27 research outputs found

    Humanes Zellmodell zur Charakterisierung des viralen Polyoma-Strukturproteins VP1 zum Transfer von Antisense-Oligonukleotiden

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    In dieser Arbeit wurde das Potential des rekombinant in E. coli hergestellten und unter Hochsalzbedingungen in-vitro assemblierten, murinen VP1-Kapsoids als Antisense-Oligonukleotid-Transfersystem in humane Brustkrebszellen untersucht. Die verwendeten Antisense-Oligonukleotide sind gegen den in 25-30 % aller Brustkrebsfälle überexprimierten Wachstumsfaktorrezeptor Pl85erbB-2 gerichtet, der zu einer verschlechterten Prognose in Bezug auf die Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit und das Wiederauftreten des Carcinoms führt. Die Charakterisierung der VP1-Kapsoide als Oligonukleotid-Transfersystem wurde zum einen in Bezug auf den Zelltransfer des Trägers und die mit ihm transportierten Antisense-Oligonukleotide durchgeführt. Zum anderen erfolgte die Überprüfung der resultierenden Antisense-Wirkung der Oligonukleotide sowohl in einem unspezifischen Proliferations- als auch in einem Antisense-Assay, das zwischen sequenzspezifischen und sequenzunspezifischen Oligonukleotid-Wirkungen differenzieren kann. Für die VP1-Kapsoide wurde in den untersuchten humanen Brustkrebszelllinien eine identische Lokalisierung detektiert wie sie für die murinen Targetzellen beschrieben ist. Es kommt zu einer cytosolischen Anreicherung mit perinukleären. vesikulären Strukturen ohne nachweisbare nukleäre Lokalisierung. Die durch VP1-Kapsoide transportierten Oligonukleotide dissoziieren intrazellulär in einem Zeitraum von 3 h nahezu vollständig vom Transfersystem und reichem sich cytosolisch und nukleär an. Zur Testung der biologischen Aktivität der Antisense-Oligonukleotide wurden liposomaltransportierte Oligonukleotide verwendet, da die Beladungsrate der VP1-Kapsoide unter Mediumbedingungen zu gering ist. Im Proliferationsassay wird die Oligonukleotid-Wirkung anhand der resultierenden Proteinreduktion charakterisiert. Die geringe Spezifität dieses Assays wurde durch die Einführung von einer Kontrollzelllinie und Kontroll-Oligonukleotid-Modifikationen verbessert. Die im Proliferationsassay mit Antisense-Oligonukleotiden detektierten Oligonukleotid-Wirkungen beweisen noch nicht, ob eine sequenzspezifische Antisense-Wirkung vorliegt. Deshalb wurde die Sequenzspezifität der verwendeten Antisense-Sequenzen zusätzlich im Antisense-Assay bestätigt. Die etablierten Testsysteme stellen alle Optionen zur umfassenden Charakterisierung eines innovativen Transfersystems zur Verfügung. Die Transfer-Assays untersuchen den verbesserten Zelltransfer des Trägers gegenüber freien Oligonukleotiden und alternativen Trägern. Das Proliferationsassay ermöglicht ein Vorscreening auf Antisense-Wirkungen und reduziert somit die Probenanzahl für das letztendlich notwendige Antisense-Assay

    Gentherapie in der Orthopädie

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    Gentherapie in der Orthopädie wird intensiv im Rahmen verschiedener vererbbarer und nichtvererbbarer orthopädischer Krankheiten untersucht. Der experimentelle Fortschritt auf diesem Gebiet ist durch die Komplexität von Vektorauswahl und -herstellung, Gentransfertechnik, Applikationsweg in geeigneten Tier-Modellen sowie dem Nachweis auf struktureller und funktioneller Ebene gekennzeichnet. Die ersten klinischen Studien zur Gentherapie der chronischen Polyarthritis haben bereits ihre praktische Durchführbarkeit demonstriert. Es ist wahrscheinlich, dass genbasierte Verfahren zur Erweiterung und Verbesserung bestehender orthopädisch-chirurgischer Therapien führen werden. Schlüsselwörter Gentherapie · Gentransfer · Orthopädie · Klinische Studie

    Horizontale Gleichheit im Abgaben-Transfersystem: eine Analyse äquivalenter Einkommen von Arbeitnehmern in Deutschland

