16,778 research outputs found

    Language learning among higher education students: an analysis on motivation

    Get PDF
    Intrinsic motivation in language learning is ideal to attain successful foreign language learning according to experts (Del-Castillo, 2010; Gilakjani, Leong, & Sabouri, 2012). In order to measure its impact at university level, this paper shows the results of a quantitative study conducted at KU Leuven during the academic year 2021-2022 on motivation in foreign language learning. A total of 479 students participated in a survey designed for this purpose. The methodology was based on a multivariate analysis using the statistical package SPSS v. 25. The research findings show that university students have essentially instrumental motivation for learning foreign languages (FL), which implies that their desire to acquire a second language (L2) is limited to practical purposes. On the other hand, the study has identified a representative segment of students, referred to as ‚Äúin- cidental students‚ÄĚ, who are characterised by not having any clear motivation (neither instrumental nor integrative) for FL. The results lead to recommendations for curricular adaptation to enhance intrinsic motivation in foreign language teaching and learning at university level

    Global evaluation of the fitness and virulence determinants in the phytopathogen Ralstonia solanacearum

    No full text
    Programa de Doctorat en Gen√®tica / Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigen√≤mica (CRAG)[eng] Losses to plant pathogens pose a major threat to global agriculture and food security worldwide. In the context of globalisation and climate change, the emergence and dispersion of pathogens resistant to conventional management strategies causes destructive outbreaks. One of the most important bacterial phytopathogen is R. solanacearum, the causal agent of the bacterial wilt disease, infecting over 200 plant species. R. solanacearum colonises the vascular system of the plants and blocks the water flow by secreting exopolysaccharides, which causes the wilting symptoms. Moreover, it can persist and easily disperse through contaminated soil and waterways. Many different virulence factors have been studied to date but a comprehensive understanding of the transcriptional regulation during the life cycle of this pathogen is lacking. The huge genetic and phenotypic variability of this traditionally tropical pathogen has led to its spread and establishment in temperate regions. To prevent its dispersal and design efficient management strategies, inexistent to date, a thorough understanding of the pathogen infection and dispersion process is of paramount importance. In this thesis we set to characterise the transcriptomic landscape of R. solanacearum to unravel novel virulence and fitness determinants deployed by the pathogen throughout its life cycle. In the first two chapters, we studied the gene expression profile of the bacterium during in different stages of plant infection (Chapter 1 or C1) and the environmental soil and water stages (Chapter 2 or C2). Overall, we have identified a dynamic expression profile of different metabolism and virulence genes along the life cycle of the pathogen. Consistent with previous analysis, we identified that the Type III secretion system (T3SS) is also transcriptionally active at late stages of infection but also in water. Interestingly, we identified the alkali pH as a cue triggering T3SS expression in water, which links to the pH alkalinisation along infection inside the plant. Moreover, we validated the expression of different virulence factors in planta such as the flagellar or T4P motility along infection. In soil, we identified the expression of multiple metabolic pathways and stress-related genes that are required for the life of the bacterium in the soil. Among them, we described the induction of genes related to lignin degradation, and alternative metabolic pathways to synthetise carbon molecules related to stress tolerance. The last two chapters have the objective to characterise and describe specific genes potentially involved in virulence and/or fitness of R. solanacearum. In Chapter 3 (C3), we studied the role of the catalase KatE in detail. We proved its importance for the detoxification of the hydrogen peroxide but discovered that, possibly to redundancy, its mutation has no biological effect on the virulence or the life of the bacterium inside the plant. Finally, in Chapter 4 (C4), we took a different approach studying the secretome of R. solanacearum inside the apoplast and xylem sap of the plant. Many potential proteins related to virulence were discovered but we focused on the description of the S8 serine protease protein family. Preliminary results suggest that highly accumulated S8 proteases might be involved in the life of the bacterium inside the plant. To sum up, this thesis provides with a solid background to further study and characterise virulence and fitness factors important for the life cycle of the bacterium. Additionally, we started the description and characterisation of different potential virulence factors important for the bacterium. All this information might be of use in the future to have a comprehensive knowledge of the pathogen and to design novel and efficient management and control strategies.[cat] Les p√®rdues causades per pat√≤gens de plantes s√≥n una gran amena√ßa per a l'agricultura i la seguretat aliment√†ria en tot el m√≥n. En el context de la globalitzaci√≥ i el canvi clim√†tic, l'aparici√≥ i la dispersi√≥ de pat√≤gens resistents a les estrat√®gies de control convencionals provoquen brots destructius. Un dels fitopat√≤gens bacterians m√©s importants √©s R. solanacearum, l'agent causal de la malaltia del marciment bacteri√†, que afecta a m√©s de 200 esp√®cies de plantes. R. solanacearum colonitza el sistema vascular de les plantes i bloqueja el flux d'aigua secretant exopolisac√†rids, el que provoca el marciment. A m√©s, pot persistir i dispersar-se f√†cilment a trav√©s del s√≤l i les vies d'aigua contaminades. S'han estudiat molts factors de virul√®ncia diferents, per√≤ manca una comprensi√≥ exhaustiva de la regulaci√≥ transcripcional durant el cicle de vida d'aquest patogen. La gran variabilitat gen√®tica i fenot√≠pica d'aquest patogen tradicionalment tropical ha portat a la seva propagaci√≥ i establiment en regions temperades. Per prevenir la seva dispersi√≥ i dissenyar estrat√®gies de gesti√≥ eficients, inexistents fins ara, √©s de vital import√†ncia comprendre a fons el proc√©s d'infecci√≥ i dispersi√≥ del patogen. En aquesta tesi ens vam proposar caracteritzar el paisatge transcript√≤mic de R. solanacearum per desxifrar nous determinants de virul√®ncia i d‚Äôefic√†cia biol√≤gica desplegats pel patogen durant tot el seu cicle de vida. En els dos primers cap√≠tols, vam estudiar el perfil d'expressi√≥ g√®nica del bacteri durant diferents etapes d'infecci√≥ de les plantes (Cap√≠tol 1 o C1) i de les etapes ambientals del s√≤l i l'aigua (Cap√≠tol 2 o C2). En general, hem identificat un perfil d'expressi√≥ din√†mic de diferents gens de metabolisme i virul√®ncia al llarg del cicle de vida del patogen. Consistent amb an√†lisis anteriors, vam identificar que el sistema de secreci√≥ de tipus III (T3SS) tamb√© est√† transcripcionalment actiu en les etapes tardanes de la infecci√≥ i, inesperadament, tamb√© a l'aigua. Curiosament, vam identificar el pH alcal√≠ com un senyal que activa l'expressi√≥ del T3SS a l'aigua, que pot estar relacionada amb l'alcalinitzaci√≥ del pH durant la infecci√≥ dins de la planta. A m√©s, vam validar l'expressi√≥ de diferents factors de virul√®ncia en planta, com la motilitat flagel¬∑lar o T4P durant la infecci√≥. Al s√≤l, vam identificar l'expressi√≥ de m√ļltiples vies metab√≤liques i gens relacionats amb l'estr√®s que s√≥n necessaris per a la vida de la bacteri al s√≤l. Entre ells, vam descriure la inducci√≥ de gens relacionats amb la degradaci√≥ de la lignina i vies metab√≤liques alternatives per sintetitzar mol√®cules de carboni relacionades amb la toler√†ncia a l'estr√®s. Els dos √ļltims cap√≠tols tenen com a objectiu caracteritzar i descriure gens espec√≠fics potencialment implicats en la virul√®ncia i/o la superviv√®ncia de R. solanacearum. Al Cap√≠tol 3 (C3), vam estudiar detalladament el paper de la catalasa KatE. Vam demostrar la seva import√†ncia per a la detoxificaci√≥ del per√≤xid d‚Äôhidrogen, per√≤ vam descobrir que, possiblement degut a la redund√†ncia, la seva mutaci√≥ no t√© cap efecte biol√≤gic en la virul√®ncia o en la vida de la bacteri a l'interior de la planta. Finalment, al Cap√≠tol 4 (C4), vam adoptar una aproximaci√≥ diferent estudiant el secretoma de R. solanacearum dins l'apoplast i el xilema de la planta. Es van identificar moltes prote√Įnes potencials relacionades amb la virul√®ncia, per√≤ ens vam centrar en la descripci√≥ de la fam√≠lia de prote√Įnes de proteases serina S8. Els resultats preliminars suggereixen que les proteases S8, altament acumulades durant la infecci√≥, podrien estar involucrades en la vida de la bacteri dins de la planta. En resum, aquesta tesi proporciona un fonament s√≤lid per estudiar i caracteritzar factors de virul√®ncia i superviv√®ncia importants per al cicle de vida del bacteri. A m√©s, hem iniciat la descripci√≥ i caracteritzaci√≥ de diferents factors de virul√®ncia potencials importants per a la bacteri. Tota aquesta informaci√≥ podria ser √ļtil en el futur per tenir un coneixement exhaustiu del patogen i dissenyar noves estrat√®gies eficients de gesti√≥ i control de la malaltia

