross-presentation de antigénios tem sido descrito como necessário para gerar imunidade contra tumores, bactérias e vírus, e fudamental na indução de imunidade citotóxica mediada por vacinação. Por outro lado, os antigénios particulados têm sido utilizados como ferramentas no design de vacinas, possibilitando uma plataforma na qual se podem integrar diferentes tipos de estímulos. As DCs expressam uma diversidade de receptores à superficie, o que permite uma detecção e transmissão eficazes dos vários tipos de “sinais” do meio ambiente. Entre eles, os Toll-Like Receptors (TLRs) desempenham um papel crucial, na resposta imune inata contra patogénios invasores. Estes receptores têm a capacidade de reconhecer uma ampla gama de padrões moleculares associados a patogénios (PAMPs), implicando-os como receptores-chave na distinção entre antigénios próprios e não-próprios. O mecanismo subjacente à crosstalk entre TLRs e a apresentação de antigénios não é totalmente conhecido. Por isso, um dos principais objetivos do meu trabalho foi compreender como é que os agonistas dos TLRs no mesmo contexto que antigénios particulados, influenciam a sua cross-presentation. Neste projecto foram utilizadas partículas sintéticas – designadas por synthetic pathogens - na presença de um antigénio modelo (Ovalbumina) e/ou de um ligando (agonista dos TLRs). Estas plataformas têm propriedades físicas e bioquímicas distintas e bem definidas, pelo que funcionam como uma nova abordagem para dissecar o mecanismo de cross-presentation de antigénios, bem como explorar o seu potencial para utilizaçao nas mais diversas terapias. Os resultados demonstram que quando o Lipopolissacarídeo (LPS - agonista do TLR4) está presente no mesmo contexto que as partículas contendo o antigénio, ocorre uma redução nos níveis de cross-presentation de antigénios. Este fenótipo é acompanhado por uma mudança na via de apresentação de antigénios para MHC classe- II, que é induzida quando comparada com as partículas só com o antigénio. Este mecanismo foi demonstrado como sendo mediado pelo TLR4, onde a cross-presentation de antigénios é restabelecida em DCs deficientes nesse receptor . A origem física dos estímulos (partícula vs solúvel) parece ser crucial para a regulação da via de cross-presentation de antigénios. Quando o LPS solúvel é co-incubado com partículas contendo o antigénio (dois estímulos físicos diferentes), verifica-se um aumento da activação/proliferação de células T em ambos os contextos de apresentação de antigénios - MHC classe-I e MHC classe -II. No entanto, quando o LPS é utilizado numa partícula diferente daquela que contém o antigénio, não se verificam diferenças significativas na eficiência das duas vias. A influência da compartimentação no crosstalk entre a sinalização mediada pelos TLR e a via de cross-presentation de antigénios, pode constituir uma ferramenta importante que as DCs utilizam para discriminar o conteúdo dos fagossomas e iniciar uma resposta imune apropriada aos estímulos específicos. Esta observação é de extrema importância para compreender o papel de estímulos "patogénicos" no destino da apresentação de antigénios. Com o objectivo de compreender o mecanismo adjacente ao fenótipo observado da via da cross-presentation de antigénios particulados, o papel da activação do TLR4 foi estudado em vários processos importantes na apresentação de antigénios. Os resultados obtidos indicam que fagossomas que contêm LPS têm uma indução na maturação (níveis mais elevados de colocalização com lisossomas), caracterizada por taxas mais elevadas de acidificação e uma diminuição da produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS). A indução da maturação dos fagossomas mediada pela sinalização por LPS parece bloquear o mecanismo de libertação do antigénio dos fagossomas para o citosol, onde os epítopos para a apresentação em MHC classe -I são predominantemente gerados pelo proteassoma. Para além disso, níveis mais baixos de degradação do antigénio, mediada principalmente pelo proteassoma, ocorrem quando o LPS está no mesmo contexto. Este fenótipo é devido à sinalização mediada pelo LPS e parece estar relacionado com níveis baixos de cross-presentation do antigénio particulado. Posto isto, sugerimos que a cross-presentation de antigénios é reforçada durante um breve período de tempo quando o pH dos fagossomas é mantido em valores próximos do estado basal, onde um fenótipo imaturo é predominante. Este estado imaturo é caracterizado pela existência de componentes do retículo endoplasmático (ER) importantes para a apresentação em