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    Unter Verwendung des Konzepts äquivalenter Einkommen vergleichen wir acht verschiedene Typen von Arbeitnehmerhaushalten im Hinblick auf ihre Nettobelastung aus Steuern, Sozialbeiträgen und Transferzahlungen aus dem ALG II. Anhand des Kriteriums horizontaler Gleichheit können wir darlegen, dass unter der Verwendung üblicher Äquivalenzskalen Familien im unteren Einkommensbereich strukturell gegenüber Singlehaushalten finanziell benachteiligt werden. Für hohe Markteinkommen lässt sich demgegenüber eine Privilegierung von Familien und insbesondere gemeinsam veranlagten Ehegatten feststellen. Auf Basis der ermittelten Untersuchungsergebnisse kann konstatiert werden, dass hinsichtlich der horizontalen Gleichheit Wertungswidersprüche zwischen dem Steuer- und Sozialversicherungsrecht einerseits und dem Sozialrecht andererseits bestehen. Aus dem verwendeten Modellrahmen lässt sich keine befriedigende Begründung für diese Wertungswidersprüche ableiten. --

    Der CDU/CSU-Vorschlag zur Gesundheitspauschale: Pro und Kontra

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    Die Einführung einer Pauschalprämie in der Gesetzlichen Krankenversicherung (GKV) wird von wirtschaftswissenschaftlichen Experten schon seit Jahren gefordert. Der Kompromiss, der zwischen CDU und CSU gefunden wurde und von Christa Stewens, bayerische Sozialministerin, hier erläutert wird, enthält zwar im Grundsatz die Pauschalprämie, schwächt aber ihre verteilungspolitischen Wirkungen gegenüber dem reinen Konzept ab. Prof. Dr. Andreas Haufler, Universität München, erwartet von dieser Reform keine nennenswerten Effizienzgewinne und Gerrit Roth, ebenfalls Universität München, lehnt eine Gesundheitsprämie generell ab. Für Prof. Dr. Hans Fehr, Universität Würzburg, fällt das vereinbarte Kompromissmodell bei nahezu allen relevanten Kriterien gegenüber dem ursprünglichen Konzept zurück, und für Prof. Dr. Friedrich Breyer, Universität Konstanz, weist das CDU/CSU-Modell ein Höchstmaß an Intransparenz auf.Gesetzliche Krankenversicherung, Gesundheitskosten, Einkommen, Gesundheitsfinanzierung, Kopfsteuer, Deutschland

    Beitrag zur Dimensionierung von Fördersystemen mit Staurollenketten

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    Die Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der Beanspruchungen von Staurollenketten. Zunächst wurde in den Grundlagen der Aufbau von unterschiedlichen Staurollenkettenarten dargestellt, die Eigenschaften miteinander verglichen und kategorisiert. Aufbauend auf dem anschließend geschaffenen Verständnis der wirkenden Reibpaarungen bzw. -arten wurden FEM-Analysen durchgeführt, um dadurch auftretende Spannungen zu detektieren und das thermische Verhalten der unterschiedlichen Werkstoffpaarungen zu ermitteln. Innerhalb der praktischen Versuche der Arbeit kam es zur Ermittlung der Bruch- und Dauerfestigkeiten nach ISO15654 [DIN04]. Zur Untersuchung der Eigenschaften der Ketten unter praxisnahen Randbedingungen wurde ein Versuchsstand konzipiert, welcher die Ermittlung von Kennwerten zwei unterschiedlicher Kettengrößen unter härtesten Bedingungen ermöglicht. Durch diesen Versuchsstand wurden die Staukraft, die Kettenzugkraft durch das Drehmoment am Antrieb, die Kettengeschwindigkeit, die Kettenlängung und das Temperaturverhalten dauerhaft überwacht. Im letzten Kapitel der Arbeit wurde eine Überwachungsstation für unterschiedliche Baugrößen von Staurollenketten entwickelt und die Funktionsweise durch Versuche nachgewiesen.This dissertation is dealing with the investigation of the load behaviour of accumulation roller chains. Initially, the structures of different types of accumulation roller chains are described, properties are compared and categorised. Based on the created understanding of acting tribological pairing and friction mechanisms, FEM analysis have been performed to evaluate occurring stresses and determine the thermal behaviour of the various material combinations. Within the testing procedures, breaking strength and fatigue strength have been investigated in accordance with DIN ISO 15654 [cf. DIN04]. A test bench has been developed for practically relevant testing of the chains, where determination of characteristic values can be done under hard testing conditions for two different chain types. The test bench ensures measurement and survey of accumulation forces, tensile chain forces (by torque moment at drive), chain speed, chain elongation and chain temperature during whole testing time. The last chapter of the dissertation deals with the development of a 'control and monitoring unit' for accumulation roller chains with various dimensions including proof of function by trials

