Estudio de lípidos aislados de microalgas y polifenoles en modelos inflamatorios de piel.

La piel es el principal órgano que actúa como defensa frente a agresiones externas, protegiendo al organismo de sustancias tóxicas, daño físico, e invasión por patógenos o radiaciones, suponiendo una pieza indispensable del sistema inmunológico. En este sentido, la perturbación de su estructura o función podría estar causada tanto por factores externos, como sustancias tóxicas o radiación ultravioleta (UV), o por factores internos, como pueden ser la predisposición genética, desórdenes inmunitarios u hormonales, o estrés. Como resultado de estas alteraciones, se puede desencadenar una respuesta inflamatoria, una disminución de la respuesta inmune o un daño oxidativo, entre otros. La exposición crónica de la piel a la luz UV induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como una respuesta inflamatoria, la cual juega un papel importante en el fotoenvejecimiento, en el desarrollo de lesiones pre-cancerosas, como la queratosis actínica, y en el cáncer de piel. Por otro lado, las enfermedades inflamatorias de la piel tienen un alto impacto en la calidad de vida de los pacientes; una de ellas es la psoriasis, enfermedad crónica mediada por el sistema inmune, de afectación predominantemente cutánea, cuya patogénesis no está clara aún. Hoy en día, las estrategias para la protección de la piel se centran en el uso de compuestos naturales para contrarrestar el estrés oxidativo y la inflamación. En los últimos años, las microalgas han emergido como fuente de compuestos bioactivos, incluyendo lípidos, proteínas, polisacáridos y carotenoides. Estos compuestos han atraído el interés de la industria farmacéutica y cosmética en base a sus actividades como antioxidantes, anti-inflamatorios y anti-carcinogénicos. En este estudio, hemos evaluado la actividad biológica de ciertos glicolípidos y el carotenoide fucoxantina, aislados de la especie Isochrysis galbana, así como del polifenol ácido rosmarínico, en diferentes modelos inflamatorios de piel tanto in vitro como in vivo, los cuales están desarrollados en los siguientes párrafos. En primer lugar, hemos evaluado la actividad citotóxica, antioxidante y fotoprotectora de diferentes glicolípidos aislados de la microalga Isochrysis galbana, empleando un modelo in vitro de queratinocitos humanos HaCaT irradiados con UVB. El pre-tratamiento de los queratinocitos con compuestos puros con estructuras de monogalactosil-monoacilgliceroles (MGMGs) y digalactosildiacildigliceroles (DGDGs), así como las fracciones ricas en monogalactosil-diasilgliceroles (MGDGs) o DGDGs redujeron significativamente el daño celular inducido por UVB, mediante la disminución de la liberación de LDH, ROS y la producción de IL-6. Este estudio preliminar nos permitió la selección de los compuestos más activos, que fueron la fracción de glicolípidos MGDG y el glicolípido puro MGMG-A, para su estudio posterior en modelos in vivo(Capítulo 1). En el primer modelo in vivo, se estudiaron la fracción MGDG y el glicolípido puro MGMG-A, en un modelo de hiperplasia epidérmica inducida TPA en ratones Swiss CD-1. Son numerosas las evidencias que muestran que la exposición de la piel a un activador de la proteína kinasa C, como es el 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), induce una respuesta pleiotrópica en el tejido, dando lugar al desarrollo de lesiones macroscópicas como descamación y eritema, lo cual se asemeja al fenotipo aparente de la psoriasis. En primer lugar, examinamos los efectos anti-inflamatorios de la aplicación tópica de MGDG y MGMG-A, disueltos en acetona (10 μg/μL, 200 μg por zona), comparándolos con la Dex como compuesto de referencia. Los tratamientos se aplicaron en un área delimitada de 1 cm2 en el dorso de los ratones y después de 30 minutos, se aplicó tópicamente el TPA (disuelto en acetona a 2 nmol por zona), en las mismas áreas durante 3 días. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con los glicolípidos disminuyó el edema, el espesor de la epidermis y la producción de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-17. Sin embargo, es sabido que la aplicación tópica de compuestos requiere una adecuada incorporación de las moléculas bioactivas en una fórmula que ofrezca estabilidad, que permita la permeación y que permanezca el suficiente tiempo en la piel. En este sentido, desarrollamos diferentes estudios de permeación in vitro, ex vivo e in vivo, para comparar el perfil de tres formulaciones diferentes (gel, pomada y crema). Los estudios in vitro y ex vivo se desarrollaron en células de Franz y se completaron con un estudio de permeabilidad in vivo, usando gel, pomada y crema con rodamina, lo que permitió evaluar la estabilidad de las formulaciones y las propiedades de permeación de las mismas a través de las capas de la piel. Los estudios de permeabilidad mostraron que la crema era la formulación con el mejor perfil de permeación. Por tanto, estos resultados nos llevaron a evaluar una crema que contenía la fracción MGDG (MGDG-crema) (0.2 % p/p), en el modelo de hiperplasia en ratón, comenzando esta vez el tratamiento 2 días antes de la primera aplicación de TPA. En concordancia con la actividad anti-inflamatoria demostrada in vitro con esta fracción, la aplicación de la crema disminuyó el edema provocado por el TPA, mejoró los daños histopatológicos y redujo el infiltrado celular. Cabe destacar que estos resultados fueron más significativos con la aplicación de la crema que con la fracción disuelta en acetona. Además, esta formulación inhibió la expresión epidérmica de COX-2 de manera similar, alcanzando niveles similares a la Dex. Por tanto, nuestros datos muestran por primera vez el efecto preventivo de los glicolípidos en patologías inflamatorias de la piel como la psoriasis y sugieren que la fracción formulada en crema podría ser una interesante estrategia terapéutica para el tratamiento de esta patología (Capítulo 2). El siguiente estudio nos condujo a la evaluación del efecto anti-inflamatorio, antioxidante y fotoprotector del carotenoide fucoxantina (FX) aislado de Isochrysis galbana en modelos tanto in vitro como in vivo. En primer lugar, la actividad anti-inflamatoria fue evaluada en macrófagos THP-1 estimulados con LPS y en queratinocitos HaCaT estimulados con TNF-α y la actividad antioxidante en queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (50 mJ/cm2). Nuestros resultados mostraron una disminución de las citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-6, así como un efecto protector de la FX, debido a la reducción de la producción intracelular de ROS y LDH. Estos datos nos llevaron a evaluar el posible efecto preventivo de la FX en dos modelos in vivo: un modelo de hiperplasia epidérmica inducida por TPA en ratones Swiss CD-1, y un modelo de eritema agudo inducido por UVB en ratones sin pelo SKH-1, expuestos a una irradiación de 360 mJ/cm2. Con el objeto de evitar los efectos negativos derivados del uso de disolventes como la acetona y de aumentar la permeabilidad de la FX a través de la piel, se formuló una crema que contenía el carotenoide (FX-crema) para su aplicación a los animales (0.2 % p/p). Los resultados del modelo de TPA mostraron que el pre-tratamiento con la FX-crema efectivamente mejoraba la hiperplasia en ratón inducida por TPA, reduciendo significativamente el edema de la piel, el espesor de la epidermis y la actividad de la MPO, así como la expresión epidérmica de los niveles de COX-2. Por otro lado, los datos obtenidos del modelo de exposición a UVB demostraron que la FX-crema reducía el eritema inducido por UVB en ratón, así como el edema y la actividad MPO. Además, la crema con el carotenoide inhibió la expresión de COX-2 en la piel expuesta a UVB, así como aumentó la expresión de la proteína antioxidante HO-1, a través de la regulación de la vía del Nrf2.Los resultados obtenidos en todos los estudios realizados con la FX sugieren que este carotenoide, vehiculizado en una formulación tópica para mejorar su permeación, podría suponer una estrategia novedosa para prevenir las exacerbaciones asociadas a la psoriasis y proteger a la piel de la radiación UV(Capítulo 3). En relación a los estudios con compuestos naturales, las plantas siguen siendo hoy en día uno de los campos más prometedores para el descubrimiento de nuevos compuestos que pueden conducir al desarrollo de fármacos. En este sentido, los polifenoles son uno de los grupos más estudiados; estos compuestos son metabolitos secundarios de las plantas y generalmente, participan en los mecanismos de defensa de éstas contra