MHC classe-I, permitindo o escape do antigénio para o citoplasma, onde os epítopos podem então ser gerados pelo proteassoma e apresentados no contexto MHC classe-I à superfície. Por outro lado, a cross-presentation de antigénios é diminuída quando um estímulo que induz a maturação dos fagossomas que contem o antigénio está no mesmo contexto. A formação de fagolisossomas leva à rápida acidificação e produz um fenótipo maduro, permitindo a geração de epítopos na via endocítica que é direccionada para a via MHC classe-II de apresentação de antigénios. O TLR4 é singular entre os TLRs, uma vez que pode sinalizar tanto pelo adaptador MyD88 ou pelo TRIF quando estimulado por LPS, mas preferencialmente pelo adaptador TRIF quando LipidA é o agonista. Com o objectivo de estudar o impacto da sinalização do TLR4 na via de cross- presentation dos antigénios particulados, o LipidA foi utilizado no mesmo contexto que o antigénio particulado. Observou-se uma reprodução do fenótipo de supressão da via de cross-presentation de antigénios obtido na presença do LPS. Além disso, a cross-presentation de antigénios particulados na presença de LPS não foi recuperada usando DCs deficientes no adaptador MyD88, ao contrário do que acontece quando se usa DCs deficientes no TLR4 e na presença de inibidores de activação da via das MAPK, principalmente a p38 MAPK. Estes resultados implicam a via TLR4/TRIF na inibição da cross-presentation de antigénios. Com o objectivo de verificar se o efeito inibitório na via de cross-presentation de antigénios é transversal aos outros TLRs, os estudos foram alargados usando agonistas dos diversos TLRs no mesmo contexto que as partículas de antigénio. Verificou-se que, os agonistas dos TLR que sinalizam preferencialmente através da via MAPK/NF-kB induzem a cross-presentation de antigénios particulados. Em oposição, os agonistas dos TLR que sinalizam preferencialmente através da via do IFN Tipo-I, levam à inibição da cross-presentation destes antigénios. O TLR4 pode sinalizar através dos dois adaptadores (MyD88 e TRIF) em diferentes localizações, sendo preferencialmente via TRIF quando o TLR4 é internalizado nos endossomas. A inibição da via de cross-preserntation de antigénios mediada pelo LPS quando no mesmo contexto que o antigénio particulado, poderia indicar que o LPS em partículas sinaliza preferencialmente através da via TRIF, quando estas são internalizadas. Esta observação corrobora os dados obtidos com os outros agonistas de TLR que preferencialmente sinalizam através da via do IFN Tipo-I, como é o caso do TLR3, do TLR7 e do TLR9, que estão localizados em endossomas. Conclui-se assim que os vários TLRs estão envolvidos em mecanismos diferentes que levam a efeitos distintos nas vias de apresentação de antigénios. Além disso, um padrão da via de cross-presentation de antigénios parece existir mediado por partículas contendo os vários agonistas dos diferentes TLRs. Em colaboração com o grupo do Prof. Darrell Irvine do MIT, pretendemos alargar estes estudos para outras plataformas de antigénios. Partículas de poli(ácido lático-co-ácido glicólico), PLGA, e hidrogel têm sido usadas como plataforma para administrar drogas, assim como em aplicações de biomateriais e concepção de vacinas. De acordo com os dados obtidos para a plataforma “fixa” de antigénios (partículas utilizadas nos ensaios anteriores), o LipidA no mesmo contexto que o antigénio particulado inviabiliza a via de cross-presentation de antigénios, comprovando a sua acção como um inibidor de sinalização mediada pelo TLR4, por um mecanismo dependente do adaptador TRIF. Assim, podemos concluir que mesmo na presença de partículas com propriedades distintas, a via mediada pelo adaptador TRIF tem um papel importante na inibição da via de cross-presentation de antigénios quando estimulada pelos agonistas do TLR4. Este trabalho mostrou pela primeira vez, o efeito inibitório da crosstalk entre a sinalização pelo TLR4 e a cross-presentation de antigénios quando os agonistas estão no mesmo contexto do antigénio particulado. Este fenótipo é susceptível de ser mediado pela via TLR4/TRIF, principalmente através da activação da via p38 MAPK. Estes resultados podem ter assim um impacto deveras importante na dissecção do mecanismo de cross-presentation de antigénios, assim como na concepção de novos protocolos de vacinação e na indução de respostas específicas mediadas por linfócitos T.O desenvolvimento e execução gráfica da presente dissertação foram financiados pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (Bolsa SFRH/BD/14316/2003