    Albumin-Nanopartikel als Trägersysteme für Antisense-Oligonukleotide zur Anwendung in der Brustkrebstherapie

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    Die meisten nanopartikulären Ansätze im Bereich der Arzneiformenentwicklung befinden sich am Anfang der klinischen Evaluation, sodass das wirkliche Potenzial nanotechnologischer Produkte sich erst in den kommenden Jahren abzeichnen wird. Die Zusammenführung von „Drug-Targeting“ und „sustained release“ mit nanotechnologischer Entwicklung könnte in Zukunft zu einem Fortschritt in der Medizin beitragen. Auf dem Gebiet der Antisense-Oligonukleotid (ASO)-Therapie stellt der ASOTransfer in Zielzellen eine entscheidende Hürde dar. ASO benötigt, um im Körper an den Wirkort zu gelangen, einen zuverlässigen Träger, der vor dem Abbau in physiologischen Milieu schützt, den Transport über extra- und intrazelluläre Barrieren im Körper gewährleistet und die ASO zielgerichtet an den Wirkort bringt. Der Einbau von ASO in kolloidale Trägersysteme wie Nanopartikel vermittelt eine effiziente Aufnahme in Zellen bei gleichzeitigem Schutz vor abbauenden Enzymen im Körper. Des Weiteren kann eine gezielte Aufnahme in Zielzellen erreicht werden, die normalerweise nicht auftritt. Bisherige Trägersysteme bestanden meist aus Nanopartikeln von synthetischen Materialien, die entweder die ASO an der Oberfläche adsorbiert oder in der Partikelmatrix inkorporiert hatten. Als Trägermaterialien wurden oft Polyalkylcyanoacrylate verwendet. Sie sind aufgrund ihrer negativen Ladung und Hydrophobizität nicht geeignet ohne Zugabe von Hilfsstoffen, welche in höheren Konzentrationen toxisch wirken, anionische hydrophile Substanzen wie ASO zu adsorbieren. Außerdem besteht bei Nanopartikeln mit adsorbierten ASO die Gefahr, dass es bei einer intravenösen Gabe zu einer Desorption der ASO kommt und somit ASO die Zielzellen nicht in verpackter Form erreicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NP auf Basis von humanem Serumalbumin (HSA) als Trägersystem für ASO entwickelt. Durch Oberflächenmodifikation dieser Trägersysteme wurde eine Kopplung von anti-HER2 Antikörper ermöglicht und ein AK-vermitteltes Drug-Targeting erreicht. HSA als natürliches Makromolekül zeichnet sich durch geringe Toxizität und gute Biodegradierbarkeit aus. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass ein Wirkstoff mit vorhandenen Bindungsstellen im HSA-Molekül Wechselwirkungen eingehen kann, was eine erfolgreiche Einbindung gewährleistet. Zusätzlich eignen sich aus HSA hergestellte NP aufgrund funktioneller Gruppen an der Partikeloberfläche für die Kopplung von Antikörpern und ermöglichen somit eine zielgerichtete Arzneistofftherapie. Die entwickelten Trägersysteme wurden hinsichtlich kolloidaler Parameter wie Teilchengröße, Oberflächenladung, ASOBeladungseffizienz, Stabilität in physiologischen Medium und ihrem Vermögen, einen ASO-Effekt zu erzielen, in Zellkultur evaluiert. 4.1 Optimierung der Beladung von NP mit ASO Zunächst wurden HSA-NP hergestellt, bei denen die Beladung durch Inkorporieren des ASO in die Partikelmatrix erfolgte. Die Evaluierung des Desolvatationsprozesses ergab eine Abhängigkeit der ASO-Beladung vom zugesetzten Desolvatationsmittel Ethanol. Eine Mindestmenge eines 1,8-fachen Überschusses an Ethanol ist für die vollständige Desolvatation des HSA und damit für die Einbindung des daran adsorbierten ASO erforderlich. Ebenso beeinflusste die Quervernetzung der Partikel die