    Shaping endometrial cancer diagnosis via the identification of protein biomarkers in gynecological fluids

    No full text
    El c√†ncer d'endometri (CE) √©s el sis√® tumor m√©s com√ļ en dones a tot el m√≥n, amb 417.367 casos nous i 97.370 morts el 2020. El diagn√≤stic preco√ß del CE s'associa amb el 95% de la taxa de superviv√®ncia als 5 anys, mentre que el diagn√≤stic avan√ßat la redueix al 17%. Actualment, no existeix cap prova de cribratge per a la detecci√≥ preco√ß del CE. Nom√©s les dones que presenten els s√≠mptomes cl√†ssics del CE, principalment un sagnat uter√≠ anormal (SUA), inicien el llarg proc√©s de diagn√≤stic del CE, basat en l'obtenci√≥ invasiva de bi√≤psies endometrials. Aix√≤ suposa una gran c√†rrega per a la salut femenina, ja que el SUA √©s un s√≠mptoma molt poc espec√≠fic. Per tant, el desenvolupament i la implementaci√≥ d'una prova no invasiva per distingir les condicions benignes dels CE urgeix. A m√©s del diagn√≤stic, les bi√≤psies endometrials haurien de proporcionar informaci√≥ sobre la histologia i grau tumorals per avaluar del risc preoperatori en pacients amb CE, utilitzat per guiar el tractament quir√ļrgic. Malauradament, el limitat material contingut en les bi√≤psies i l'elevada variabilitat en la interpretaci√≥ patol√≤gica entre especialistes resulta en un 11% i 27% de discordances entre el diagn√≤stic preoperatori i el final en la determinaci√≥ del tipus i grau histol√≤gic, respectivament. Per tant, la mesura objectiva dels factors pron√≤stics i/o la identificaci√≥ de nous biomarcadors pron√≤stics tamb√© s√≥n urgents per guiar un tractament quir√ļrgic √≤ptim en pacients amb CE. L'objectiu d'aquesta tesi √©s posicionar els fluids ginecol√≤gics, com les bi√≤psies l√≠quides uterines i els fluids cervicals, com a font de biomarcadors de CE altament sensibles i espec√≠fics. En aquesta tesi, hem volgut identificar biomarcadors altament sensibles, espec√≠fics i reprodu√Įbles que millorin el diagn√≤stic i l'avaluaci√≥ del risc preoperatori dels tumors endometrials en fluids ginecol√≤gics, seguint dos enfocs diferents. El primer va ser investigar el fluid de les bi√≤psies pipelle, √©s a dir, els fluids uterins, com a font de biomarcadors de tipus i grau histol√≤gic, aix√≠ com la predicci√≥ de recurr√®ncia. Per aconseguir-ho, vam realitzar una extensa revisi√≥ liter√†ria identificant 255 prote√Įnes, 30 de les quals es van validar en un an√†lisi in-silico. Paral¬∑lelament, vam generar una biblioteca espectral amb el proteoma dels fluids uterins (n= 42 CE) que posteriorment es va utilitzar per realitzar un estudi cl√≠nic retrospectiu en fluids uterins de 149 pacients amb CE quantificats per espectrometria de masses (EM) d'adquisici√≥ independent de les dades. L'estudi va permetre definir panells de 2 prote√Įnes que permeten el diagn√≤stic del tipus histol√≤gic amb sensibilitats que oscil¬∑len entre el 90,9-100%, grau histol√≤gic amb una sensibilitat del 85,3%, i predir recurr√®ncia amb sensibilitats entre el 85,7-100%. Per avan√ßar en el diagn√≤stic del CE, el segon enfocament es va dirigir a la identificaci√≥ de biomarcadors proteics en fluids cervicals pel diagn√≤stic prec√≠s i no invasiu del CE. Vam realitzar dos estudis cl√≠nics retrospectius utilitzant els fluids cervicals, incloent un estudi de descobriment amb 59 pacients i un estudi de verificaci√≥ amb 241 pacients mitjan√ßant EM. Com a resultat, vam identificar biomarcadors de diagn√≤stic de CE i vam desenvolupar panells proteics que diagnostiquen el CE amb una sensibilitat del 95,4%. Adicionalment, vam identificar panells proteics per determinar el tipus i el grau histol√≤gic amb AUC de 0,91 i 0,97, respectivament. S'espera que els resultats d'aquesta tesi generin un canvi de paradigma en el maneig de les dones que pateixen SUA i millorin la detecci√≥ preco√ß del CE. Hem identificat panells de prote√Įnes que permeten una avaluaci√≥ objectiva i m√©s precisa del risc preoperatori per a pacients amb CE en fluids uterins i que permeten desenvolupar un diagn√≤stic de CE prec√≠s, objectiu i no invasiu basat en fluids cervicals.El c√°ncer de endometrio (CE) es el sexto tumor m√°s com√ļn en mujeres a nivel mundial, con 417.367 nuevos casos y 97.370 muertes en 2020. El diagn√≥stico temprano del CE se asocia con el 95% de la tasa de supervivencia a los 5 a√Īos, mientras que el diagn√≥stico avanzado la reduce hasta el 17%. Actualmente no existe ninguna prueba de cribado para la detecci√≥n precoz del CE. Solo las mujeres que presentan los s√≠ntomas cl√°sicos del CE, principalmente un sangrado uterino anormal (SUA), inician el largo proceso de diagn√≥stico del CE, basado en la obtenci√≥n invasiva de biopsias endometriales. Esto representa una gran carga para la salud de la mujer, ya que el SUA es un s√≠ntoma muy inespec√≠fico. Por lo tanto, urge el desarrollo y la implementaci√≥n de una prueba no invasiva para distinguir las patolog√≠as benignas de los CE. Adem√°s del diagn√≥stico, las biopsias endometriales deben proporcionar informaci√≥n sobre la histolog√≠a y grado tumorales para evaluar el riesgo preoperatorio en pacientes con CE, utilizado para guiar el tratamiento quir√ļrgico. Desafortunadamente, el limitado material contenido en las biopsias y la alta variabilidad en la interpretaci√≥n patol√≥gica entre especialistas resulta en un 11% y 27% de discordancias entre el diagn√≥stico preoperatorio y el final en la determinaci√≥n del tipo histol√≥gico y grado, respectivamente. Por lo tanto, la medici√≥n objetiva de los factores pron√≥sticos y/o la identificaci√≥n de nuevos biomarcadores pron√≥sticos tambi√©n se necesita con urgencia para guiar un tratamiento quir√ļrgico √≥ptimo en pacientes con CE. El objetivo de esta tesis es posicionar los fluidos ginecol√≥gicos, como las biopsias l√≠quidas uterinas y los fluidos cervicales, como fuente de biomarcadores de CE altamente sensibles y espec√≠ficos. En esta tesis, nuestro objetivo fue identificar biomarcadores altamente sensibles, espec√≠ficos y reproducibles que mejoraran el diagn√≥stico y la evaluaci√≥n del riesgo preoperatorio de tumores endometriales en fluidos ginecol√≥gicos, siguiendo dos enfoques diferentes. El primero fue investigar el fluido de las biopsias pipelle, es decir, los fluidos uterinos, como fuente de biomarcadores de tipo y grado histol√≥gico, y predicci√≥n de recurrencia. Para lograrlo, realizamos una extensa revisi√≥n literaria identificando 255 prote√≠nas, 30 de las cuales fueron validadas en un an√°lisis in-silico. Paralelamente, generamos una biblioteca espectral con el proteoma de fluidos uterinos (n=42 CE) que posteriormente se utiliz√≥ para realizar un estudio cl√≠nico retrospectivo en fluidos uterinos de 149 pacientes con CE cuantificados mediante espectrometr√≠a de masas (EM) de adquisici√≥n independiente de datos. El estudio permiti√≥ definir paneles de 2 prote√≠nas que permiten el diagn√≥stico de tipo histol√≥gico con sensibilidades entre el 90,9-100%, grado histol√≥gico con sensibilidad del 85,3%, y predicen recurrencia con sensibilidades del 85,7-100%. Para avanzar en el diagn√≥stico del CE, el segundo enfoque se dirigi√≥ a identificar biomarcadores proteicos en los fluidos cervicales para diagnosticar el CE de manera precisa y no invasiva. Realizamos dos estudios cl√≠nicos retrospectivos sobre fluidos cervicales, incluyendo un estudio de descubrimiento de 59 pacientes y un estudio de verificaci√≥n de 241 pacientes mediante EM. Como resultado, identificamos biomarcadores de diagn√≥stico de CE y desarrollamos paneles de prote√≠nas que diagnostican el CE llegando a una sensibilidad del 95,4%. Adem√°s, tambi√©n identificamos paneles de prote√≠nas para determinar el tipo histol√≥gico y el grado con AUCs de 0,91 y 0,97, respectivamente. Se espera que los resultados de esta tesis generen un cambio de paradigma en el manejo de las mujeres que sufren SUA y mejoren la detecci√≥n temprana del CE. Identificamos paneles de prote√≠nas que permiten una evaluaci√≥n objetiva y m√°s precisa del riesgo preoperatorio para pacientes con CE en fluidos uterinos, y que permiten el desarrollo de un diagn√≥stico preciso, objetivo y no invasivo del CE basado en fluidos cervicales.Endometrial cancer (EC) is the sixth most common tumor in women worldwide, with 417,367 new cases and 97,370 deaths in 2020. Early diagnosis of EC is associated with 95% of 5-year survival rate, while advanced diagnosis drops the survival rate down to 17%. Today, there is no screening test for the early detection of EC. Only women presenting the classic symptoms of EC, i.e., mainly an abnormal uterine bleeding (AUB), start the multistep process of EC diagnosis, which relies on the invasive acquisition of endometrial biopsies. This accounts for a huge burden for women's health since AUB is a highly unspecific symptom. Therefore, the development and implementation of a non-invasive test to distinguish benign from malignant conditions is urgently needed. In addition to diagnosis, endometrial biopsies should provide information regarding tumor histology and tumor grade to provide the pre-operative risk assessment in EC patients, which is used to guide the surgical treatment. Unfortunately, the limited material contained in endometrial biopsies and the high inter-observer variability in the pathological interpretation, results in 11% and 27% of discordances in the determination of EC histological type and grade, respectively, between preoperative and final diagnosis. Thus, the objective measurement of prognostic factors and/or the identification of novel prognostic biomarkers is as well urgently needed to guide an optimal EC surgical treatment. This thesis was performed aiming to position gynecological fluids, such as uterine liquid biopsies and cervical fluids, as a source of highly sensitive and specific EC biomarkers. In this thesis, we aimed to identify highly sensitive, specific, and reproducible biomarkers that improve the diagnosis and pre-operative risk assessment of EC tumors in gynecological fluids, following two different approaches. The first was to investigate the fluid of pipelle biopsies i.e., uterine fluids, as a source of biomarkers of histological type and grade, and recurrence prediction. To achieve this, we performed an extensive literature review identifying 255 proteins, 30 of which were further validated in an in-silico analysis. In parallel, we generated a spectral library with the proteome of uterine fluids (n=42 EC) that was subsequently used to conduct a clinical retrospective study in uterine fluids of 149 EC patients quantified by data-independent acquisition mass spectrometry (MS). The study allowed us to define panels of 2 proteins that allow diagnosis of histological type with sensitivities ranging from 90.9-100%, histological grade with sensitivity of 85.3%, and predict recurrence with sensitivities ranging from 85.7-100%. As a step towards advancing on EC diagnosis, the second approach was directed to investigate on the identification of protein biomarkers in cervical fluids to accurately and non-invasively diagnose EC. We conducted two clinical retrospective studies on cervical fluids, including a discovery study of 59 patients and a verification study of 241 patients by MS approaches. As a result, we identified EC diagnostic biomarkers and developed protein signatures that accurately diagnose EC with a sensitivity of 95.4%. Additionally, we also identify protein signatures to determine the histological type and grade with AUCs of 0.91 and 0.97, respectively. The results of this thesis are expected to generate a change in the paradigm on how clinicians manage women suffering from AUB, and to improve early detection of EC. We identified protein signatures that permit an objective and more accurate preoperative risk assessment for EC patients in uterine fluids, and that allow the development of a non-invasive, accurate and objective EC diagnosis based on cervical fluids