Identification of a Novel Mycobacterial Gene Involved in the Synthesis of a Phenolic Glycolipid and its Role in the Prevention of Phagosome Maturation

Pathogenic Mycobacteria persist in an early endosome-like compartment by interfering with late endosomal fusion mediating factors. Studies have unraveled some of the mechanisms employed by mycobacteria to create a niche for themselves in macrophages, but it is widely accepted that they possess an arsenal of weapons to impede phagosome genesis. M. marinum has gained importance in recent years, as a model organism to study mycobacterial pathogenesis due to its phylogenetic closeness to M. tuberculosis. The infection it causes in its natural hosts display characteristic features of tuberculosis, exhibiting blocking of phagosome maturation and granuloma formation. To gain insight into the genes required for the inhibition of phagosome maturation, M. marinum transposon mutant library representing knock outs covering the entire genome was sifted for mutants defective in inhibiting phagosome maturation by designing an elegant screen, which employs magnetic separation. In this process we identified a number of mutants unable to inhibit phagosome maturation and characterised in detail one of these mutants (mutant P1). The colony morphology and sequence analysis revealed that the interrupted gene of mutant P1 (pmiA) is likely to be involved in lipid metabolism. The mutant also had a reduced intracellular survival as inferred from the in vitro bacterial survival experiments in HMDM and using mice as an in vivo model. The mutant completely reverted to its wild-type phenotype when complemented with the respective gene from wild-type M. marinum. Thin layer chromatography on the lipids isolated from the mutant showed that the disruption of the gene pmiA in mutant P1 leads to the loss of a glycolipid of the outer envelope of M. marinum (Robinson N et al., Infect Immun. 2007 Feb;75(2):581-91). The missing glycolipid was further characterised to be a phenolic glycolicpid (PGL) using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. In order to prove that the lipid is capable of inhibiting phagosome maturation, it was extracted from wild-type M. marinum, coated on to hydrophobic beads and chased into human monocyte derived macrophages (HMDM). Characterising the phagosomes containing the beads by western blot analysis and immunofluorescence microscopy proved the lipid to be a key molecule employed by virulent mycobacteria to inhibit phagosome maturation. Phagosomes were characterised employing an efficient adenoviral transfection system harbouring Rab-GFP fusion proteins to transfect primary phagocytes. This transfection system enables phagosome maturation to be studied efficiently by fluorescence microscopy in live cells, in contrast to immunostaining which can be performed only on fixed cells. The gene pmiA involved in the biosynthesis of the phenolic glycolipid shows little homology with the gene sequences available through genome databases. It also does not display any signature sequences of proteins with known functions. Therefore, an attempt was made to study its interacting proteins by using Histidine-tag pull down assay. Proteins interacting with pmiA were analyzed by mass spectrometry. A methyl transferase and an isocitrate lyase, both enzymes critically involved in lipid biosynthesis were found to interact with pmiA. Our results prove that genes involved in the synthesis of this phenolic glycolipid are ideal pharmacological targets to design drug interventions against tuberculosis

