8,767 research outputs found

    Living with dying children: the suffering of parents

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    Although the relief of suffering and emotional support are fundamental to children's palliative care, their empirical study has been limited. The research questions for this study address three areas: the lived experience of parents of dying children; how other people's responses shape the parents' lived experience; and the place of emotion and suffering in the parents' lived experience. Implementing a qualitative strategy, a collective case study was undertaken in a children's hospice in England, with fieldwork completed between March 2008 and September 2009. Data was collected with nine parents using a range of tools including a focus group, participant observation, documentary observation and individual interviews. Within-case and cross-case modified grounded theory analysis facilitated clarification of emerging themes whilst preserving individual parent voices. The findings show that parents of dying children had existential issues put at stake through the emotional experience of parenting a dying child; these included their identity, place in society, time, and relationships. Such losses could constitute suffering, but in addition they limited the parents' interaction with society so that over time both the 'quantity' and 'quality' of intersubjectivity reduced. The parents perceived that other people tended not to legitimate their lived experience. Emotion was an important influence in this process. The parents of dying children managed their emotions, particularly those of a negative nature, in everyday life and when using hospice services. As a result they expressed somewhat inauthentic accounts of their felt experience, reframed according to perceived feeling rules. This also reduced intersubjectivity and supported the delegitimation of the parental experience. In conclusion, delegitimation of the parental experience stems from feeling rules which are derived from day to day interactions and contemporary social policy. Suffering may be prevented if individual experience is legitimated through improved intersubjectivity. A key factor for this is effective communication through which observers engage with the felt emotion of the suffering individual

    Examining the Potential for Isotope Analyses of Carbon, Nitrogen, and Sulphur in Burned Bone from Experimental and Archaeological Contexts.

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    The aim of this project was to determine whether isotope analyses of carbon, nitrogen and sulphur can be conducted on collagen extracted from burned bone. This project was conducted in two phases: a controlled heating experiment and an archaeological application. The controlled heating experiment used cow (Bos taurus) bone to test the temperature thresholds for the conservation of δ13C, δ15N, and δ34S values. These samples were also used to test the efficacy of Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR) and colour analysis, for determining the burning intensities experienced by bone burned in unknown conditions. The experiment showed that δ13C values were relatively unchanged up to 400°C (<2‰ variation), while δ15N values were relatively stable up to 200°C (0.5‰ variation). Values of δ34S were also relatively stable up to 200°C (1.4‰ variation). Colour change and FTIR data were well correlated with the change in isotope ratios. Models estimating burning intensities were created from the FTIR data. For the archaeological application, samples were selected from two early Anglo-Saxon cemetery sites: Elsham and Cleatham. Samples were selected from both inhumed and cremated individuals. Among the inhumed individuals δ13C values suggested a C3 terrestrial diet and δ15N values suggested protein derived largely from terrestrial herbivores, as expected for the early Anglo-Saxon period. However, δ34S values suggested the consumption of freshwater resources and that this consumption was related to both the age and sex of the individual. The experimental data shows that there is potential for isotope analyses of cremated remains, as during the cremation process heat exposures are not uniform across the body. The samples selected for the archaeological application, however, were not successful. Bone samples heated in controlled conditions produced viable collagen for isotope analysis; however, there are several differences between experiments conducted in a muffle furnace and open-air pyre cremation that need to be investigated further. Additionally, the influence of taphonomy on collagen survival in burned bone needs to be quantified. Finally, methods of sample selection need to be improved to find bone samples from archaeologically cremated remains that are most likely to retain viable collagen. While there is significant research that must be conducted before this research can be widely applied there are a multitude of cultures that practised cremation throughout history and around the world that could be investigated through the analyses proposed in this project

    Maternal thyroid hormones role in Zebrafish neural development