    El mòdul genèric del màster de secundària (MUFP): confluències i reptes de futur.

    Full text link
    Durant el curs 2022-2023 s’ha conformat un grup de treball dins del Programa de millora del Màster de Formació del Professorat de Secundària, Batxillerat, Formació Professional i Escoles Oficials d’idiomes (MUFP) en el que col·laboren tots els màsters de formació del professorat de secundària de les diferents universitats catalanes. El grup de treball és un grup promotor amb una persona representant de cada una de les universitats inicials que és representant o coordinadora del mòdul genèric de la seva universitat (UB, UAB, UOC-UPF, UPC, UdG) i una persona coordinadora del grup. Aquest programa va néixer amb la finalitat de coordinar totes aquelles accions que s’estan duent a terme, o es poden iniciar, en les diferents universitats catalanes que imparteixen aquest màster i que afavoreixen la millora de la formació en l’etapa de secundària. El sistema educatiu avança si es treballa de manera col·laborativa entre tots els agents implicats. Les accions realitzades per aconseguir els objectius marcats pel grup han consistit en fer un primer retrat del mòdul genèric tal i com s’està executant en les diferents universitats, pensant que aquest retrat pot ajudar a crear orientacions que facilitin la millora general d’aquest mòdul en els diferents contextos. S’han creat una sèrie de documents que recullen les diferents experiències en les 11 universitats i s’han realitzat unes jornades per tal de compartir experiències i valorar vies de millora del mòdul genèric.Programa de millora del Màster de Formació del Professorat de Secundària, Batxillerat, Formació Professional i Escoles Oficials d’idiomes (PmMUFPS)

    Relevant deubiquitinating enzymes in cilium formation and function in the retina: USP48