ASO-Beladungseffizienz. Je mehr Glutaraldehyd zugesetzt wurde, desto stabiler waren die NP. Nimmt die Menge des Glutaraldehyds von 40% auf 200% zu, löste sich um so weniger ASO während der Waschschritte aus der Partikelmatrix heraus. Jedoch hat das Ausmaß der Quervernetzung einen entscheidenden Einfluss auf die Biodegradierbarkeit des Partikelsystems. Zu stark quervernetzte NP (Quervernetzung von 200%) können von intrazellulären Enzymen nicht mehr abgebaut werden, infolge dessen gelangt das eingebundene ASO nicht zu seinem Wirkort ins Zytoplasma. Im Folgenden wurde versucht über die Einführung einer permanenten kationischen Ladung (EDC/Cholamin-Reaktion) im HSA-Molekül ein Trägerpolymer mit höherer Beladungskapazität im Vergleich zu nativem HSA zu etablieren. Ein geringer Anteil von kationisiertem HSA (cHSA) in der HSA-Partikelmatrix reichte aus, um die ASOBeladungseffizienz um ein 2,5-faches signifikant zu steigern. Das Ziel der Oberflächenmodifikation der HSA-NP war eine Positivierung des Zetapotentials, um die Bindung negativ geladener Wirkstoffe wie ASO über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die Umsetzung der HSA-NP mit EDC und Cholamin führte zu einer deutlichen Verschiebung des Zetapotentials von ca. –20,0 mV in den positiven Bereich (+38,6 mV). Durch die Inkubation mit ASO konnten so große Menge an ASO effizient an die Partikeloberfläche (NP+) gebunden werden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse zeigte, dass die Beladung mit ASO in der Reihenfolge von Albumin-NP (HSA-NP) mit einer Beladungseffizienz von 7,6 µg ASO / mg NP zu Nanopartikeln, die in der Partikelmatrix inkorporierten Anteil an kationisiertem Albumin enthielten (cHSA-NP) mit 18,2 µg ASO / mg NP, zu Oberflächen-kationisierten Nanopartikeln (NP+) mit 100 µg ASO / mg NP signifikant zunahm. 4.2 Mit ASO-beladene NP in der Zellkultur HSA-NP wurden von allen verwendeten Brustkrebszell-Linien gut vertragen. Nach Zellaufnahme der HSA-NP wurden bei niedriger Quervernetzung (40%) die Partikel gut intrazellulär abgebaut und das ASO in das Zytoplasma freigesetzt. Es konnte im CLSM gezeigt werden, dass die ASO-Freisetzung innerhalb von 24 h zunahm. Alle Versuche mittels den entwickelten ASO-beladenen Trägersystemen einen Antisense Effekt nachzuweisen schlugen fehl. Da die Beladung der HSA-NP nicht weiter erhöht werden konnte, richtete sich ein neuer Ansatz auf eine verbesserte Aufnahme der NP über einen Rezeptor-vermittelten Mechanismus. 4.3 Antikörper-vermittelte Anreicherung von NP in Zielzellen Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern mit einer Spezifität gegenüber Tumorzellen ist eine relativ neue und spannende Modalität in der Krebstherapie. Eine der vielversprechenden Zielstrukturen für eine solche Immunotherapie stellt der HER2-Membranrezeptor dar, dessen Überexpression mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. HER2 ist ein Produkt des Proto-Onkogens erbB2, das für einen 185 kDa Transmembrantyrosinkinase Wachstumsfaktorrezeptor kodiert. Dieser Rezeptor ist in normalem Gewebe bei Erwachsenen nur geringfügig exprimiert [Press et al., 1990], aber ist bei ungefähr 30% der Patienten mit humanem Magenkarzinom, Lungen- und Brustkrebs überexprimiert. Gegenwärtig dient HER2 als Tumormarker für die zielgerichtete Behandlung mit dem humanisierten anti-HER2 AK Trastuzumab (Herceptin®) von Patientinnen bei metastasierendem Brustkrebs. Jedoch können bessere Ergebnisse erreicht werden, wenn Trastuzumab