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    Thyroid hormones (TH) are essential for proper embryonic development of the central nervous system. During this period maternal supply of TH is the only source of these hormones to the embryo. Using a zebrafish MCT8 knockdown model, with consequent inhibition of maternal thyroid hormones (MTH) uptake to the target cells, the aim of this thesis is to start a comprehensive understanding of the role of MTH during embryonic neural development. We characterised the transcriptome in 25hpf CTRL and MCT8MO zebrafish embryos and found 4,343 differentially expressed genes. Reactome analysis show that MTH regulate the expression of core developmental pathways such as NOTCH, SHH and WNT. The cellular distribution of neural MTH-target genes demonstrated their cell specific action on neural stem cells and differentiated neuron classes. We identified a series of genes involved in several key neurogenic processes to be modulated by MTH. By analysing these genes by qPCR in a temporal series, from the start of segmentation through hatching, we determined the developmental time-window where MTH are required for appropriate CNS development. We show MTH are involved in the regulation of NOTCH pathway components such as notch1a, dla, dld, her2 and her4 during neurogenesis, whereas neuroectodermal genes are not affected. Response to MTH begins at 12hpf, and the time window between 22-25hpf is particularly sensitive to MTH action. Overall, these results, show that MTH is not involved in neuroectoderm specification nor CNS compartmentalisation but stress the involvement of MTH in the early stages of neurogenesis by promoting the maintenance of specific neural progenitor populations. Analyzing the cytoarchitecture of the spinal cord we found that by the end of embryogenesis cells populating the spinal cord of control and MCT8 MO zebrafish are substantially different. Lack of thyroid hormone uptake leads to a generalized disorganization of the neural tissue, together with a decrease in: neural stem cells population, subpopulations of neuron progenitor cells, radial glial cells, mature glial cells and oligodendrocyte precursors, while the primary motor neuron domain was maintained. Colocalization analysis of neural progenitors with thraa, thrab and mct8 allowed identifying cells under the regulation of MTH via MCT8. Survival and proliferation of neural progenitor cells are compromised in MCT8MO, which could later impact on the diversity of neural cell populations obtained in the end of embryogenesis. Analysis of cell autonomous Notch activation showed it cannot rescue the phenotype induced by the lack of MTH demonstrating the niche importance in the regulation of TH action. Given that MTH regulate several important morphogenetic pathways it is likely that its action occurs as an integrator enabling an adequate equilibrium between all these signals in a time a context dependent manner. MTH actions are reflected on the timely development of neurons and glial cells. It is of great interest to continue to explore the significance of these findings to further clarify the genetic and cellular causes underlying human AHDS syndrome. In conclusion with this work, we show that thyroid hormone transferred from the mother to the embryo allows the enrichment of neural progenitor pools and the generation of cell diversity necessary to produce a fully functional central nervous tissue.As hormonas da tiróide (TH) são essenciais para o correto desenvolvimento embrionário do sistema nervoso central (CNS). Durante este período o fornecimento de hormona da tiróide pela via materna é a única fonte destas hormonas para o embrião, uma vez que a produção endógena desta hormona é iniciada apenas numa fase posterior do desenvolvimento. Evidências mostram que mesmo níveis baixos de deficiência de hormona da tiróide na mãe estão associados a desordens neurológicas e psiquiátricas nos filhos. No entanto os mecanismos moleculares envolvidos na ação desta hormona no embrião e feto continuam amplamente desconhecidos. Em humanos, mutações no principal transportador celular de TH, MCT8, causa a síndrome de Herndon-Dudley (AHDS). Esta síndrome é caracterizada pelo atraso mental, atraso global no desenvolvimento, impossibilidade de falar e uma deficiência neuromotora severa. O MCT8 é o principal transportador de hormona da tiróide presente no embrião. No presente trabalho utilizamos o “knockdown” deste transportador, inibindo a sua tradução, no modelo de peixe zebra. Este modelo foi previamente estabelecido e possui características semelhantes à síndrome AHDS humana. Neste modelo o transporte da hormona da tiróide materna (MTH) para as células alvo é bloqueado, uma vez que o MCT8 está ausente, inibindo a ação da hormona. O objetivo desta tese é começar a compreender o papel destas hormonas durante o desenvolvimento neural embrionário. Para isso caracterizamos o transcriptoma de peixe-zebra CTRL e MCT8MO às 25 horas pósfertilização (hpf) por RNA-seq. Foram encontrados 4343 genes diferencialmente expressos. A análise utilizando o Reactome revelou que a MTH está envolvida direta ou indiretamente na expressão de genes pertencentes a importantes vias de sinalização, incluindo Notch, Shh e Wnt. A análise da distribuição celular de genes alvo da MTH por hibridação in-situ revelou uma ação celular específica em células estaminais neurais, mas também sobre várias classes de neurónios diferenciados. A análise transcriptómica revelou também que uma série de genes envolvidos em vários passos de processos-chave da neurogénese são modulados pela MTH. Analisando alguns destes genes numa série temporal desde