    Full text link
    [eng] Ciliopathies encompass a broad group of heterogeneous inherited disorders associated with dysfunction of the cilium, a ubiquitous microtubule-based organelle that translates extracellular stimuli into cellular responses. The retina is one of the most affected tissues by mutations in ciliary genes due to the highly specialised neurosensory cilium that photoreceptors possess, known as outer segment, where photoreception and phototransduction occur. To date, mutations in more than 100 ciliary genes have been associated with retinal degeneration, accounting for almost 25 % of inherited retinal dystrophy (IRD) cases. Proteins related to the ubiquitin-proteasome system play a pivotal role during retinal differentiation and ciliogenesis of photoreceptor cells. In fact, mutations in several genes involved in ubiquitination and proteostasis have been identified as underlying causes of IRDs and/or ciliopathies. USP48 is a deubiquitinating enzyme whose role in the retina is still unexplored. However, previous reports reveal its relevance for neurosensory organs since dominant mutations in this gene are causative of hearing loss. Building upon prior findings regarding USP48 expression in the retina, we sought to uncover USP48 involvement in retinal development and cilium function with the ultimate aim to gather evidences to nominate it as a new candidate gene for unsolved cases of retinal ciliopathies. We demonstrated that USP48 is highly expressed in cones in mouse retinas, in agreement with previous RNA-seq data. Furthermore, we described for the first time that a pool of endogenous USP48 localises to the basal body in retinal cell lines, independently of the cell cycle phase. Intriguingly, the overexpressed full-length and Cterminal isoforms fail to localise to the basal body in serum-starved hTERT-RPE1 cells, raising questions about which USP48 protein isoform precisely localises to the basal body and centrosome. Moreover, neither USP48 overexpression nor siRNA-based silencing affects ciliogenesis or cilium length. However, proteomic analysis of mouse retinas revealed that several USP48 interactors had cilium-related functions. Among USP48 partners, ARL3 and UNC119a drew our attention due to their association with retinal ciliopathies and involvement in protein transport in photoreceptor cilia. Subsequent in vitro analysis indicated that USP48 increases ARL3 and UNC119a protein levels through different mechanisms and interacts with them via distinct protein domains. Furthermore, USP48 is also able to increase the protein levels of different ARL3 mutants. These findings collectively indicate that USP48 could play a role in regulating key ciliary proteins, thereby modulating intracellular protein transport and ciliary trafficking to the photoreceptor outer segment, crucial to maintain photoreceptor homeostasis and function. Due to limitations of cell-based studies ‚Äď which involve transient transgenesis with a short time frame for system manipulation ‚Äď and the necessity for a retinal tissue context, we further aimed to generate a USP48-/- human induced pluripotent stem cell (iPSC) line by CRISPR/Cas9. The subsequent differentiation into retinal organoids would allow the study of the retinal and cilium alterations caused by the absence of USP48 during retinal development and differentiation. Unfortunately, we could not identify a homozygous iPSC colony for USP48 deletion, suggesting the deletion of both USP48 loci might lethal in iPSCs. Notably, USP48+/- iPSCs displayed a severe ciliary phenotype, indicating that USP48 haploinsufficiency is disrupting key cellular pathways for cilium formation and further hinting at the potential lethality due to the USP48 knockout. Finally, the differentiation for the USP48+/- iPSC line alongside the BJ iPSC control line was initiated and the phenotypical characterisation of the retinal organoids is still ongoing. In conclusion, our investigation demonstrates that USP48 is a new ciliary regulator that potentially modulates intracellular and ciliary protein transport in the retina. Consequently, we posit USP48 as a new candidate gene for retinal ciliopathies. Finally, the studies in retinal organoids promise to shed light on USP48 role in the retina and photoreceptor cilia.[cat] Les ciliopaties s√≥n un grup heterogeni de trastorns hereditaris causats per la disfunci√≥ del cili, un org√†nul constitu√Įt de microt√ļbuls que tradueix est√≠muls externs a respostes cel¬∑lulars. La retina √©s un dels teixits m√©s afectats per mutacions a gens ciliars degut al cili neurosensorial altament especialitzat que tenen els fotoreceptors. S‚Äôhan identificat mutacions en m√©s de 100 gens ciliars en pacients amb degeneraci√≥ de la retina, comptabilitzant gaireb√© el 25 % dels casos de distr√≤fies heredit√†ries de la retina (IRDs). Cal remarcar que el sistema ubiquitinaproteasoma √©s rellevant durant la diferenciaci√≥ de la retina i la ciliog√®nesi i, de fet, mutacions a diversos gens implicats en la proteostasi s‚Äôhan associat tant a IRDs com a ciliopaties. USP48 √©s un enzim deubiquitinant de funci√≥ desconeguda a la retina. Basant-nos en estudis previs, aquesta tesi s‚Äôenfoca a determinar el paper d‚ÄôUSP48 a la retina i al cili per tal de proposar-lo com un nou gen candidat per casos sense resoldre de ciliopaties de retina. USP48 localitza a la base del cili a c√®l¬∑lules humanes de la retina i hem identificat les prote√Įnes ciliars ARL3 i UNC119a com a interactors. Aquests resultats indiquen que USP48 podria estar modulant el transport intracel¬∑lular i ciliar, necessari per l‚Äôhome√≤stasi i funci√≥ dels fotoreceptors, a trav√©s de la regulaci√≥ de prote√Įnes ciliars clau. Un dels objectius de la tesi consisteix en generar una l√≠nia de c√®l¬∑lules mare pluripotents indu√Įdes (iPSCs) amb la deleci√≥ del gen USP48 (USP48-/-), per despr√©s diferenciar-les a organoids de retina i realitzar an√†lisis fenot√≠piques de les alteracions ciliars causades per la manca d‚ÄôUSP48. Cal remarcar que no s‚Äôha identificat cap col√≤nia USP48-/-, per√≤ s√≠ USP48+/-, suggerint que la deleci√≥ dels dos al¬∑lels d‚ÄôUSP48 podria ser letal en iPSCs. La caracteritzaci√≥ de les iPSCs USP48+/- ha revelat que l‚Äôhaploinsufici√®ncia d‚ÄôUSP48 causa defectes en la formaci√≥ del cili, ressaltant la import√†ncia d‚ÄôUSP48 en el fenotip ciliar i evidenciant la potencial letalitat de la deleci√≥ d‚ÄôUSP48 en homozigosi. En el moment del dip√≤sit d‚Äôaquesta tesi, la diferenciaci√≥ dels organoids USP48+/- estava en progr√©s. En resum, la nostra recerca demostra que USP48 √©s un nou regulador ciliar que potencialment modula el transport intracel¬∑lular i ciliar a la retina. Aix√≠ doncs, proposem USP48 com un nou gen candidat de ciliopaties de retina. Finalment, els estudis en curs als organoids de retina permetran dilucidar el rol d‚ÄôUSP48 a la retina i al cili dels fotoreceptors

    Exploiting circulating lymphocytes and cell-free DNA as a source to develop minimally-invasive personalized T-cell therapies