agresiones externas. Con más de 8.000 estructuras diferentes conocidas, tienen como base común la presencia de uno o más grupos fenólicos. La actividad anti radicales libres de esta familia de compuestos ha sido ampliamente descrita, de hecho son los antioxidantes más potentes que consumimos en nuestra dieta. Sin embargo, la investigación en torno a ciertas propiedades todavía continúa en desarrollo. En este sentido, la actividad antiinflamatoria es una de las más importantes. Por lo tanto, en nuestro siguiente estudio evaluamos el efecto de un compuesto polifenólico, el ácido rosmarínico (RA) en un modelo de psoriasis inducida por Imiquimod (IMQ). El IMQ es un agonista de los receptores Toll-like 7 y 8, cuya aplicación tópica en el dorso de ratones Balb/c durante 6 días, induce una inflamación acompañada de alteraciones típicas de la psoriasis. Debido a que la efectividad del RA aplicado por vía tópica puede ser limitada por su baja liposolubilidad y estabilidad, así como su facilidad para oxidarse o degradarse con la luz, hemos usado nanoliposomas (NL) para encapsular dicho polifenol. El pre-tratamiento tópico con RA en gel y RA encapsulado en NL disueltos en gel (ambos a 0.2 % p/p) 30 minutos antes de la aplicación del IMQ (62.5 mg por zona durante 6 días consecutivos) inhibió el daño macroscópico y el peso del punch obtenido de la piel afectada, sugiriendo la reducción del edema de la piel, la infiltración neutrofílica, la actividad de la MPO y la expresión de citocinas pro-inflamatorias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-17. El RA en gel mostró mejores resultados que el RA encapsulado en NL, esto podría ser debido a que la constante de disociación (pka) del RA a pH fisiológico afecta a la liberación de este compuesto desde los NL al medio celular, y consecuentemente, reduce su actividad biológica. En este sentido, al confirmar que la estructura química del RA influye en la actividad final de la formulación, sería necesaria una encapsulación específica para este tipo de compuestos. Contribuyendo con estos resultados al uso de estos sistemas en la industria farmacéutica, puesto que suponen una esperanzadora herramienta como sistemas de liberación de fármacos vía tópica, debido a su efectividad para favorecer la permeación y llevar el fármaco hasta ciertas zonas de la piel (Capítulo 4). Por último, evaluamos un posible sinergismo entre los principales compuestos empleados en esta tesis, FX y RA. Para ello, se ensayaron en un modelo de queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (100 mJ/cm2) con el objetivo de elucidar su mecanismo de acción y determinar si una mezcla de los mismos (5 μM de FX + 5 μM de RA) podría mejorar sus actividades biológicas. En este estudio se determinó la viabilidad celular, el ciclo celular, y la inducción de apoptosis, así como se evaluaron mediadores implicados en la activación del inflamasoma. La mezcla de estos compuestos demostró un mejor efecto fotoprotector y antioxidante que los compuestos por separado, disminuyendo la muerte celular, con el consecuente aumento de la viabilidad celular, y reduciendo la apoptosis y los niveles de ROS inducidos por la acción del UVB. Además, la mezcla moduló la respuesta inflamatoria disminuyendo la expresión de los componentes del inflamasoma como son el NLRP3 y ASC, y aumentando la expresión de los niveles de la proteína antioxidante HO-1, mediante la regulación de la vía del Nrf2(Capítulo 5). En conclusión, nuestros estudios in vitro e in vivo han demostrado los efectos beneficiosos de varios productos naturales, entre los que destaca la FX y el RA, en enfermedades de base inflamatoria, asociadas tanto a la exposición UVB como a patologías mediadas por el sistema inmune como la psoriasis. Sus mecanismos de acción podrían estar envueltos en la prevención del estrés oxidativo a través de la activación de la vía Nrf2 y la reducción de la inflamación mediante la regulación del inflamasoma y otras citocinas relacionadas con la vía del NF-κB. Por esta razón, estos compuestos podrían suponer moléculas prometedoras para su posible incorporación en productos para el cuidado de la piel como por ejemplo protectores solares, cremas anti-edad o regeneradoras, o formulaciones tópicas para el tratamiento de patologías inflamatorias como la psoriasis