a fase da segmentação até à eclosão do embrião de peixe-zebra por qPCR, determinamos a janela temporal na qual a MTH é necessária para um correto desenvolvimento do sistema nervoso central no peixezebra. Mostramos que a MTH está envolvida na regulação de componentes da sinalização Notch, tais como notch1a, dla, dld, her2 e her4 durante o processo de neurogénese, enquanto que genes envolvidos na formação e manutenção da neuroectoderme não são regulados pela MTH. A resposta à ausência de MTH inicia-se às 12hpf, sendo que a janela de desenvolvimento entre as 22 e 25hpf parece ser particularmente sensível à ação da MTH. Globalmente estes resultados mostram que a MTH não está envolvida na indução neural, nem na compartimentalização do sistema nervoso central. No entanto é demonstrada a importância da MTH na fase inicial da neurogénese pela promoção da manutenção de populações de células progenitoras neurais. A análise à citoarquitectura da medula espinhal revelou que na fase final do desenvolvimento embrionário as células neurais presentes em embriões CTRLMO e MCT8MO diferem substancialmente. A diminuição de transporte de MTH para as células alvo leva a uma desorganização geral do tecido neural, para além duma redução em células estaminais neurais, subpopulações de células progenitoras de neurónios, células radiais gliais, células da glia maduras e progenitoras de oligodendrócitos; enquanto que a população de neurónios motores primários é mantida na ausência de MTH. Análise de colocalização de células progenitoras neurais her2(+), dla(+) e fabp7a(+) com RNAm de componentes do metabolismo da hormona da tiroide, nomeadamente recetores (thraa e thrab) e o transportador mct8, permitiu a identificação de células que estão sob a regulação da MTH. Um dos papeis clássicos da TH envolve a sobrevivência a proliferação celulares, no entanto a sua função varia com o tipo celular, o estadio de desenvolvimento e contexto celular. Verificámos que em embriões MCT8MO a sobrevivência e proliferação de células progenitoras neurais her2(+) e dla(+) estava comprometida, tanto na medula espinhal como no romboencéfalo. Este facto pode impactar a diversidade das células neurais obtidas no final da embriogénese. Na verdade, a divisão assimétrica de células progenitoras originando células da glia ou progenitoras intermediárias está diminuída nos embriões MCT8MO, mostrando um possível papel da MTH na sua formação. Com vista a esclarecer o papel da MTH sobre a sinalização Notch procedeu-se à ativação da sinalização Notch em células neurais da espinhal medula de embriões MCT8MO e CTRLMO. Esta sobre-expressão celular isolada da sinalização Notch em células individuais mostrou ser insuficiente para recuperar o fenótipo induzido pela falta de MTH, demonstrando a importância do nicho celular na regulação da ação da MTH. A ação da MTH parece estar envolvida no memanismo de divisão assimétrica de células neuroepiteliais. Este tipo de divisão está na origem da diversidade de células neurais obtidas. Um reflexo da perda deste tipo de divisões na espinhal medula pode ser a perda de progenitores intermediários que expressam neurogenina 1 e neurod6b. Dado que a MTH regula várias vias morfogenéticas é provável que a sua ação seja a de integradora entre estas vias, permitindo o equilíbrio entre estes sinais num determinado tempo e contexto celular específicos. As ações da MTH refletem-se no desenvolvimento correto e atempado de neurónios e células da glia. É de grande interesse continuar a explorar o significado destas descobertas, nomeadamente para esclarecer as causas genéticas e celulares que causam a síndrome de Herdnon-Dudley (AHDS). Foi desenvolvido um modelo de ação da MTH durante o desenvolvimento no peixe zebra, em que em subpopulações de células progenitoras contendo MCT8 e recetores da hormona da tiroide (sensíveis a TH) na ausência desta sofrem apoptose e/ou redução na proliferação em momentos distintos do desenvolvimento neural. As células progenitoras não responsivas à TH prosseguem o seu desenvolvimento. O balanço final será uma diminuição da diversidade de progenitores neurais e consequente perda na variedade de neurónios e células da glia maduros. Este efeito a nível celular terá efeito na função do CNS. Em conclusão este trabalho mostra que a hormona da tiroide transmitida da mãe para o embrião e que dá entrada nas células alvo através do MCT8 permite o desenvolvimento de populações de progenitores neurais e o consequente enriquecimento da diversidade celular, necessária à formação de um sistema nervoso central funcional.This study received Portuguese national funds from operational programmes CRESC Algarve 2020 and COMPETE 2020 through project EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER- 022121. The author was a recipient of a FCT PhD grant SFRH/BD/111226/201

    The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis

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    Bacillus thuringiensis, también conocida como “Bt”, es una bacteria gram positiva que forma endosporas. Se trata de un organismo ubicuo, aunque se encuentra principalmente en el suelo o en ambientes con alta presencia de insectos. Fue aislada por primera vez en 1901 por el bacteriólogo Shigetane Ishiwata en muestras de intestino de gusanos de seda (Bombyx mori) infectados y fue apodada como “Sottokin- Bacillus” (“Bacilo de muerte súbita”) por la muerte que causaba cuando era ingerida por larvas de gusanos de seda. Pocos años después, el biólogo Ernst Berliner aisló B. thuringiensis de crisálidas de polilla mediterránea de la harina (Ephestia kuehniella) infectadas con esta bacteria en la provincia de Thuringia, Alemania, otorgándole el nombre por el que se conoce en la actualidad. Además, Berliner describió la presencia de una especie de cristal dentro de la célula bacteriana, aunque la naturaleza de este elemento era desconocida en ese momento. Fue en 1954 cuando el microbiólogo Thomas A. Angus descubrió que esas inclusiones proteicas con formas de cristal, producidas en la fase de esporulación de Bt, eran responsables de su acción insecticida y las apodó “proteínas Cry” (del inglés crystal). A parte de estas proteínas, se han descrito varios factores de virulencia posteriormente, tal y como la b-exotoxina, la cual puede inhibir ARN polimerasas dependientes de ADN, las hemolisinas, o exoenzimas como las quitinasas. En el año 1996 se descubrió una nueva clase de proteínas, conocidas actualmente como Vip3 (de las siglas en inglés “Proteínas Vegetativas Insecticidas”), producidas durante la fase vegetativa de Bt, las cuales son altamente tóxicas para lepidópteros. Desde entonces, una amplia variedad de proteínas de Bt tóxicas para diferentes invertebrados (principalmente insectos y nematodos) han sido identificadas a partir de un gran número de cepas aisladas, y han sido clasificadas en función de la similitud de su secuencia proteica. En la actualidad existen 391 secuencias holotípicas de proteínas Bt, y los principales órdenes de insectos que han mostrado susceptibilidad a algún tipo de proteína son Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e Hymenoptera. Esta tesis se centra en el estudio de dos familias de proteínas, las proteínas Cry de tres dominios (“3D-Cry”) ylas proteínas Vip3 que afectan a lepidópteros. El modo de acción de estas proteínas, así como el ciclo de vida de Bt tras la infección del insecto constan de una serie de pasos, desarrollados en las siguientes páginas. El primer paso supone la ingestión de Bt por parte del insecto. Tras ello, los cristales que forman las proteínas Cry se solubilizan por la rotura de los puentes disulfuro, liberando las protoxinas presentes en el cristal. Esta solubilización es dependiente tanto del pH como de condiciones reductoras del intestino. En el caso de las proteínas Vip3, no precisan de este paso de solubilización, ya que son secretadas al exterior de la bacteria en forma soluble. Tanto las protoxinas Cry solubilizadas como las protoxinas Vip, son procesadas por enzimas digestivas como las tripsinas y quimotripsinas presentes en los fluidos intestinales, produciendo una toxina activa que en general es resistente a posteriores procesos proteolíticos. Una vez activadas, las toxinas deben atravesar la membrana peritrófica del intestino medio. Esta membrana es una matriz rica en quitina, cuya función principal es la separación entre el alimento y las células epiteliales. Esta separación impide que el alimento pueda tener un efecto abrasivo sobre el intestino y también sirve como primera barrera contra infecciones de tipo bacteriano, vírico o parasítico. Asimismo, el papel protector que ejerce la membrana peritrófica puede verse comprometido por la acción de las quitinasas endógenas o exógenas de Bt (enzimas capaces de degradar la quitina). Tras superar la barrera de la membrana peritrófica, se produce una interacción entre las proteínas Cry o Vip3 y la membrana de borde en cepillo de las células del intestino medio, consideradas como las células diana de las toxinas. Uno de los retos principales en la investigación de Bt durante las últimas décadas ha sido identificar cuáles son las moléculas que se unen de forma específica con las toxinas Cry o Vip3, así como deducir la relevancia de la función de esta interacción, tanto en el modo de acción de las toxinas como en los mecanismos de resistencia. Actualmente, existen tres tipos de proteínas de membrana que pueden funcionar como receptores putativos para las proteínas Cry en insectos: las aminopeptidasas N (“APN”), las cadherinas y los transportadores “ABC” (del inglés “ATP-Binding Cassette”). Aunque inicialmente la fosfatasa alcalina (“ALP”) también fue propuesta como posible receptor, al estar asociada con la resistencia, no se dispone de evidencias claras de su implicación en la unión. En cuanto a los transportadores ABC, son los receptores que mayor importancia han adquirido en los últimos años. Son proteínas de membrana con capacidad para transportar distintas moléculas de forma activa gracias a la hidrólisis de ATP. Dentro de esta gran superfamilia, el transportador más caracterizado ha sido el ABCC2, tanto por su implicación como receptor de proteínas Cry1, como por haber sido encontrado alterado en distintas especies de lepidópteros resistentes a proteínas Bt. En cuanto a las toxinas Vip3, los estudios de interacción han demostrado que los sitios de unión no son compartidos con las toxinas Cry. Existen pocos estudios concluyentes sobre los posibles receptores específicos para las toxinas Vip3. Algunos trabajos indican que tanto la proteína ribosomal S2 como el “scavenger” tipo C pueden actuar como receptores de la toxina Vip3A en varias especies del género Spodoptera. Además, este último se encuentra involucrado en la vía endocítica, siendo capaz de mediar la internalización de la toxina. Existen numerosos estudios que han señalado que