in Kombination mit anderen Zytostatika verabreicht wird. Antikörper haben bei alleiniger Gabe eine ausreichende Antitumoraktivität, aber sie können auch konjugiert mit Zytostatika sowie Toxinen und Radionukliden, genutzt werden, um diese zu den Tumoren bringen. Im Prinzip kann die Trägereigenschaft von Antikörpern gesteigert werden, wenn ein Antikörper an ein Arzneistoffreservoir, wie Nanopartikel oder Liposomen geknüpft ist. Der Vorteil dieses innovativen Ansatzes für eine zellspezifische Anreicherung im Vergleich zu herkömmlichen Biokonjugaten ist, dass eine höhere Arzneistoffträgerkapazität mit einer verbesserten Spezifität für eine zielgerichtete Pharmakotherapie kombiniert werden kann. Wegen seiner erhöhten Expression in Tumorzellen, seiner extrazellulären Verfügbarkeit und seiner Fähigkeit nach Antikörperbindung internalisiert zu werden, stellt HER2 eine geeignete Zielstruktur für die Tumortherapie mit zellspezifischen Nanopartikeln dar. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion Antikörpermodifizierter Protein-basierter Nanopartikel zu untersuchen und eine spezifische Aufnahme in HER2-überexprimierende Zell-Linien zu verbessern. Ein spezifisches Targeting wurde in verschiedenen Krebszell-Linien mit unterschiedlichen HER2- Expressionsleveln durch FACS-Analyse bewiesen. Die Versuche beinhalteten Inhibitionsexperimente durch Vorinkubation mit Trastuzumab, um die Selektivität der Bindungsstellen auf der Zelloberfläche zu unterstreichen. Die zelluläre Aufnahme dieser Nanopartikel, ebenso wie die zelluläre Verteilung, konnte im CLSM beobachtet werden. Diese ermutigenden Ergebnisse heben den potenziellen Wert Antikörper-modifizierter Nanopartikel für eine spezifische Anreicherung in Tumorzellen hervor. Anti-HER2-NP binden effizient an HER2-überexprimierende Zellen (85%) und werden anschließend internalisiert. Im Anschluss wurde die Beladung von ASO in HSA-NP mit den erhaltenen Erkenntnissen Antikörpermodifizierter HSA-NP kombiniert. Zunächst wurde die Freisetzung von farbmarkierten ASO aus AK-modifizierten HSA-NP in SK-Br-3- und MCF7-Zellen untersucht. Durch die spezifische Aufnahme der AK-modifizierten HSA-NP gelangt bereits innerhalb der ersten Stunde deutlich mehr ASO in die Zelle. Die Zellaufnahme und Freisetzung in das Zytosol der Zelle ist abhängig vom HER2- Protein auf der Zelloberfläche und nimmt über 24 h stark zu. SK-Br-3-Zellen reichern das farbmarkierte ASO stärker als die MCF7-Zellen an. Wirksame ASOKonzentrationen können in SK-Br-3-Zellen mit einer sehr geringen Partikelkonzentration von nur 50 µg anti-HER2-NP/ml erzielt werden, während in MCF7- Zellen eine weit aus höhere Partikelkonzentration notwendig ist. Da die HER2- überexprimierenden Zellen, die für einen Antisense-Testung zur Verfügung standen, sich nicht für den Nachweis eines Antisense-Effektes eigneten, konnte die entwickelte Kombination von ASO-beladenen AK-modifizierten Albumin- Nanopartikeln nicht weiter getestet werden. In Kombination mit einem in die Nanopartikel inkorporierten Arzneistoff wird eine wirksame intrazelluläre Arzneistoffabgabe erwartet. Die Anwendung Antikörpermodifizierter Nanopartikel kann Arzneistoff-Trägereigenschaften mit einer zielgerichteten Tumortherapie kombinieren. Diese neue Generation von immunospezifischen Nanopartikeln sollte auf jeden Fall noch weiter im Einzelnen untersucht werden, um die Wirksamkeit dieser Arzneistoffträgersysteme unter in vitro und in vivo Bedingungen zu belegen