    No full text
    Tesi realitzada al Vall d'Hebron Institut d'Oncologia (VHIO) / Programa de Doctorat en Biomedicina[eng] Adoptive cell transfer (ACT) of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can medi- ate tumor regression in patients with metastatic melanoma. Retrospective studies of TIL products from responders and non-responders have shown that successful TIL-ACT is associated with an expansion of T cells targeting neoantigens, which are derived from tumor-specific non-synonymous somatic mutations (NSMs) and present exquisite tumor specificity. In addition, ACT with TIL products enriched for neoantigen recognition has demonstrated antitumor activity in selected patients with epithelial tumors other than melanoma, which has fueled the interest in personalized T-cell therapies targeting neo- antigens. The identification and isolation of neoantigen-specific TILs has been possible due to advances in next-generation sequencing that enabled the rapid assessment of the tumor mutational landscape and the development of high-throughput personalized im- munological screenings. However, the need of a tumor biopsy to both identify candidate neoantigens and reactive T cells limits the broad applicability of personalized T-cell ther- apies targeting neoantigens and can underestimate tumor heterogeneity in the advanced metastatic setting. Previous reports have shown that neoantigen-specific T cells can be enriched from peripheral blood by selecting programmed death receptor-1 (PD-1)-ex- pressing lymphocytes in circulation. However, the frequency of neoantigen-specific T cells identified based on PD-1 expression remains very low and a tumor biopsy is still re- quired to identify candidate NSMs. In this thesis, we explored the use of peripheral blood as an alternative minimal- ly-invasive source to identify tumor NSMs and isolate neoantigen-specific or tumor-reac- tive T lymphocytes in patients with metastatic breast, gynecological, colorectal and head and neck cancer or chordoma. We performed whole-exome sequencing (WES) of cell-free DNA (cfDNA) to identify tumor NSMs and compared these to those identified in DNA ex- tracted from tumor biopsies (TuBx DNA). In parallel, we evaluated whether the selection of peripheral blood lymphocytes (PBLs) expressing a combination of cell-surface recep- tors, rather than the expression of PD-1 alone, could further enhance the frequency of neo- antigen-specific T cells and T-cell receptors (TCR) detected or the number of neoantigens recognized. Toidentifycirculating tumor antigen-specific T cells, wesorted CD8+ and CD4+ PBLs of ten patients with different types of epithelial cancers based on the expression of PD-1 into PD-1hi, PD-1dim and PD-1-, and in combination with the cell-surface receptors CD27, CD38, CD39, HLA-DR and 4-1BB, obtaining up to 35 CD8+ and 35 CD4+ T-cell populations for some of the patients studied. In parallel, we also expanded TILs from tumor biopsies and compared the reactivities detected in the two T-cell sources. Ex vivo expanded PBL subsets and TILs were screened using a personalized high-throughput screening strategy, which enabled the detection of T cells targeting neoantigens identified by WES from TuBx DNA and cfDNA as well as T cells recognizing cancer germline antigens. Using this approach, we detected tumor antigen-specific T cells in eight out of 10 patients analyzed. Both CD8+ and CD4+ tumor antigen-reactive T cells were preferentially enriched in T-cell subsets expressing high levels of PD-1, either alone or in combination with other cell- surface markers, being PD-1hiCD39+ the combination of markers that more consistently identified CD4+ and CD8+ tumor reactivities. More importantly, the frequency of tumor antigen-specific T lymphocytes contained in the CD8+ PD-1hiCD39+ population was consistently higher than in any other CD8+ population sorted. This was not observed in CD4+ PBLs since the frequency of neoantigen-specific T cells was highly variable among PBL populations and none of them consistently displayed higher frequencies of neoantigen-reactive lymphocytes. The selection and expansion of CD8+ PD-1hiCD39+ PBLs outperformed the classical non-specific TIL expansion in high-dose interleukin-2 (IL-2) at identifying anti-tumor CD8+ T-cell responses. In contrast, despite the total number of CD4+ reactivities detected considering all populations screened from blood was higher than in TILs, the CD4+ PD-1hiCD39+ T-cell subpopulation identified fewer reactivities than unselected TILs. When comparing tumor and cfDNA, the overlap between NSMs identified in tumor and cfDNA varied notably between patients, with two out of six patients displaying no overlap between TuBx DNA and cfDNA WES. Moreover, WES of cfDNA from six patients preferentially identified clonal somatic mutations in tumor biopsies and enabled the identification of eight of 13 neoantigens in patients displaying some degree of overlap between tumor and cell-free NSMs. Our results underscore peripheral blood as an alternative source to identify cancer-specific neoantigens and CD8+ and CD4+ neoantigen- specific T lymphocytes and TCRs, with important implications for exploiting personalized T-cell responses in advanced cancer patients.[cat] La ter√†pia adoptiva amb c√®l¬∑lules T infiltrants de tumor (TILs) ha demostrat capacitat de mediar regressi√≥ de lesions tumorals en pacients amb melanoma metast√†tic. Estudis retrospectius dels productes cel¬∑lulars utilitzats per tractar pacients que van respondre o no a la ter√†pia han demostrat que la resposta a la ter√†pia adoptiva amb TILs va associada a una major expansi√≥ de c√®l¬∑lules T amb capacitat de recon√®ixer neoant√≠gens, els quals s√≥n p√®ptids que deriven de mutacions som√†tiques no sin√≤nimes (NSMs) espec√≠fiques del tumor. A m√©s, la ter√†pia adoptiva amb productes enriquits amb TILs espec√≠fics contra neoant√≠gens ha demostrat activitat antitumoral en pacients amb diferents tipus de tumors epitelials el que ha promogut l‚Äôinter√®s en el desenvolupament de ter√†pies personalitzades amb limf√≤cits T reactius contra neoant√≠gens. La identificaci√≥ i a√Įllament de limf√≤cits T reactius contra neoant√≠gens ha sigut possible gr√†cies als aven√ßos en les t√®cniques de seq√ľenciaci√≥ el que ha perm√®s una r√†pida avaluaci√≥ del repertori mutacional del tumor aix√≠ com el desenvolupament d‚Äôassajos personalitzats per testar el seu reconeixement. Tot i aix√≤, la necessitat d‚Äôaccedir a una bi√≤psia tumoral tant per identificar els neoant√≠gens candidats com per a√Įllar els limf√≤cits T ha limitat l‚Äôaplicabilitat de les ter√†pies personalitzades basades en c√®l¬∑lules T i a m√©s a m√©s, pot subestimar la heterogene√Įtat tumoral en tumors metast√†tics. Estudis previs han demostrat que els limf√≤cits T reactius contra neoant√≠gens es poden identificar en sang perif√®rica a trav√©s de la selecci√≥ de c√®l¬∑lules T amb expressi√≥ del receptor de mort programada tipus 1 (PD-1). Tanmateix, la freq√ľ√®ncia de c√®l¬∑lules T reactives contra neoant√≠gens despr√©s de seleccionar els limf√≤cits T que expressen PD-1 √©s molt baixa. A m√©s, segueix sent necess√†ria l'obtenci√≥ d'una bi√≤psia tumoral per tal de poder identificar les mutacions no sin√≤nimes del tumor. En aquesta tesi doctoral hem explorat com a ter√†pia m√≠nimament invasiva l‚Äô√ļs de sang perif√®rica per identificar les NSMs del tumor i per a√Įllar els limf√≤cits T espec√≠fics contra neoant√≠gens o contra altres ant√≠gens tumorals en pacients amb c√†ncer de mama, ginecol√≤gic, colorectal, de cap i coll o cordoma, tots en estat metast√†tic. Per aix√≤, hem seq√ľenciat l‚ÄôADN circulant a√Įllat de la sang per tal d‚Äôidentificar mutacions que puguin provenir del tumor i les hem comparat amb aquelles identificades en l‚ÄôADN extret de bi√≤psies tumorals dels mateixos pacients. Paral¬∑lelament, hem seleccionat limf√≤cits de la sang perif√®rica en base a l‚Äôexpressi√≥ simult√†nia de diversos receptors de superf√≠cie amb l‚Äôobjectiu de veure si la co-expressi√≥ de receptors pot millorar la freq√ľ√®ncia de c√®l¬∑lules T espec√≠fiques contra neoant√≠gens o b√© incrementar el repertori de receptors de c√®l¬∑lules T (TCRs) reconeixent un mateix neoantigen comparat amb l‚Äôexpressi√≥ exclusiva de PD-1. Per tal d‚Äôidentificar c√®l¬∑lules T reactives contra neoant√≠gens en la sang perif√®rica, vam separar per citometria de flux limf√≤cits CD8 i CD4 de deu pacients amb diferents tipus de tumors epitelials en base al nivell d‚Äôexpressi√≥ de PD-1 en els grups: PD-1hi, PD- 1dim, PD-1- i en combinaci√≥ amb altres receptors de superf√≠cie com CD27, CD39, CD38, HLA-DR i 4-1BB, obtenint fins a 35 poblacions diferents tant pels limf√≤cits CD8 com pels CD4 per alguns dels pacients inclosos en l‚Äôestudi. Paral¬∑lelament, tamb√© vam expandir els TILs de les bi√≤psies tumorals d‚Äôaquests pacients i vam comparar els neoant√≠gens o ant√≠gens tumorals reconeguts per aquestes dues fonts de limf√≤cits T. Les c√®l¬∑lules T de sang perif√®rica o infiltrants de tumor es van expandir ex vivo i es van testar en assajos funcionals personalitzats el que ens va permetre detectar c√®l¬∑lules T amb capacitat de recon√®ixer neoant√≠gens identificats per seq√ľenciaci√≥ de l‚Äôexoma tant de l‚ÄôADN extret de bi√≤psies tumorals com de l‚ÄôADN circulant i ant√≠gens tumorals de l√≠nia germinal expressats en la bi√≤psia tumoral. Utilitzant aquesta aproximaci√≥, es van detectar c√®l¬∑lules T reactives contra neoant√≠gens en vuit dels deu pacients estudiats. En la majoria dels casos, els limf√≤cits CD8 i CD4 reactius es van identificar en poblacions que expressaven alts nivells de PD-1 (PD-1hi), sol o en combinaci√≥ amb altres marcadors, sent PD-1hiCD39+ la combinaci√≥ que identificava limf√≤cits T reactius contra ant√≠gens tumorals de manera m√©s consistent. A m√©s, en els limf√≤cits CD8+, la poblaci√≥ PD-1hiCD39+ sempre contenia la freq√ľ√®ncia m√©s elevada de limf√≤cits reactius en el cas que aquests s‚Äôhaguessin identificat en diferents poblacions separades de la sang. Aquesta darrera observaci√≥ no aplica pels limf√≤cits CD4+ ja que en aquest cas cap de les poblacions contenia la freq√ľ√®ncia m√©s alta de limf√≤cits T reactius contra neoant√≠gens de manera consistent. La selecci√≥ i expansi√≥ de limf√≤cits CD8+ PD-1hiCD39+ de la sang perif√®rica va permetre capturar un major nombre de reactivitats contra ant√≠gens tumorals que l‚Äôestablert sistema d‚Äôexpansi√≥ inespec√≠fica de TILs en pres√®ncia d‚Äôaltes dosis d‚Äôinterleuquina-2 (IL-2). Per altra banda, tot i que el nombre total de reactivitats identificades en les poblacions de limf√≤cits CD4+ a√Įllades de la sang perif√®rica √©s superior a les identificades en els TILs, la combinaci√≥ CD4+ PD- 1hiCD39+ identifica menys reactivitats que les detectades en els TILs. Pel que fa a les NSMs identificades en l‚ÄôADN tumoral i en l‚ÄôADN circulant, vam observar que el nombre de mutacions compartides entre les dues fonts d‚ÄôADN era altament variable, essent nul en dos dels sis pacients estudiats. La seq√ľenciaci√≥ d‚Äôexoma de l‚ÄôADN circulant dels sis pacients va identificar preferencialment mutacions som√†tiques clonals en les bi√≤psies tumorals. Tamb√© va permetre la identificaci√≥ de vuit dels 13 neoant√≠gens detectats en pacients que mostraven un cert grau de solapament entre les NSMs detectades en l‚ÄôADN extret de la bi√≤psia tumoral i l‚ÄôADN circulant. En resum, els nostres resultats demostren que l'√ļs exclusiu de sang perif√®rica permet detectar neoant√≠gens i els limf√≤cits CD4+ i CD8+ capa√ßos de recon√®ixer aquest tipus d'ant√≠gens tumorals el que t√© implicacions importants pel desenvolupament de ter√†pies cel¬∑lulars personalitzades en pacients amb tumors avan√ßats.[spa] En esta tesis, el objetivo principal era explorar la sangre perif√©rica para poder identificar neoant√≠genos tumorales y los linfocitos capaces de reconocerlos. Para conseguir este objetivo, se realiz√≥ la secuenciaci√≥n del exoma del ADN circulante extra√≠do de muestras de plasma as√≠ como la secuenciaci√≥n del ADN extra√≠do de biopsias tumorales. Paralelamente, se seleccionaron diferentes poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ de la sangre en base a la expresi√≥n de ciertos marcadores de co-estimulaci√≥n o inhibici√≥n y se testaron usando ensayos funcionales inmunol√≥gicos personalizados para ver su capacidad de reconocer neoant√≠genos y otros ant√≠genos tumorales. Mediante estos an√°lisis, se detectaron un total de 15 reactividades en la sangre, 8 CD8+ y 7 CD4+. En el caso de los CD8+, se observ√≥ que la poblaci√≥n CD8+ PD-1hi CD39+ era la poblaci√≥n que conten√≠a m√°s reactividades contra ant√≠genos tumorales y que conten√≠a la frecuencia m√°s alta de linfocitos reactivos. En el caso de los CD4+, la poblaci√≥n PD-1hiCD39+ tambi√©n fue la poblaci√≥n que identific√≥ m√°s reactividades aunque no detect√≥ una proporci√≥n alta de reactividades indicando que esta puede no ser la mejor combinaci√≥n de marcadores para CD4+. Por otro lado, la secuenciaci√≥n del ADN circulante permiti√≥ identificar 8 de los 13 neoant√≠genos detectados en los 6 pacientes en los que se secuenci√≥n el ADN circulante. Por tanto, estos resultados demuestran que es posible utilizar la sangre perif√©rica para identificar neoant√≠genos y linfocitos espec√≠ficos contra neoant√≠genos lo que puede permitir el desarrollo de ter√°pias celulares personalizadas m√≠nimamente invasivas √ļnicamente utilitzando la sangre perif√©rica