la actividad tóxica de las proteínas de Bt se debe principalmente a su habilidad para formar poros en la membrana de las células diana. Este modelo (conocido como modelo de formación de poro) es actualmente el más respaldado por la comunidad científica debido al gran número de trabajos experimentales que lo apoyan tanto para toxinas de tipo Cry como para Vip3. Una vez unidas las toxinas a los receptores específicos, se forma una estructura oligomérica que se inserta en la membrana de las células intestinales constituyendo el poro. De esta forma se pierde la integridad de la membrana, generando un desequilibrio osmótico que provoca un hinchamiento de las células, desembocando en lisis celular. Tras la lisis de las células intestinales se produce una septicemia, causada principalmente por el paso a la hemolinfa no sólo de las propias esporas o formas vegetativas de Bt, sino también de todas aquellas bacterias oportunistas y otros patógenos presentes en el bolo alimentario. Como consecuencia, el insecto acaba muriendo. Por último, Bt puede aprovechar este nicho para continuar creciendo y esporular, favoreciendo su posterior dispersión en el medio. Dada su eficacia como insecticida, el ser humano ha utilizado Bt para contener la expansión de distintas plagas. El primer producto basado en Bt se comercializó en 1938, y desde entonces, su uso, ya sea en formato de formulado Bt o plantas con expresión de genes Bt, ha incrementado notablemente. Como ejemplo, las hectáreas de plantas de maíz, algodón o soja Bt aumentaron de 1,1 millones en el año 1996 a 101 millones en 2017. Por ello, no es de extrañar que B. thuringiensis sea el agente microbiano más utilizado entre las soluciones biotecnológicas presentes en la actualidad. Aunque los investigadores han trabajado durante muchos años en descifrar cómo se comportan las proteínas de este excepcional organismo en el ambiente intestinal de los insectos, aún queda mucho por entender. El conocimiento de forma detallada del modo de acción de las proteínas insecticidas de Bt es un punto clave para garantizar su uso a largo plazo por varias razones; nos permite entender en cierta medida, cuáles son los mecanismos alterados en el desarrollo de la resistencia, dónde se localizan y por qué se encuentran alterados. Además, gracias a este conocimiento podemos combinar proteínas Bt con diferentes modos de acción con la finalidad de maximizar su efecto. En la presente tesis, hemos profundizado en el estudio de estas interacciones mediante distintas aproximaciones. En el primer y segundo capítulo, nos hemos centrado en estudiar las interacciones que ocurren entre las propias proteínas Cry, así como con el transportador ABCC2 de la rosquilla verde, Spodoptera exigua. Dado que esta plaga es de alta relevancia por su impacto en la agricultura, y se encuentra ampliamente distribuida en todo el mundo, conocer cómo las proteínas Cry1 interaccionan con los receptores del intestino es muy importante, ya que los productos basados en Bt y las plantas Bt que contienen proteínas Cry1 son comúnmente utilizadas para controlar esta plaga. En estos dos capítulos, elegimos una aproximación ex vivo, ya que el uso de estos sistemas, como el cultivo de células de insecto o las preparaciones de vesículas de membrana intestinales (“BBMV”, de sus siglas inglés, Brush Border Membrane Vesicles), nos permiten entender y profundizar en interacciones específicas que pueden pasar desapercibidas durante los ensayos in vivo. Para ello, utilizamos una línea de células de insecto que expresa el transportador ABCC2 en su versión completa, denominada “Sf21- FRA”. Además, utilizamos proteínas Cry1A marcadas con yodo para realizar ensayos de unión y no marcadas para ensayos de viabilidad celular. Descubrimos que las proteínas Cry1A unen de forma específica y con alta afinidad a células que expresan el transportador, y que la presencia de éste en células es suficiente para causar toxicidad de las proteínas Cry1A probadas. Estos resultados apoyan que el ABCC2 de S. exigua actúa como receptor funcional de las proteínas Cry1A, tal y como se ha observado en otras especies plaga. A través de los dos capítulos, la falta de competencia de la proteína Cry1C, así como la ausencia de toxicidad en células HEK que expresan el transportador, descartaron al ABCC2 como receptor para esta proteína. Estos resultados indican que la proteína Cry1C pueda poseer distintos sitios de unión en el intestino medio de S. exigua, ya que es altamente efectiva en el control de esta plaga. Por otra parte, observamos un fenómeno insólito en los ensayos de unión con I125-Cry1Aa, en los que concentraciones bajas de Cry1Aa no marcada y utilizada como competidor, producía una respuesta estimulatoria, causando un incremento de la unión total conseguida por la I125-Cry1Aa a las células expresando el transportador. Dado que a concentraciones altas de competidor, éste competía de una forma habitual, exploramos por qué ocurría este comportamiento bifásico. Pudimos observar también estimulación causada a bajas concentraciones, e incluso más acentuada, al utilizar las proteínas Cry1Ab, Cry1Ac o la proteína híbrida H04 (que contiene los mismos dominios I y II que las proteínas Cry1Ab/c, pero contiene el dominio III de la Cry1C) como competidores contra la I125-Cry1Aa. Sin embargo, no observamos dicho comportamiento bifásico al utilizar la proteína Cry1C o la proteína híbrida H205 (con los mismos dominios I y II