    Agglomeration und Finanzausgleich. Die Ursachen räumlicher Konzentration und die allokative Bedeutung interregionaler Transfers

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    Die räumliche Konzentration oder Agglomeration ist das hervorstechendste Merkmal der räumlichen Verteilung der Wirtschaft. Die räumliche Struktur der Bundesrepublik Deutschland ist durch eine ausgewogene dezentrale und damit relativ gleichmäßige und über die gesamte Gebietsfläche verteilte Konzentration von Bevölkerung, Arbeitsplätzen und Infrastruktur gekennzeichnet. Die Beschäftigung mit dem Phänomen geographischer Konzentration wirtschaftlicher Aktivitäten ist daher aus vielerlei Hinsicht von Interesse. Zunächst ist nach den Ursachen der Agglomerationsbildung zu fragen. Mit der Anfang der 90er Jahre beginnenden Entwicklung der Neuen Ökonomischen Geographie ist die Frage nach der Bedeutung von Skalenerträgen für das Entstehen von Agglomerationen verstärkt in den Blickpunkt der theoretischen Forschung gelangt. Als Gründe für das Entstehen von Agglomerationen können bessere Einkaufs-, Arbeits- und Absatzmöglichkeiten identifiziert werden. Als eine weitere Ursache räumlicher Konzentration treten lokale öffentliche Güter auf. Bereits Tiebout (1956) hat darauf hingewiesen, dass mobile Haushalte ihre Wanderungsentscheidung an den Preisen und der Verfügbarkeit lokaler öffentlicher Güter ausrichten. Dies gilt jedoch nur, wenn das zur Finanzierung der öffentlichen Güter erforderliche Steueraufkommen in den Regionen verbleibt. Werden die Steuereinnahmen hingegen umverteilt, ergeben sich hieraus Rückwirkungen auf die räumliche Verteilung. Die bestehenden Agglomerationen in Deutschland im Sinne von Städten oder Stadtstaaten sind eingebettet in umfangreiche und stark diskutierte Finanzausgleichssysteme. Hier erfahren sie eine Sonderbehandlung. Ein besonderes Charakteristikum der Finanzausgleichsysteme ist das in der Literatur scharf kritisierte Instrument der Einwohnerwertung. Neben der Frage, warum und wie Agglomerationen entstehen, sind daher institutionelle Gesichtspunkte relevant. Werden Finanzausgleichssysteme, wie beispielsweise in der Bundesrepublik Deutschland, zum Ausgleich regionaler Einnahmendisparitäten verwendet, so sind deren Wirkungen auf die räumliche Verteilung ökonomischer Aktivitäten zu untersuchen. Neben dieser positiven Analyse sind weiterhin die Wohlfahrtswirkungen der Maßnahmen zu analysieren, um zu klären, welche Rolle Agglomerationen in interregionalen Transfersystemen zukommen sollte. Sind sie, wie im bundesdeutschen Finanzausgleich, zu begünstigen, oder ist, wie die Kritiker der Einwohnerwertung vermuten lassen, eine Begünstigung gerade nicht zu rechtfertigen? Die Arbeit vermittelt einen Einblick über mögliche Ursachen räumlicher Konzentration, indem bestehende Modellansätze dargestellt und erweitert werden. Weiterhin wird die Bedeutung des Finanzausgleichs für Agglomerationen untersucht. Hierbei wird ermittelt, welchen Einfluss ein interregionaler Finanzausgleich auf die Bildung von Agglomerationen ausübt, und die Frage beantwortet, welche Rolle Agglomerationen in interregionalen Transfersystemen zukommen soll. Im Mittelpunkt der Analyse steht hierbei die mit der Kritik an der Einwohnerwertung aufgeworfene Frage, ob eine Begünstigung von Agglomerationen zu rechtfertigen ist

    Ultraschall-induzierte Destruktion von Plasmid-DNA-beladenen Microbubble-Vektoren : ein neues non-virales Vektorsystem für den lokalen Gentransfer