    Exploiting circulating lymphocytes and cell-free DNA as a source to develop minimally-invasive personalized T-cell therapies

    Full text link
    [eng] Adoptive cell transfer (ACT) of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can medi- ate tumor regression in patients with metastatic melanoma. Retrospective studies of TIL products from responders and non-responders have shown that successful TIL-ACT is associated with an expansion of T cells targeting neoantigens, which are derived from tumor-specific non-synonymous somatic mutations (NSMs) and present exquisite tumor specificity. In addition, ACT with TIL products enriched for neoantigen recognition has demonstrated antitumor activity in selected patients with epithelial tumors other than melanoma, which has fueled the interest in personalized T-cell therapies targeting neo- antigens. The identification and isolation of neoantigen-specific TILs has been possible due to advances in next-generation sequencing that enabled the rapid assessment of the tumor mutational landscape and the development of high-throughput personalized im- munological screenings. However, the need of a tumor biopsy to both identify candidate neoantigens and reactive T cells limits the broad applicability of personalized T-cell ther- apies targeting neoantigens and can underestimate tumor heterogeneity in the advanced metastatic setting. Previous reports have shown that neoantigen-specific T cells can be enriched from peripheral blood by selecting programmed death receptor-1 (PD-1)-ex- pressing lymphocytes in circulation. However, the frequency of neoantigen-specific T cells identified based on PD-1 expression remains very low and a tumor biopsy is still re- quired to identify candidate NSMs. In this thesis, we explored the use of peripheral blood as an alternative minimal- ly-invasive source to identify tumor NSMs and isolate neoantigen-specific or tumor-reac- tive T lymphocytes in patients with metastatic breast, gynecological, colorectal and head and neck cancer or chordoma. We performed whole-exome sequencing (WES) of cell-free DNA (cfDNA) to identify tumor NSMs and compared these to those identified in DNA ex- tracted from tumor biopsies (TuBx DNA). In parallel, we evaluated whether the selection of peripheral blood lymphocytes (PBLs) expressing a combination of cell-surface recep- tors, rather than the expression of PD-1 alone, could further enhance the frequency of neo- antigen-specific T cells and T-cell receptors (TCR) detected or the number of neoantigens recognized. Toidentifycirculating tumor antigen-specific T cells, wesorted CD8+ and CD4+ PBLs of ten patients with different types of epithelial cancers based on the expression of PD-1 into PD-1hi, PD-1dim and PD-1-, and in combination with the cell-surface receptors CD27, CD38, CD39, HLA-DR and 4-1BB, obtaining up to 35 CD8+ and 35 CD4+ T-cell populations for some of the patients studied. In parallel, we also expanded TILs from tumor biopsies and compared the reactivities detected in the two T-cell sources. Ex vivo expanded PBL subsets and TILs were screened using a personalized high-throughput screening strategy, which enabled the detection of T cells targeting neoantigens identified by WES from TuBx DNA and cfDNA as well as T cells recognizing cancer germline antigens. Using this approach, we detected tumor antigen-specific T cells in eight out of 10 patients analyzed. Both CD8+ and CD4+ tumor antigen-reactive T cells were preferentially enriched in T-cell subsets expressing high levels of PD-1, either alone or in combination with other cell- surface markers, being PD-1hiCD39+ the combination of markers that more consistently identified CD4+ and CD8+ tumor reactivities. More importantly, the frequency of tumor antigen-specific T lymphocytes contained in the CD8+ PD-1hiCD39+ population was consistently higher than in any other CD8+ population sorted. This was not observed in CD4+ PBLs since the frequency of neoantigen-specific T cells was highly variable among PBL populations and none of them consistently displayed higher frequencies of neoantigen-reactive lymphocytes. The selection and expansion of CD8+ PD-1hiCD39+ PBLs outperformed the classical non-specific TIL expansion in high-dose interleukin-2 (IL-2) at identifying anti-tumor CD8+ T-cell responses. In contrast, despite the total number of CD4+ reactivities detected considering all populations screened from blood was higher than in TILs, the CD4+ PD-1hiCD39+ T-cell subpopulation identified fewer reactivities than unselected TILs. When comparing tumor and cfDNA, the overlap between NSMs identified in tumor and cfDNA varied notably between patients, with two out of six patients displaying no overlap between TuBx DNA and cfDNA WES. Moreover, WES of cfDNA from six patients preferentially identified clonal somatic mutations in tumor biopsies and enabled the identification of eight of 13 neoantigens in patients displaying some degree of overlap between tumor and cell-free NSMs. Our results underscore peripheral blood as an alternative source to identify cancer-specific neoantigens and CD8+ and CD4+ neoantigen- specific T lymphocytes and TCRs, with important implications for exploiting personalized T-cell responses in advanced cancer patients.[cat] La ter√†pia adoptiva amb c√®l¬∑lules T infiltrants de tumor (TILs) ha demostrat capacitat de mediar regressi√≥ de lesions tumorals en pacients amb melanoma metast√†tic. Estudis retrospectius dels productes cel¬∑lulars utilitzats per tractar pacients que van respondre o no a la ter√†pia han demostrat que la resposta a la ter√†pia adoptiva amb TILs va associada a una major expansi√≥ de c√®l¬∑lules T amb capacitat de recon√®ixer neoant√≠gens, els quals s√≥n p√®ptids que deriven de mutacions som√†tiques no sin√≤nimes (NSMs) espec√≠fiques del tumor. A m√©s, la ter√†pia adoptiva amb productes enriquits amb TILs espec√≠fics contra neoant√≠gens ha demostrat activitat antitumoral en pacients amb diferents tipus de tumors epitelials el que ha promogut l‚Äôinter√®s en el desenvolupament de ter√†pies personalitzades amb limf√≤cits T reactius contra neoant√≠gens. La identificaci√≥ i a√Įllament de limf√≤cits T reactius contra neoant√≠gens ha sigut possible gr√†cies als aven√ßos en les t√®cniques de seq√ľenciaci√≥ el que ha perm√®s una r√†pida avaluaci√≥ del repertori mutacional del tumor aix√≠ com el desenvolupament d‚Äôassajos personalitzats per testar el seu reconeixement. Tot i aix√≤, la necessitat d‚Äôaccedir a una bi√≤psia tumoral tant per identificar els neoant√≠gens candidats com per a√Įllar els limf√≤cits T ha limitat l‚Äôaplicabilitat de les ter√†pies personalitzades basades en c√®l¬∑lules T i a m√©s a m√©s, pot subestimar la heterogene√Įtat tumoral en tumors metast√†tics. Estudis previs han demostrat que els limf√≤cits T reactius contra neoant√≠gens es poden identificar en sang perif√®rica a trav√©s de la selecci√≥ de c√®l¬∑lules T amb expressi√≥ del receptor de mort programada tipus 1 (PD-1). Tanmateix, la freq√ľ√®ncia de c√®l¬∑lules T reactives contra neoant√≠gens despr√©s de seleccionar els limf√≤cits T que expressen PD-1 √©s molt baixa. A m√©s, segueix sent necess√†ria l'obtenci√≥ d'una bi√≤psia tumoral per tal de poder identificar les mutacions no sin√≤nimes del tumor. En aquesta tesi doctoral hem explorat com a ter√†pia m√≠nimament invasiva l‚Äô√ļs de sang perif√®rica per identificar les NSMs del tumor i per a√Įllar els limf√≤cits T espec√≠fics contra neoant√≠gens o contra altres ant√≠gens tumorals en pacients amb c√†ncer de mama, ginecol√≤gic, colorectal, de cap i coll o cordoma, tots en estat metast√†tic. Per aix√≤, hem seq√ľenciat l‚ÄôADN circulant a√Įllat de la sang per tal d‚Äôidentificar mutacions que puguin provenir del tumor i les hem comparat amb aquelles identificades en l‚ÄôADN extret de bi√≤psies tumorals dels mateixos pacients. Paral¬∑lelament, hem