que la proteínas Cry1C y mismo dominio III que la Cry1Aa), lo cual indica la importancia de poseer el mismo dominio I, común a estas tres Cry1As, para que se produzca la fase de estimulación de la unión. Curiosamente, también pudimos observar dicho comportamiento, aunque de forma mucho más discreta, cuando utilizamos I125-Cry1Ac y Cry1Aa como competidor. Para revelar la naturaleza del agente causante de la fase estimulatoria, realizamos electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de la fase insoluble de los ensayos de competencia, así como autoradiografías de la misma. Tanto el tamaño molecular como la intensidad de la banda observada nos permitió determinar que la forma oligomérica de la proteína es la responsable de la respuesta estimulatoria, señalando este hecho la habilidad de las proteínas Cry1A de formar tanto homo- como hetero-oligómeros. Para confirmarlo, utilizamos dos versiones mutantes de Cry1Aa y Cry1Ab, que poseen una sustitución del aminoácido Arg por Glu en la posición 99 del dominio I que impide la oligomerización. La ausencia de fase estimulatoria o banda correspondiente a oligómero en las autoradiografías al usar estos mutantes como competidores, confirman la habilidad de homo- y hetero-oligomerizar de las proteínas en su versión no modificada, a través del dominio I, así como de unir con alta afinidad al transportador ABCC2. Además, las toxicidades observadas con las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac en células expresando el transportador, así como los ensayos de competencia llevados a cabo con I125-Cry1Ac en el primer capítulo, nos permiten concluir que estas dos proteínas comparten un sitio de unión, que tiene poca afinidad por la proteína Cry1Aa. La presencia de este sitio compartido se pudo confirmar con el uso del híbrido H04, lo cual señaló al dominio II de Cry1Ab/c como dominio con mayor afinidad por este sitio. Dado que la proteína Cry1Aa parecía tener un papel menos relevante en la unión a este sitio, pero aún así es tóxica para células expresando el transportador, realizamos experimentos de competencia tanto con I125-Cry1Aa como con I125-Cry1Ac, usando Cry1Aa y el híbrido H205 como competidores. Pudimos concluir que la proteína Cry1Aa debe de tener otro sitio de unión en el transportador, el cual tendría alta afinidad por el dominio III de Cry1Aa. A este sitio de unión, también se podría unir la proteína Cry1Ab con alta afinidad, dado que comparte el mismo dominio III que la Cry1Aa. Por último, a través de distintas combinaciones de proteínas Cry1Aa en ensayos de toxicidad pudimos observar que, la ventaja obtenida al formar mayores concentraciones de hetero-oligómeros que de homo-oligómeros no sólo también se trasladaba a mayores tasas de unión, sino a mayor toxicidad sobre las células. En resumen, el primer capítulo destaca la importancia del ABCC2 como un receptor multivalente para las proteínas Cry1A y el segundo capítulo demuestra la habilidad de formar hetero-oligómeros por las proteínas Cry1Aa para beneficiarse de la multivalencia del transportador. Hasta ahora, es evidente que el transportador ABCC2 de S. exigua y de otros lepidópteros juega un rol relevante en la unión y toxicidad de al menos las proteínas Cry1A, pero pocos miembros de la familia de este transportador han sido caracterizados. Es muy probable que estemos pasando por alto numerosos transportadores ABC que interaccionen con proteínas insecticidas de B. thuringiensis, ya que hasta ahora se han descrito más de 400 transportadores ABC en artrópodos. Por ello, estudiar nuevas interacciones entre transportadores ABC y proteínas insecticidas es un gran reto en la investigación con Bt. A parte del ABCC2, sólo unos pocos transportadores ABC se han relacionado con proteínas Bt, como el ABCB1 del coleóptero Chrysomela tremulae, receptor de la proteína Cry3Aa, el ABCA2 de los lepidópteros Helicoverpa armigera y B. mori, receptor para las proteínas Cry2A, o el ABCC3 de S. exigua, Spodoptera litura, Plutella xylostella, H. armigera y Spodoptera frugiperda, relacionado con la acción de la proteína Cry1Ac. Curiosamente, ningún otro miembro de la familia ABC (aparte del ABCC2) se ha caracterizado en el gusano bellotero Heliothis virescens, plaga en la que se relacionó por primera vez un transportador ABC con las proteínas de Bt, hace ya más de una década. En el tercer capítulo de la tesis, hemos realizado una búsqueda de nuevos transportadores ABC en H. virescens para abordar esta falta de conocimiento. Hemos identificado y descrito dos nuevos transportadores, el ABCC3 y ABCC4. El análisis filogenético ha demostrado alta similitud entre el transportador ABCC3 y el ya descrito ABCC2, como se ha observado en otras especies como H. armigera. Sin embargo, el transportador ABCC4 es una proteína más distante atendiendo a su secuencia de aminoácidos. Según los modelos de predicción, ambos transportadores estarían formados por dos dominios transmembrana y seis regiones en la parte exterior que se corresponden con asas extracelulares. Evaluamos la funcionalidad de los nuevos transportadores como posibles receptores para proteínas Bt desarrollando mutantes de deleción para cada uno de los genes HvABCC3 o HvABCC4 mediante la técnica de CRISPR/Cas9. Para ello, microinyectamos huevos y cruzamos los adultos resultantes hasta obtener líneas de homozigotos mutantes. Seguidamente, realizamos bioensayos con Cry1Aa, Cry1Ac y Vip3A. Los resultados preliminares