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    In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue virus-freie Transfektionsmethode für den vaskulären Gentransfer an einem ex vivo Modell an Koronararterien etabliert werden. Es wird gezeigt, daß durch ultraschall-induzierte Destruktion von Microbubble-Vektoren (UIMD) ein lokaler Transfer von Plasmid-DNA in die Gefäßwand mit hoher Effizienz und Sicherheit erzielt werden kann. Die Praktikabilität dieser Methode wird durch einen erfolgreichen eNOS-Gentransfer in die Gefäßwand unter Beweis gestellt. Dabei führen schon niedrige Plasmid-DNA-Konzentrationen zur Expression eines funktionell aktiven, rekombinanten eNOSmt-Proteins mit basal erhöhter NO-Produktion. Dies läßt sich bei der endothelialen Funktionstestung durch eine signifikante und nachweislich NO-vermittelte Reduktion der durch Prostaglandin F2α -induzierten Vasokonstriktion nachweisen. Zunächst konnte in dieser Arbeit erfolgreich gezeigt werden, daß es möglich ist, durch Zusatz von Plasmid-DNA bei der elektromechanischen Sonifikation von Humanalbumin Microbubble-Vektoren herzustellen, in deren Albuminschale die Plasmid-DNA inkorporiert ist. In einem nächsten Schritt konnte gezeigt werden, daß an dem in dieser Arbeit entwickelten ex vivo-Perfusions-Modell an Koronararterien durch ultraschallinduzierte Destruktion intravasal verabreichter Microbubble-Vektoren vor allem die Endothelzellschicht effizient mit Reporterplasmiden (LacZ) transfiziert werden kann. Dabei wurde zunächst ein Standardverfahren etabliert, bei dem die Koronararterien mit Microbubble-Vektoren bei einer Geschwindigkeit von 2 ml/min perfundiert und in einem definierten Ultraschallsektor für 5s im harmonic imaging-Modus gescannt wurden. Die Transfektionseffizienz korreliert dabei positiv mit der Konzentration an Microbubble-Vektoren im Perfusat. Experimente zum Einfluß der Perfusion auf die UIMD-Transfektion zeigten, daß die Perfusion mit 2ml/min verglichen mit statischen Versuchsbedingungen einen positiven Einfluß auf die Transfektionseffizienz nimmt. Eine Steigerung der Flußrate um den Faktor 5 geht jedoch mit einer signifikanten Abnahme der Expression rekombinanter ß-Galaktosidase mit verminderter Enzymaktivität in der Gefäßwand einher. Unter gleichen experimentellen Bedingungen konnte durch längere Ultraschallexpositionszeiten die Transgenexpression wiederum gesteigert werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit war es nachzuweisen, daß die UIMD-Transfektionsmethode an Leitarterien wie den Koronargefäßen ein sicheres Verfahren zum endothelialen Gentransfer darstellt und keine morphologischen oder funktionellen Endothelschäden hervorruft. Dies konnte histologisch und durch endothel-abhängige Funktionsmessungen an Gefäßringen von transfizierten Koronargefäßen erfolgreich gezeigt werden. Zudem ergaben Messungen der LDH-Enzymaktivität bei transfizierten Gefäßen kein Hinweis auf einen zytotoxischen Effekt der UIMD-Transfektionsmethode. In einem letzten Schritt konnte gezeigt werden, daß sich die UIMD-Transfektionsmethode exzellent für einen vaskulären eNOS-Gentransfer eignet. Erfolgreiche Transfektion gesunder Koronararterien mit dem phosphomimetischen eNOS-Konstrukt geht mit einem verminderten Gefäßtonus einher und führt zu einer etwa 60%igen NO-vermittelten Reduktion der durch Prostaglandingabe provozierten Gefäßkontraktion. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die ultraschall-unterstützte Transfektion mit Plasmid-DNA-beladenen Microbubbles ein sehr effizientes und nichttoxisches Verfahren zum non-viralen Gentransfer in die Gefäßwand von größeren Leitarterien darstellt. Die Herausforderung an die Zukunft wird sein, an verschiedenen in vivo Modellen die Praktikabilität dieser Methode sicherzustellen und zu zeigen, daß die hohe Transfektionseffizienz und Sicherheit auch in vivo gewährleistet ist. Dann könnten durch intravasale Injektion über katheter-basierte Verfahren oder sogar durch intravenöse Gabe gezielt vaskularisierte Organbereiche nicht-/ minimalinvasiv therapeutisch angegangen werden. So wäre nicht nur eine gentherapeutische Anwendung der UIMD-Methode bei kardiovaskulären Erkrankungen denkbar, sondern auch in der Onkologie als optionale Therapiemöglichkeit bei malignem Tumorleiden. Zum Beispiel könnte durch Transfektion mit anti-Tumoroder anti-Angiogenese- Genen lokal das Tumorwachstum gehemmt werden.Background: Progress in cardiovascular gene therapy has been hampered by concerns regarding the safety and practicality of viral vectors and the inefficiency of current nonviral transfection. This approach had the purpose to determine whether ultrasound-targeted destruction of plasmid DNA-loaded albumin microbubbles (UTMD) is an efficient and safe nonviral transfection technique for local vascular gene delivery. Methods and Results: Perfluoropropane-filled microbubbles were produced by sonication of 5% human serum albumin in the present of plasmid DNA encoding for ß-galactosidase or the phosphomimetic active endothelial nitric oxide synthase (eNOS S1177D). In this way plasmid DNA can be easily incorporated directly into the albumin microbubble shell. Application of diagnostic ultrasound (2.2MHz, 173fps, MI=1.2, USE=5s) to porcine coronary arteries perfused with plasmid DNA-loaded albumin microbubbles resulted in a marked vascular transgene expression without any functional impairment of vasoreactivity. Thus, plasmid DNA remains functional after the sonication procedure and ultrasound-targeted microbubble destruction. Detection of ß-galactosidase in LacZ-transfected arteries revealed a predominant staining of the endothelial cell layer. ß-galactosidase activity was significantly (~12-fold) enhanced in coronary arteries transfected with ultrasound-targeted destruction of LacZloaded microbubbles compared to transfection with plasmid DNA-loaded microbubbles without ultrasound or ultrasound-induced transfection with plasmid DNA alone. An increase in concentration of plasmid DNA-microbubbles correlated with an increase in UTMD-transfection efficiency, whereas an increase in flow velocity (2ml/min) enhanced transgene expression that however decreased using higher perfusion rates of 10ml/min. Western blotting revealed transgene expression of eNOS S1177D in protein extracts from UTMD-transfected coronary arteries. Vascular responsiveness was tested using prostaglandin F2α (PGF2α) and the NOS inhibitor Nω-monomethyl-L-arginine (LNMA). Compared to coronary artery segments treated with the expression plasmid alone, the PGF2α-mediated precontraction was inhibited (~60%) in segments transfected with eNOS S1177D and the contractile response to the application of LNMA was markedly enhanced. Conclusion: The UTMD-technique enhances gene expression and transfection efficiency of naked plasmid DNA without any apparent toxicity in ultrasound-targeted transfection of coronary arteries in vitro and may represent an improved avenue for therapeutic vascular gene delivery in vivo