The Tumor Suppressor PKCδ Is Critical for UV-Induced G2/M Checkpoint Activation and Apoptosis

Protein kinase C delta (PKCδ) is an essential component of the intrinsic apoptotic program. Following DNA damage, such as exposure to UV radiation, PKCδ is cleaved in a caspase-dependent manner, generating a constitutively active catalytic fragment (PKCδ-cat) which is necessary and sufficient for keratinocyte (KC) apoptosis. We found that in addition to inducing apoptosis, expression of PKCδ-cat caused a pronounced G2/M cell cycle arrest in both primary human KCs and immortalized HaCaT cells. Consistent with a G2/M arrest, PKCδ-cat induced phosphorylation of Cdk1 (Tyr15), a critical event in the G2/M checkpoint. Treatment with the ATM/ATR inhibitor caffeine was unable to prevent PKCδ-cat induced G2/M arrest, suggesting that PKCδ-cat is functioning downstream of ATM/ATR in the G2/M checkpoint. To better understand the role of PKCδ and PKCδ-cat in the cell cycle response to DNA damage, we exposed wild type and PKCδ null MEFs to UV radiation. Wild type MEFs underwent a pronounced G2/M arrest, Cdk1 phosphorylation, and induction of apoptosis following UV exposure, while PKCδ null MEFs were resistant to these effects. Expression of PKCδ-GFP, but not caspase-resistant or kinase inactive PKCδ, was able to restore G2/M checkpoint integrity in PKCδ null MEFs. The function of PKCδ in the DNA damage-induced G2/M cell cycle checkpoint may be a critical component of its tumor suppressor function. In light of recent reports suggesting the importance of nuclear localized PKCδ in the apoptotic response, we examined changes in PKCδ sub-cellular localization following exposure to UV radiation. Using a PKCδ-GFP fusion protein we determined that nuclear PKCδ was present after UV exposure, and that it formed foci coinciding with regions of intense DAPI staining, suggesting localization to condensed chromatin. We have previously shown that expression of the PKCδ catalytic fragment induced phosphorylation of Histone H3 (Ser10), an important event for mitotic chromatin condensation. Interestingly, PKCδ-cat induction of P~H3(S10) was not prevented by inhibition of the mitotic H3 kinase Aurora B, and was induced throughout all phases of the cell cycle, supporting the idea that this event is distinct from the P~H3(S10) induction during mitosis. In vitro phosphorylation studies using recombinant proteins demonstrated that PKCδ-cat is capable of directly phosphorylating H3 on Ser10 raising the possibility that PKCδ may function as a Histone H3 kinase in the cell. Using confocal microscopy we found that UV-induced PKCδ-GFP foci co-localized with regions of positive P~H3(S10) staining. To avoid any artifacts associated with over-expression of the PKCδ-GFP fusion protein, we confirmed the formation of endogenous PKCδ foci after UV radiation in normal keratinocytes. This novel chromatin modifying activity of PKCδ may be an important component of its tumor suppressor function for UV induced skin cancers in the human epidermis

TP63 is implicated in apoptotic dysregulation in melanoma

PhDCutaneous melanoma is an aggressive malignancy accounting for 4% of skin cancers but 80% of all skin-cancer related deaths. Its incidence is rapidly rising and advanced disease is notoriously treatment-resistant. The role of apoptosis in melanoma pathogenesis and chemoresistance is poorly characterised. Mutations in TP53 occur infrequently and are not critical for tumour development, yet the TP53 apoptotic pathway is abrogated; this may alternatively result from TP53 pathway defects or from alterations in other members of the TP53 family, including the TP53 homologue, TP63. The hypothesis of this thesis was that TP63 has an anti-apoptotic role in melanoma and is responsible for mediating chemoresistance. The primary aims were to investigate the biological role of TP63 in melanoma, to explore regulation of p63 expression and to understand its role in apoptosis and dysregulation of the TP53 apoptotic pathway in melanoma. Although p63 was not expressed in primary melanocytes, upregulation of both p63 mRNA and protein was observed in melanoma cell lines and tissue samples. This is the first report of significant p63 expression in this lineage. Furthermore, aberrant cytoplasmic p63 expression significantly correlated with poor overall outcome in melanoma patients. Multiple possible mechanisms were demonstrated to regulate TP63 expression in melanoma, including epigenetic modulation, microRNA regulation of gene transcription and proteosome-dependent stability of p63 protein. In response to genotoxic stress, endogenous p63 isoforms were stabilised in both nuclear and mitochondrial subcellular compartments. Translocation of p63 to the mitochondria occurred through a co-dependent process with p53 but accumulation of wt-p53 in the nucleus was inhibited by p63. Using RNAi technology, both isoforms of p63 (TA and ΔNp63) were demonstrated to confer chemoresistance in melanoma. In addition, the truncated variant, ΔNp63, was enriched in a subset of melanomas expressing CD133, pointing to an anti-apoptotic role for p63 in putative cancer stem cells in this aggressive tumour. Taken together, these data suggest that in melanoma, p63 is an oncogene which contributes to dysregulation of wt-p53 function and has an important role in mediating chemoresistance. Ultimately, these observations may provide the rationale for novel approaches aimed at sensitising advanced melanoma to chemotherapeutic agents