no mostraron reducción en la toxicidad para ninguna línea mutante, en comparación con la colonia de H. virescens usada como control. Sin embargo, sí se observaron mortalidades ligeramente disminuidas en la concentración más baja de Cry1Ac utilizada, especialmente en la línea de mutantes con deleción en el ABCC3, aunque el grado de significación debe de estudiarse en mayor profundidad dado el bajo número de réplicas en los bioensayos. Además, falta por confirmar la correcta deleción de los transportadores en ambas líneas de mutantes mediante la secuenciación del ARN mensajero de los genes. Dado que los ARN guías utilizados se diseñaron en el primer exón de cada gen, podrían haber pautas de lectura alternativas, por lo que debemos de asegurar que no se estén expresando otras versiones funcionales de los transportadores. Por tanto, la posible implicación de los nuevos transportadores ABC con proteínas Bt tendrá que estudiarse en mayor profundidad. Por ahora, se sabe que el ABCC3 de S. exigua, H. armigera S. exigua, H. armigera y S. frugiperda comparte redundancia funcional con el ABCC2 en el modo de acción de las proteínas Cry1A y juega un rol menor y secundario en su toxicidad. Para comprender si este fuera el caso en H. virescens, son necesarios experimentos adicionales como desarrollar líneas de mutantes con deleción del ABCC2 o dobles mutantes con deleción del ABCC2 y ABCC3, así como la evaluación, mediante ensayos con proteínas marcadas, de las capacidades de unión sobre las líneas de los mutantes. Por último, aparte del ABCC2, ABCC3 y ABCC4, aún queda un gran número de transportadores ABC por describir en H. virescens. Además de estudiar la interacción entre receptores putativos y proteínas Bt y buscar receptores desconocidos, debemos de tratar de entender cómo y por qué ciertas especies plaga consiguen desarrollar resistencia a proteínas Bt, ya que la resistencia es la principal amenaza para el uso continuado de plantas Bt o bioinsecticidas basados en Bt. Está ampliamente aceptado que la alteración de unión al receptor de membrana es la principal causa de resistencia a proteínas Bt en especies plaga, aunque otros mecanismos pueden estar involucrados. Las alteraciones de unión pueden ocurrir por diferentes razones, tales como la reducción en la expresión de un gen que codifique para una proteína de membrana, deleciones en su secuencia, o mutaciones aminoacídicas que impidan la interacción entre la toxina y el receptor. Por ello, es interesante caracterizar la funcionalidad de los receptores que han sido encontrados alterados en diferentes plagas resistentes. A día de hoy, existen numerosos estudios funcionales con las versiones “wild-type” de transportadores ABC usando diferentes técnicas, tales como silenciamiento con ARN de interferencia, deleción mediante CRISPR, o expresión en un sistema ex vivo, pero pocos estudios han caracterizado la funcionalidad de las versiones alteradas de los transportadores ABC de cepas resistentes. Además, se propuso que el mecanismo de transporte activo de los transportadores tiene que funcionar correctamente para que pueda actuar como receptor de las proteínas Cry. En el cuarto capítulo, caracterizamos la funcionalidad de una versión alterada del ABCC2 de una colonia de S. exigua resistente a XentariTM, un bioinsecticida basado en Bt. Este transportador contiene una deleción en el segundo dominio de unión a nucleótidos (“NBD2”) que fue genéticamente ligada a la resistencia en un estudio previo. Sin embargo, no se han realizado ensayos de funcionalidad del transportador mutado para dilucidar si esta mutación es la causa de la resistencia. Para ello, utilizamos una línea celular de insecto que expresa la versión truncada del transportador denominada Sf21-XenR, así como la línea celular utilizada en los dos primeros capítulos que expresa la versión original del ABCC2 (Sf21-FRA). A través del estudio de la secuencia de aminoácidos, identificamos cuatro mutaciones adicionales, en forma de sustitución,tres de las cuales se encontraban en los NBD intracelulares y una de ellas en una de las asas extracelulares (asa extracelular número 4). Las primeras caracterizaciones mediante Western blot e inmunohistoquímica mostraron la expresión del transportador truncado y su localización en la membrana de las células Sf21-XenR, lo cual indica que las mutaciones presentes en el transportador no impiden su presencia en la membrana. Tras ello, realizamos ensayos de viabilidad celular con las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac, tanto en células Sf21-XenR como en células Sf21 no transformadas como control. Las tres proteínas ensayadas fueron tóxicas contra células con expresión del transportador truncado, y a un nivel muy similar al encontrado previamente en células que expresan el transportador en su versión original (Capítulo 1). Además, los ensayos de unión con Cry1Ac marcada con I125 revelaron unión específica al transportador truncado, así como un valor similar en la constante de

    Non-homogeneous dispersion of graphene in polyacrylonitrile substrates induces a migrastatic response and epithelial-like differentiation in MCF7 breast cancer cells