    Finanzhilfen in Haushaltsnotlagen. Eine modelltheoretische und empirische Analyse vertikaler Transfers

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    Angesichts drohender lokaler Haushaltsnotlagen sehen sich übergeordnete Regierungen dazu veranlasst, finanzielle Hilfen an untergeordnete Gebietskörperschaften zu gewähren. Diese vertikalen Transfers können jedoch Anreize zu exzessiver Verschuldung auf der lokalen Ebene setzen, wenn die übergeordnete Ebene sich nicht an ein gesetzlich geregeltes Transfersystem binden oder die Ursache der Haushaltsnotlage nicht einwandfrei verifizieren kann. Die Arbeit befasst sich mit folgenden Fragestellungen: Wie müssen Finanzhilfen unter fehlender Bindung und unter asymmetrischer Information ausgestaltet werden, um die negativen Anreize zu minimieren? Liegt auf kommunaler Ebene das Problem der fehlenden Bindung oder der asymmetrischen Information vor? Im Fokus der modelltheoretischen und empirischen Analyse stehen die Fehlbetragszuweisungen in Schleswig-Holstein. Der erste Teil der Arbeit gibt einen institutionellen Überblick über die kommunalen Budgetregeln sowie rechtlichen Grundlagen für die Gewährung von Fehlbetragszuweisungen in Schleswig-Holstein. Im zweiten Teil der Arbeit wird modelltheoretisch und empirisch untersucht, ob die Zuweisungen aufgrund ihres diskretionären Charakters Kommunen zur Ausweitung ihrer Fehlbeträge verleiten. Im letzten Teil der Arbeit wird die Frage nach der optimalen Ausgestaltung konditionierter Finanzhilfen unter asymmetrischer Information beantwortet. In diesem Fall kann die Zentralregierung durch Auflagen in die Finanzautonomie der Zuweisungsempfänger derart eingreifen, dass Kommunen keinen Anreiz haben, sich strategisch zu hoch zu verschulden. Es werden anreizkompatible Transfersysteme bei Eingriff in die Schulden-, Steuer- und Ausgabenpolitik und bei vollkommener Beschränkung der Finanzautonomie modelltheoretisch analysiert und auf ihre Effizienz hin miteinander verglichen. Anhand der modelltheoretischen Ergebnisse wird abschließend empirisch überprüft, inwieweit das System der Fehlbetragszuweisungen in Schleswig-Holstein diesen Transfersystemen entspricht
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