Collective locomotion of human cells, woundh healing and their control by extracts and isolated compounds from marine ivertebrates

The collective migration of cells is a complex integrated process that represents a common theme joining morphogenesis, tissue regeneration, and tumor biology. It is known that a remarkable amount of secondary metabolites produced by aquatic invertebrates displays active pharmacological properties against a variety of diseases. The aim of this review is to pick up selected studies that report the extraction and identification of crude extracts or isolated compounds that exert a modulatory effect on collective cell locomotion and/or skin tissue reconstitution and recapitulate the molecular, biochemical, and/or physiological aspects, where available, which are associated to the substances under examination, grouping the producing species according to their taxonomic hierarchy. Taken all of the collected data into account, marine invertebrates emerge as a still poorly-exploited valuable resource of natural products that may significantly improve the process of skin regeneration and restrain tumor cell migration, as documented by in vitro and in vivo studies. Therefore, the identification of the most promising invertebrate-derived extracts/molecules for the utilization as new targets for biomedical translation merits further and more detailed investigations

In vitro studies to assess the potential of Quercetin as a topical sunscreen; photooxidative properties, photostability and inhibition of UV radiation-mediated skin damage

Protection from the negative effects of solar radiation can be achieved by wearing protective clothing, avoiding exposure to sunlight or by the application of topical sunscreens. In this thesis, a number of studies were designed to determine if quercetin is suitable for use as a topical sunscreen. The first objective was to determine if quercetin could protect against UV-induced lipid oxidation. Quercetin is twice as effective at preventing UVB-induced oxidation as preventing UVA-induced oxidation. The difference between UVA- and UVB- induced oxidation is believed to be due to the presence of an excited state form of quercetin in the UVA system. The second objective was to determine the UV photostability of quercetin in solution. Three photoproducts of quercetin form regardless of whether UVA or UVB radiation is used. These photoproducts are 2,4,6-trihydroxybenzaldehyde, quercetin depside and hydroxytyrosol. The slow rate of formation, less than 20% loss of starting material over 11 hours, and non-toxic nature of the photoproducts indicate that photostability of quercetin is not an obstacle to its use as a sunscreen. The third objective was to determine the ability of quercetin to inhibit photosensitization by ketoprofen. Quercetin was shown to be effective in preventing decomposition of ketoprofen until it was consumed in the formation of the three quercetin photoproducts. This ability of quercetin to prevent ketoprofen photosensitization indicates a beneficial effect for the use of quercetin as a topical sunscreen. The fourth objective was to determine if quercetin can prevent UV-induced damage in a biological system. Quercetin was found to significantly reduce secretion of matrix metalloprotease 1 (MMP-1) upon UVA or UVB exposure, but had no effect on secretion of tumor necrosis factor α (TNF-α) in HaCaT cells. Topical application of quercetin to UVA or UVB exposed EpiDerm skin mimics significantly reduced both MMP-1 and TNF-α secretion. These results indicate that quercetin is effective in decreasing or eliminating several harmful effects of UVA and UVB radiation in the skin without major loss of starting material and without formation of toxic photoproducts. As such, quercetin appears to be a good candidate for inclusion into topical sunscreen formulations