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    Background: Recent advances from studies of graphene and graphene-based derivatives have highlighted the great potential of these nanomaterials as migrastatic agents with the ability to modulate tumor microenvironments. Nevertheless, the administration of graphene nanomaterials in suspensions in vivo is controversial. As an alternative approach, herein, we report the immobilization of high concentrations of graphene nanoplatelets in polyacrylonitrile film substrates (named PAN/G10) and evaluate their potential use as migrastatic agents on cancer cells. Results: Breast cancer MCF7 cells cultured on PAN/G10 substrates presented features resembling mesenchymal-to-epithelial transition, e.g., (i) inhibition of migratory activity; (ii) activation of the expression of E-cadherin, cytokeratin 18, ZO-1 and EpCAM, four key molecular markers of epithelial differentiation; (iii) formation of adherens junctions with clustering and adhesion of cancer cells in aggregates or islets, and (iv) reorganization of the actin cytoskeleton resulting in a polygonal cell shape. Remarkably, assessment with Raman spectroscopy revealed that the above-mentioned events were produced when MCF7 cells were preferentially located on top of graphene-rich regions of the PAN/G10 substrates. Conclusions: The present data demonstrate the capacity of these composite substrates to induce an epithelial-like differentiation in MCF7 breast cancer cells, resulting in a migrastatic effect without any chemical agent-mediated signaling. Future works will aim to thoroughly evaluate the mechanisms of how PAN/G10 substrates trigger these responses in cancer cells and their potential use as antimetastatics for the treatment of solid cancers.This work was supported by Grants from the “Asociación Luchamos por la Vida” (Corrales de Buelna, Cantabria, Spain), Health Research Institute “Valdecilla” (INNVAL17/20, IDIVAL), MINECO/EIG-Concert Japan (X-MEM PCI2018-092929 project, International Joint Program 2018) and the Spanish Research Agency (PID2019-105827RB-I00 supported by MCIN/AEI/10.13039/501100011033)

    Exercise & cardiopulmonary physiology in rheumatoid arthritis

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    A thesis submitted in partial fulfilment of the requirements of the University of Wolverhampton for the degree of Doctor of Philosophy.Background: Rheumatoid arthritis (RA) individuals are at greater morbidity and mortality risk from developing cardiac and pulmonary disorders than the general population, primarily due to a sedentary lifestyle. Aims: This project aimed to (1) obtain information on the rheumatic and musculoskeletal disease (RMD) patents’ achieved/preferred exercise principles and awareness, (2) investigate the need to implement and safety, as depicted when a verification phase is added at the cardiopulmonary exercise tolerance test (CPET) in RA, to confirm the attainment of maximal effort, (3) evaluate potential differences between RA individuals and non-RA controls regarding the cardiopulmonary physiology and its association with the cardiorespiratory fitness (CRF) level and (4) assess possible cardiopulmonary changes following a supervised three-month aerobic high-intensity interval training (HIIT) regimen and examine its adherence in RA. Methods: A total of 298 individuals were recruited. A newly developed questionnaire in RMDs explored qualitative data about exercise. CRF was evaluated through a combined CPET with verification phase protocol. CPET was analysed for its sensitivity, specificity, positive and negative likelihood ratios (LH+/LH-), and diagnostic odds ratio (DOR). The verifications’ phase safety was examined through CPET's absolute and relative contraindications during monitoring and patient’s acceptability. Cardiopulmonary physiology was investigated via both echocardiography and complete pulmonary function tests (PFTs). To estimate the disease activity score (DAS28) ‐ C‐reactive protein (CRP) was used in people living with RA. Results: Study 1: The most preferred exercise routine characterised by a frequency of “2-3 times per week”, moderate intensity, lasting “about an hour’’, with swimming being the best- suggested modality. In Study 2, a combined CPET with a verification phase protocol presented superior diagnostic accuracy and was free from safety issues for both people with RA and non-RA controls. In Study 3, in the absence of any overt cardiac and/or pulmonary disease, RA individuals presented with an eccentric cardiac remodelling and lung hyperinflation pattern compared to non-RA controls; CRF was associated (p<0.05) with left ventricular (LV) compliance and pulmonary function indices in both groups. Study 4: The HIIT programme revealed significant (p<0.05) improvements in pulmonary function, CRF, and reduced DAS28, while individuals adhered overall moderately to this regime. Conclusions: This Thesis concluded that: (1) exercise recommendations are not individualised according to the individuals’ needs and preferences in RMDs, (2) the combined CPET with a verification phase is a safe and necessary methodology to ensure a diagnostically accurate assessment of maximal effort for both people living with RA and non- RA controls, (3) people living with RA may present a parallel eccentric cardiac remodelling with a hyperinflation pattern in the subclinical phase, while CRF levels associate with cardiopulmonary function indices in both groups, and (4) a moderately adhered three-month aerobic HIIT exercise regimen can significantly improve pulmonary function, CRF, and RA's disease state.University of Wolverhampton
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