The intracellular behaviour of Burkholderia cenocepacia in murine macrophages

Burkholderia cenocepacia is an opportunistic pathogen causing life-threatening infections in cystic fibrosis and other immunocompromised patients. The bacterium survives within macrophages by interfering with typical endocytic trafficking, resulting in delayed maturation of a B. cenocepacia-containing phagosome. We hypothesize that B. cenocepacia alters gene expression after internalization by macrophages, inducing genes involved in intracellular survival and host adaptation. Furthermore, we hypothesize that specialized bacterial secretion systems are involved in the interactions between intracellular bacteria and macrophages. In this work, we characterize later-stage infection of macrophages by B. cenocepacia, showing replication within an acidified endosomal compartment suggestive of a phagolysosome. We examine differential gene expression by intracellular B. cenocepacia using selective capture of transcribed sequences (SCOTS) with both competitive enrichment and microarray analysis. We identified 766 genes differentially regulated in intracellular bacteria, of which 329 were induced and 437 repressed. Affected genes are involved in all aspects of cellular life, including information storage and processing, cellular processes and signalling, and metabolism; in general, intracellular gene expression demonstrates a pattern of environmental sensing, bacterial response, and metabolic adaptation to the phagosomal environment. Deletion of various SCOTS-identified genes affects B. cenocepacia entry into macrophages and intracellular replication, as well as host-directed cytotoxicity and spread to neighbouring cells. Expression of secretion system genes is differentially-regulated by intracellular B. cenocepacia. Although none of the five major secretion systems are essential for growth in culture, we show that bacterial secretion systems are involved in macrophage entry, intracellular replication, and host-directed cytotoxicity. Type IV secretion systems play a role in early interactions with macrophages, while type II and IV secretion systems contribute to post-internalization intracellular replication and host-directed cytotoxicity. As a whole, secretion systems appear to increase pathogenicity in macrophages while limiting the spread of B. cenocepacia infection. Together, these studies advance our understanding of the intracellular behaviour of B. cenocepacia in macrophages. Further investigation into the remaining SCOTS-identified genes, as well as putative secreted effectors, will provide a better understanding of the adaptive responses of intracellular B. cenocepacia, leading to life in a phagosomal niche and host cell cytotoxicity

In fungal intracellular pathogenesis, form determines fate

For pathogenic microbes to survive ingestion by macrophages, they must subvert powerful microbicidal mechanisms within the phagolysosome. After ingestion, Candida albicans undergoes a morphological transition producing hyphae, while the surrounding phagosome exhibits a loss of phagosomal acidity.For pathogenic microbes to survive ingestion by macrophages, they must subvert powerful microbicidal mechanisms within the phagolysosome. After ingestion, Candida albicans undergoes a morphological transition producing hyphae, while the surrounding phagosome exhibits a loss of phagosomal acidity. However, how these two events are related has remained enigmatic. Now Westman et al. (mBio 9:e01226-18, 2018, https://doi.org/10.1128/mBio.01226-18) report that phagosomal neutralization results from disruption of phagosomal membrane integrity by the enlarging hyphae, directly implicating the morphological transition in physical damage that promotes intracellular survival. The C. albicans intracellular strategy shows parallels with another fungal pathogen, Cryptococcus neoformans, where a morphological changed involving capsular enlargement intracellularly is associated with loss of membrane integrity and death of the host cell. These similarities among distantly related pathogenic fungi suggest that morphological transitions that are common in fungi directly affect the outcome of the fungal cell-macrophage interaction. For this class of organisms, form determines fate in the intracellular environment

The Role of FcRn in Antigen Presentation

Immunoglobulins are unique molecules capable of simultaneously recognizing a diverse array of antigens and themselves being recognized by a broad array of receptors. The abundance specifically of the IgG subclass and the variety of signaling receptors to which it binds render this an important immunomodulatory molecule. In addition to the classical Fcγ receptors that bind IgG at the cell surface, the neonatal Fc receptor (FcRn) is a lifelong resident of the endolysosomal system of most hematopoietic cells where it determines the intracellular fate of both IgG and IgG-containing immune complexes (IgG IC). Cross-linking of FcRn by multivalent IgG IC within antigen presenting cells such as dendritic cells initiates specific mechanisms that result in trafficking of the antigen-bearing IgG IC into compartments from which the antigen can successfully be processed into peptide epitopes compatible with loading onto both major histocompatibility complex class I and II molecules. In turn, this enables the synchronous activation of both CD4+ and CD8+ T cell responses against the cognate antigen, thereby bridging the gap between the humoral and cellular branches of the adaptive immune response. Critically, FcRn-driven T cell priming is efficient at very low doses of antigen due to the exquisite sensitivity of the IgG-mediated antigen delivery system through which it operates. FcRn-mediated antigen presentation has important consequences in tissue compartments replete with IgG and serves not only to determine homeostatic immune activation at a variety of sites but also to induce inflammatory responses upon exposure to antigens perceived as foreign. Therapeutically targeting the pathway by which FcRn enables T cell activation in response to IgG IC is thus a highly attractive prospect not only for the treatment of diseases that are driven by immune complexes but also for manipulating local immune responses against defined antigens such as those present during infections and cancer