Rola ekstraktów z surowców roślinnych z rodziny Oleaceae i Rubiaceae w ochronie komórek skóry przed promieniowaniem UVA

Nadmierna ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe (UV) emitowane przez słońce lub sztuczne źródła powoduje oparzenia słoneczne i stany zapalne skóry, a w konsekwencji jest przyczyną fotostarzenia, czy też nowotworów skóry. Uszkodzenia DNA, indukowane promieniowaniem UVA, zachodzą w sposób pośredni, przez tworzenie wolnych rodników i innych reaktywnych form tlenu (ROS), ale także bezpośrednio poprzez indukcję powstawania fotoproduktów - cyklobutanowych dimerów pirymidynowych (CPD). Podwyższony poziom ROS oraz uszkodzenia DNA inicjują kilka kaskad transdukcji sygnału, m.in. z udziałem białka aktywującego-1 (AP-1) i czynnika jądrowego kappa B (NF-kB) w celu uwolnienia cytokin prozapalnych. Ponadto wytwarzanie ROS prowadzi do oksydacyjnych modyfikacji innych makrocząsteczek i struktur komórkowych (np. białek, błon), co może wywołać śmierć komórki, najczęściej na drodze apoptozy. Miejscowe stosowanie filtrów przeciwsłonecznych wraz z endogenną fotoprotekcją antyoksydacyjną jest ogólną strategią ochrony skóry przed szkodliwym działaniem promieniowania UV. Dotychczas niewiele jest badań dotyczących potencjału fotoochronnego ekstraktów izolowanych z różnych organów i gatunków jesionów, a nieliczne badania nad fotoochronną rolą ekstraktów z liści oliwki i ziaren niepalonej kawy dotyczą głównie fotoochrony przed promieniowaniem UVB. Mechanizmy fotoochronnego działania wybranych surowców roślinnych są słabo poznane. Zasadniczym celem badań było określenie roli ekstraktów pochodzących z naturalnych surowców roślinnych, z rodziny Oleaceae i Rubiaceae, w odpowiedzi komórek skóry na promieniowanie UVA. Celem badań była ocena potencjału fotoochronnego ekstraktów z liści oliwki europejskiej (Olea europaea) oraz z nasion kawy (Coffea robusta), które są popularnymi suplementami diety, a także trzech ekstraktów z surowców zielarskich - kory i liści jesionu wyniosłego (Fraxinus excelsior) oraz kory jesionu koreańskiego (F. rhynchophylla) wobec fibroblastów skóry (linii Hs68) w warunkach in vitro oraz poznanie mechanizmów fotoprotekcji. Podstawą hipotezy badawczej było założenie, że badane ekstrakty roślinne chronią ludzkie fibroblasty skóry przed szkodliwymi skutkami promieniowania UVA, ujawniając jednocześnie właściwości antyoksydacyjne, antyapopototyczne oraz przeciwzapalne. Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że wszystkie analizowane ekstrakty roślinne wykazują porównywalne, skuteczne działanie fotoochronne wobec fibroblastów skóry Hs68 poddanych działaniu promieniowania UVA (8 J/cm2), co wynika przede wszystkim z ich antyoksydacyjnych właściwości (redukcja stresu oksydacyjnego) i zdolności do hamowania procesu apoptozy (szczególnie na szlaku mitochondrialnym) oraz ograniczania senescencji. Skuteczność zmiatania ROS i hamowania powstawania uszkodzeń DNA w naświetlanych fibroblastach jest porównywalna z działaniem fotoochronnym związku referencyjnego (kwercetyny), co może wynikać z synergistycznego działania składników ekstraktów i/lub z ich większej fotostabilności. Ekstrakty roślinne modulują wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne poprzez zmianę równowagi redox za pośrednictwem układu tioredoksyna/reduktaza tioredoksyny i przyczyniają się do hamowania kaskad, w które zaangażowane są białka p53, AP-1 oraz czynnik transkrypcyjny NFκB, a także powodują aktywację kaskady białka Klotho. Ekstrakty z kory F. excelsior i F. rhynchophylla oraz ekstrakt z nasion C. robusta hamują indukowaną promieniowaniem UVA ekspresję metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej, przede wszystkim MMP-1, ale także MMP-3 i MMP-9. Badane ekstrakty wykazują właściwości przeciwzapalne, wpływając na zmniejszenie poziomu interleukiny-2 oraz TNFα wydzielanych przez leukocyty. Uzyskane wyniki dostarczają nowych dowodów dotyczących ochronnego działania ekstraktów otrzymywanych z nasion kawy, liści oliwki i kory jesionów przed szkodliwym wpływem promieniowania UVA. Otrzymywane z tanich surowców, naturalne, standaryzowane ekstrakty roślinne, bogate w składniki aktywne, takie jak kwasy chlorogenowe, oleuropeina, czy pochodne kumarynowe, dodane do receptury tradycyjnych filtrów UV, mogą poprawić skuteczność ich działania, co jednocześnie umożliwiłoby zmniejszenie zawartości filtrów syntetycznych