seleccionat limf√≤cits de la sang perif√®rica en base a l‚Äôexpressi√≥ simult√†nia de diversos receptors de superf√≠cie amb l‚Äôobjectiu de veure si la co-expressi√≥ de receptors pot millorar la freq√ľ√®ncia de c√®l¬∑lules T espec√≠fiques contra neoant√≠gens o b√© incrementar el repertori de receptors de c√®l¬∑lules T (TCRs) reconeixent un mateix neoantigen comparat amb l‚Äôexpressi√≥ exclusiva de PD-1. Per tal d‚Äôidentificar c√®l¬∑lules T reactives contra neoant√≠gens en la sang perif√®rica, vam separar per citometria de flux limf√≤cits CD8 i CD4 de deu pacients amb diferents tipus de tumors epitelials en base al nivell d‚Äôexpressi√≥ de PD-1 en els grups: PD-1hi, PD- 1dim, PD-1- i en combinaci√≥ amb altres receptors de superf√≠cie com CD27, CD39, CD38, HLA-DR i 4-1BB, obtenint fins a 35 poblacions diferents tant pels limf√≤cits CD8 com pels CD4 per alguns dels pacients inclosos en l‚Äôestudi. Paral¬∑lelament, tamb√© vam expandir els TILs de les bi√≤psies tumorals d‚Äôaquests pacients i vam comparar els neoant√≠gens o ant√≠gens tumorals reconeguts per aquestes dues fonts de limf√≤cits T. Les c√®l¬∑lules T de sang perif√®rica o infiltrants de tumor es van expandir ex vivo i es van testar en assajos funcionals personalitzats el que ens va permetre detectar c√®l¬∑lules T amb capacitat de recon√®ixer neoant√≠gens identificats per seq√ľenciaci√≥ de l‚Äôexoma tant de l‚ÄôADN extret de bi√≤psies tumorals com de l‚ÄôADN circulant i ant√≠gens tumorals de l√≠nia germinal expressats en la bi√≤psia tumoral. Utilitzant aquesta aproximaci√≥, es van detectar c√®l¬∑lules T reactives contra neoant√≠gens en vuit dels deu pacients estudiats. En la majoria dels casos, els limf√≤cits CD8 i CD4 reactius es van identificar en poblacions que expressaven alts nivells de PD-1 (PD-1hi), sol o en combinaci√≥ amb altres marcadors, sent PD-1hiCD39+ la combinaci√≥ que identificava limf√≤cits T reactius contra ant√≠gens tumorals de manera m√©s consistent. A m√©s, en els limf√≤cits CD8+, la poblaci√≥ PD-1hiCD39+ sempre contenia la freq√ľ√®ncia m√©s elevada de limf√≤cits reactius en el cas que aquests s‚Äôhaguessin identificat en diferents poblacions separades de la sang. Aquesta darrera observaci√≥ no aplica pels limf√≤cits CD4+ ja que en aquest cas cap de les poblacions contenia la freq√ľ√®ncia m√©s alta de limf√≤cits T reactius contra neoant√≠gens de manera consistent. La selecci√≥ i expansi√≥ de limf√≤cits CD8+ PD-1hiCD39+ de la sang perif√®rica va permetre capturar un major nombre de reactivitats contra ant√≠gens tumorals que l‚Äôestablert sistema d‚Äôexpansi√≥ inespec√≠fica de TILs en pres√®ncia d‚Äôaltes dosis d‚Äôinterleuquina-2 (IL-2). Per altra banda, tot i que el nombre total de reactivitats identificades en les poblacions de limf√≤cits CD4+ a√Įllades de la sang perif√®rica √©s superior a les identificades en els TILs, la combinaci√≥ CD4+ PD- 1hiCD39+ identifica menys reactivitats que les detectades en els TILs. Pel que fa a les NSMs identificades en l‚ÄôADN tumoral i en l‚ÄôADN circulant, vam observar que el nombre de mutacions compartides entre les dues fonts d‚ÄôADN era altament variable, essent nul en dos dels sis pacients estudiats. La seq√ľenciaci√≥ d‚Äôexoma de l‚ÄôADN circulant dels sis pacients va identificar preferencialment mutacions som√†tiques clonals en les bi√≤psies tumorals. Tamb√© va permetre la identificaci√≥ de vuit dels 13 neoant√≠gens detectats en pacients que mostraven un cert grau de solapament entre les NSMs detectades en l‚ÄôADN extret de la bi√≤psia tumoral i l‚ÄôADN circulant. En resum, els nostres resultats demostren que l'√ļs exclusiu de sang perif√®rica permet detectar neoant√≠gens i els limf√≤cits CD4+ i CD8+ capa√ßos de recon√®ixer aquest tipus d'ant√≠gens tumorals el que t√© implicacions importants pel desenvolupament de ter√†pies cel¬∑lulars personalitzades en pacients amb tumors avan√ßats.[spa] En esta tesis, el objetivo principal era explorar la sangre perif√©rica para poder identificar neoant√≠genos tumorales y los linfocitos capaces de reconocerlos. Para conseguir este objetivo, se realiz√≥ la secuenciaci√≥n del exoma del ADN circulante extra√≠do de muestras de plasma as√≠ como la secuenciaci√≥n del ADN extra√≠do de biopsias tumorales. Paralelamente, se seleccionaron diferentes poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ de la sangre en base a la expresi√≥n de ciertos marcadores de co-estimulaci√≥n o inhibici√≥n y se testaron usando ensayos funcionales inmunol√≥gicos personalizados para ver su capacidad de reconocer neoant√≠genos y otros ant√≠genos tumorales. Mediante estos an√°lisis, se detectaron un total de 15 reactividades en la sangre, 8 CD8+ y 7 CD4+. En el caso de los CD8+, se observ√≥ que la poblaci√≥n CD8+ PD-1hi CD39+ era la poblaci√≥n que conten√≠a m√°s reactividades contra ant√≠genos tumorales y que conten√≠a la frecuencia m√°s alta de linfocitos reactivos. En el caso de los CD4+, la poblaci√≥n PD-1hiCD39+ tambi√©n fue la poblaci√≥n que identific√≥ m√°s reactividades aunque no detect√≥ una proporci√≥n alta de reactividades indicando que esta puede no ser la mejor combinaci√≥n de marcadores para CD4+. Por otro lado, la secuenciaci√≥n del ADN circulante permiti√≥ identificar 8 de los 13 neoant√≠genos detectados en los 6 pacientes en los que se secuenci√≥n el ADN circulante. Por tanto, estos resultados demuestran que es posible utilizar la sangre perif√©rica para identificar neoant√≠genos y linfocitos espec√≠ficos contra neoant√≠genos lo que puede permitir el desarrollo de ter√°pias celulares personalizadas m√≠nimamente invasivas √ļnicamente utilitzando la sangre perif√©rica

    Disseny i implementació d'una aplicació informàtica per al càlcul de potències tèrmiques

    Get PDF
    A la mem√≤ria d‚Äôaquets projecte, s'explica el manual de funcionament d'una aplicaci√≥ inform√†tica per a l'estimaci√≥ de c√†rregues t√®rmiques i el c√†lcul de pot√®ncies de climatitzaci√≥. En el primer apartat, es detallen les bases te√≤riques de la transfer√®ncia de calor per la correcta comprensi√≥ del c√†lcul de c√†rregues. Tamb√© s'introdueix els fonaments te√≤rics del comportament de l'aire atmosf√®ric i els processos b√†sics de tractament de l‚Äôaire. En el seg√ľent apartat, s'estableixen les f√≥rmules matem√†tiques de termot√®cnia i termodin√†mica utilitzades en el codi de programaci√≥. De manera similar a l‚Äôapartat anterior, primer s'introdueixen les f√≥rmules de c√†rregues t√®rmiques i, posteriorment, les del c√†lcul de pot√®ncies de climatitzaci√≥. L'√ļltim apartat consisteix en un exemple pr√†ctic del funcionament de l'aplicaci√≥. L'estudi escollit √©s la climatitzaci√≥ d'una aula de l'Escola T√®cnica Superior d'Enginyeria Industrial de Barcelona. Aquest apartat inclou una breu discussi√≥ dels resultats obtinguts a trav√©s del programa. Els annexos contenen el desenvolupament del codi de programaci√≥ en llenguatge PythonThe aim of this project is to develop an application which estimates the thermal load of a room and its air conditioning power calculation. In the first section, the theoretical foundations of heat transfer are explained to ensure the proper comprehension of load calculations. Additionally, the atmospheric air behavior and air treatment processes are addressed. In the next section, the mathematical formulas of thermotechnics and thermodynamics used in the programming code are defined. Similarly to the previous case, thermal load formulas are introduced first, followed by those for air conditioning power calculation. The last section consists of a practical example of the application's functionality. The selected study focuses on the air conditioning of a classroom at the Technical School of Industrial Engineering in Barcelona. This section involves/integrates a brief discussion of the results obtained through the program. The annexes contains the source code written in Python of the previously mentioned applicatio