Synthesis and biological evaluation of metal chelators of the hydroxypyridinone family as potential treatment of Parkinson’s disease and cancer

A series of 9 hydroxypyridinones (HOPO) metal-based iron chelators (from which 6 of them are novel) have been prepared, characterised and derivatized in a manner to exploit an active transport mechanism; Large neutral Amino Acid Transporter-1 (LAT-1), which is found to be overexpressed in various types of cancer as well as to be presented in the blood-brain barrier (BBB) (Figure i). Figure (i): Structure of HOPO based compounds synthesised. Novel compounds are in the dotted frames. Additionally, it appears that the involvement of iron into metabolic pathways and/or the formation of low levels of reactive oxygen species (ROS) enhances the survival and proliferation of various types of cancer including malignant melanoma. The anticancer capacity of the series of HOPO based metal chelators, have been evaluated in an in vitro model ii consisting of human (eg. A375, VVM1, HS-294T) and rodent (eg. B16F-10) melanoma cells as well as non-melanoma epidermoid carcinoma (eg. A431) and immortalized, non-malignant keratinocyte (eg. HaCaT) cells. The results of this study demonstrated that a single compound a methylated analogue of L-mimosine, can exert anticancer capacity as at the administered concentration it acts as a pro-oxidant triggering the production of high (toxic) levels of ROS, selectively in melanoma cell lines. The accumulation of ROS, drives the cells to apoptosis via activation of a well characterised downstream cascade that includes that activation of the terminal caspase 3/7 via the action of intrinsic (activation of caspase-9 pathway) and extrinsic (activation of caspase-8 pathway). Additionally, the excessive production of oxidative cellular stress and iron misregulation may be substantially involved in the dopaminergic neuron degeneration seen in the brains of Parkinson's disease (PD) patients. Here we evaluated the effectiveness of the synthesised iron chelators, based on the hydroxypyridinone core with the ability to cross the BBB and penetrate the brain. Immortalised human dopaminergic neuronal precursor cells (LUHMES) were treated with the PD-related toxins 6-hydroxydopamine (6-OHDA), which generates superoxide radicals, 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+), a mitochondrial complex I inhibitor, and the ferroptosis activator, erastin. Extensive cytotoxicological profiling revealed that three (rac-SK-2, rac-SK-3 and L-SK-4) out of the five tested compounds (rac-SK-1, rac-SK-2, rac-SK-3, L-SK-4 and rac-SK-5) rescue dopaminergic neuronal cells without inducing any toxic effects to cells, revealed through multiple cytotoxicological assays. In order to validate which structural features were essential for the transportation and the action of the compound, a series of control compounds (which they were lacking either the amino acid moiety or the coordination unit) have also been designed and screened against both melanoma cancer as well as PD cell lines. These control compounds of the associated molecules supported the rational design behind them according to which, the HOPO core is essential for the metal binding and the amino acid side vector for the transportation across the biological membranes via LAT-1

Investigating the role of mitochondrial respiratory chain activity and mitochondrial DNA damage in skin ageing

PhD ThesisAgeing describes the progressive functional decline of an organism over time, leading to an increase in susceptibility to age-related diseases and eventually to death, and it is a phenomenon observed across a wide range of organisms. Despite a vast repertoire of ageing studies performed over the past century, the exact causes of ageing remain unknown. For over 50 years it has been speculated that mitochondria play a key role in the ageing process, due mainly to correlative data showing an increase in mitochondrial dysfunction, mitochondrial DNA (mtDNA) damage, and reactive oxygen species (ROS) with age. Therefore, a major aim of the current project was to assess mitochondrial dysfunction, in the form of complex II activity, in the skin cells of differently aged humans. Mitochondrial complex II of the electron transport chain (ETC) was chosen to be examined, as it has recently been implicated in the generation of ROS, as well as in the ageing process of lower organisms, and is the least studied complex of the ETC. Complex II activity was found in the present study to decline in an age-dependant manner in human skin fibroblast cells, which may have been partially related to an observed decrease in the expression of specific nuclear-encoded complex II subunits with age. Further investigations into the cause of the decrease in complex II activity with age revealed that the decline was specific to senescent cells, and was not present in non-senescent cells, which was determined following sorting into subpopulations via fluorescence-activated cell sorting (FACS). The decrease in activity with age was not reflected in another mitochondrial complex examined, complex IV, for which there was no alteration in activity with age for either unsorted, senescent, or non-senescent cells. This finding could suggest the specific targeting of complex II in senescent cells only for future age-related therapeutics. Interestingly, an age-dependant decrease in complex II activity was not observed for human skin keratinocytes, despite being observed in human skin fibroblasts. In the present study, it was also observed that different cell types undergo differing rates of maximal complex II activity, which could have important consequences in terms of the rate of ageing of specific cell types. In addition to the observed decrease in mitochondrial complex II activity with age, it was demonstrated in the present study that mtDNA damage is increased with age in the skin of both humans and a taxonomic group for which age- 3 related changes have not been previously studied, the whales. It was confirmed that the T414G mutation, which is a general biomarker for mtDNA mutations, was higher in human skin fibroblasts from older individuals when compared to younger individuals. Furthermore, an increase in mtDNA damage with age was also found in multiple whale species, for which mtDNA damage was measured in the form of strand breaks within a large region of the mitochondrial genome, using novel primers designed and optimised through the present study. Whales from three distinct species were chosen to be examined based on their differing levels of UV exposure, as a model for different ages. It was found that the level of mtDNA damage increased with both natural age and increased UV exposure. The three whale species studied appeared to have developed alternative mechanisms of coping with UV-induced damage. MtDNA damage was found to be lowest in those whales with the highest expression of heat shock protein 70 (Hsp70), suggesting that this UV-defensive mechanism may be useful in future studies for the prevention of age-related phenotypes. Overall, the present study provides important new insights into the potential role of mitochondria in ageing

Phospholipases: From Structure to Biological Function

Phospholipases are a ubiquitous group of enzymes that hydrolyze ester bonds within membrane phospholipids. These enzymes serve multiple biological functions that go far beyond a mere membrane remodeling role in cellular homeostasis; they also play key functions in nutrient digestion and the regulated formation of bioactive lipids involved in cell signaling. It is to the latter function, critical to life, that this book is primarily concerned with. All the chapters are written by renowned experts in the area, and provide forefront information on the role phospholipases in a number of physiological and pathophysiological settings

Polyphenols for Cancer Treatment or Prevention

Polyphenols are commonly found in fruits and vegetables, and have been suggested to have protective effects against chronic diseases, such as cancers. They are a diverse group of molecules, many of which possess antioxidant, anti-inflammatory, epigenetic, drug sensitization, and/or modulation of xenobiotic metabolizing enzyme properties. However, there is mixed evidence regarding their protective effects with respect to various cancers. Some of this controversy may be due to the combination of polyphenols administered, synergistic effects of accompanying compounds, bio-accessibility, bioavailability, effect of gut microbiota, and the type of cancer investigated. The purpose of this Special Issue is to present the recent evidence for the effect of polyphenol intake on cancer, as well as mechanisms of action. This Special Issue, entitled "Polyphenols for Cancer Treatment or Prevention", welcomes manuscript submissions of original research, meta-analyses, or reviews of the scientific literature. Authors should focus their manuscripts on polyphenol bioactives or dietary patterns naturally rich in polyphenols that have been identified and used for the prevention and or treatment of cancer