    Circulating immunophenotypes are potentially prognostic in follicular cell-derived thyroid cancer

    Get PDF
    BackgroundExploring the immune interface of follicular cell-derived thyroid cancer has prognostic and therapeutic potential. The available literature is lacking for comprehensive immunophenotyping in relation to clinical outcomes. In this study, we identify circulating immunophenotypes associated with thyroid cancer prognosis.MethodsWe conducted a pilot observational study of adults with follicular cell-derived thyroid cancer who underwent surgery at our tertiary care referral center and had consented for flow cytometry on peripheral blood collected at the time of thyroidectomy.ResultsOf the 32 included subjects, 20 (62%) had well differentiated, 5 (16%) had poorly differentiated, and 7 (22%) had anaplastic thyroid cancer. The most frequent AJCC stage was 4 (59%) and the ATA risk of recurrence category was high (56%). Patients with AJCC stage 3/4 demonstrated fewer circulating mononuclear cells (CD45+), more monocytes (CD14+), fewer total lymphocytes (CD14-), fewer T cells (CD3+), fewer CD4+ T cells, fewer gamma-delta T cells, fewer natural killer (NK) T-like cells, more myeloid-derived suppressor cells (MDSCs; Lin-CD33+HLADR-), and more effector memory T cells but similar CD8+ T cells compared to stage1/2. Immunophenotype comparisons by ATA risk stratification and course of thyroid cancer were comparable to those observed for stage, except for significant differences in memory T cell subtypes. The median follow-up was 58 months.ConclusionsAggressive follicular cell-derived thyroid cancer either at presentation or during follow-up is associated with down-regulation of the T cell populations specifically CD4+ T cells, gamma-delta T cells, and NK T-like cells but up-regulation of MDSCs and altered memory T cells. These immunophenotypes are potential prognostic biomarkers supporting future investigation for developing targeted immunotherapies against advanced thyroid cancer

    Esculturas y relieves figurados de época romana, realizados en material lapídeo local, del noreste de la península ibérica. Litotipos y centros de producción

    No full text
    En aquest treball s'han estudiat tallers de producci√≥ escult√≤rica d'√®poca romana, realitzats en material lapidi local, del nord-est de la pen√≠nsula ib√®rica. S'ha pret√®s ampliar el coneixement actual sobre la pl√†stica local hispana dins d'un marc cronol√≤gic prec√≠s que va des del segle III aC. fins al III dC. El projecte t√© un marcat car√†cter multidisciplinari, combinant disciplines human√≠stiques i cient√≠fiques. Aix√≤ s'ha reflectit metodol√≤gicament en l'adopci√≥ de dues vies de recerca, una pr√≤pia dels √†mbits de la Hist√≤ria de l'Art i l'Arqueologia i una altra de caire m√©s cient√≠fic i experimental, en particular centrat en la Geologia. L'objectiu de partida del nostre estudi ha estat la catalogaci√≥ exhaustiva de les escultures i relleus figurats romans procedents de jaciments catalans i realitzats en materials locals, incloent-ne la identificaci√≥ i la caracteritzaci√≥ arqueom√®trica. A partir de la catalogaci√≥ descrita s'ha quantificat la freq√ľ√®ncia d'√ļs de diferents litotipus ja coneguts i se n'han identificat d'altres que fins ara no s'havien descrit. Tamb√© s'han associat els diferents litotipus a determinats centres productors. Els objectius s'han concretat en la catalogaci√≥ de 171 obres i en la detecci√≥ de 18 litotipus locals amb qu√® s'han realitzat aquestes obres. La seva caracteritzaci√≥ arqueom√®trica, amb especial √®mfasi en l'an√†lisi petrogr√†fica, s'ha fet sobre un total de 44 peces. Aquest vessant m√©s cient√≠fic ha implicat el desenvolupament d'aptituds en diverses t√®cniques anal√≠tiques, un coneixement totalment ali√® a la formaci√≥ pr√®via amb qu√® s'ha afrontat aquest projecte de tesi. La major part de les obres que hem catalogat estan ubicades actualment a institucions p√ļbliques i privades catalanes (122). A m√©s de les peces situades als museus, del total d'obres catalogades n'hem trobat 49 que no formen part de cap inventari i es troben o b√© in situ, en propietats privades o estan actualment en lloc desconegut.Este trabajo consiste en el estudio de talleres de producci√≥n escult√≥rica de √©poca romana, realizados en material lap√≠deo local, del noreste de la pen√≠nsula ib√©rica. Se ha pretendido ampliar el conocimiento actual sobre la pl√°stica local hispana dentro de un marco cronol√≥gico preciso que va desde el siglo III a.C. hasta el III d.C. El proyecto tiene un marcado car√°cter multidisciplinar, combinando doctrinas human√≠sticas y cient√≠ficas. Esto se ha reflejado metodol√≥gicamente en la adopci√≥n de dos v√≠as de investigaci√≥n, una propia de los √°mbitos de la Historia del Arte y la Arqueolog√≠a y otra de las Ciencias experimentales, en particular la Geolog√≠a. El objetivo de partida de nuestro estudio ha sido la catalogaci√≥n exhaustiva de las esculturas y relieves figurados romanos procedentes de yacimientos catalanes y realizados en materiales locales, incluyendo su identificaci√≥n y caracterizaci√≥n arqueom√©trica. A partir de la catalogaci√≥n descrita se ha cuantificado la frecuencia de uso de distintos litotipos ya conocidos y se han identificados otros no descritos anteriormente. Tambi√©n se han asociado los distintos litotipos a determinados centros productores. Los objetivos se han concretado en la catalogaci√≥n de 171 obras y en la detecci√≥n de 18 litotipos locales con los que se han realizado dichas obras. Su caracterizaci√≥n arqueom√©trica, con √©nfasis en el an√°lisis petrogr√°fico, se ha realizado sobre un total de 44 piezas. Esta vertiente m√°s cient√≠fica ha implicado el desarrollo de aptitudes en diversas t√©cnicas anal√≠ticas, un conocimiento totalmente ajeno a la formaci√≥n previa con la que se ha afrontado el presente proyecto de tesis. La mayor parte de las obras que hemos catalogado est√°n ubicadas actualmente en instituciones p√ļblicas y privadas catalanas (122). Adem√°s de las piezas localizadas en los museos, del total de obras catalogadas hemos hallado 49 que no forman parte de ning√ļn inventario y que se encuentran o bien in situ, en propiedades privadas o est√°n actualmente en paradero desconocido.This work deals with the study of the Roman workshops that produced sculptural works carved in local stones, from the northeast corner of the Iberian Peninsula. The aim has been to broaden the current knowledge about local Hispanic art within a precise chronological window that goes from the 3rd century BC to the 3rd century AD. The project has a remarkable multidisciplinary character, combining humanistic and scientific disciplines. This has been methodologically reflected by the adoption of two distinct types of research approaches, on the one hand that common in the fields of Art History and Archeology and on the other hand, a more scientific and experimental approach, particularly focusing in geological methods. The starting objective of our study has been the exhaustive cataloging of Roman figurative sculptures and reliefs from Catalan sites, carved in local materials, The work has involved their identification and archaeometric characterization. From the compilation of the described catalogue, we have quantified the frequency of use of different lithotypes, most of them were already known but some had not been previously described. The different lithotypes have been associated with their corresponding production centers. The objectives have materialized in a catalogue that comprises 171 artworks and includes 18 different local lithotypes. Their archaeometric characterization, particularly focused on the petrographic analysis, has been applied to a total of 44 pieces. This scientific-oriented facet of the project has implied the development of competence in various analytical techniques, a completely new knowledge that has been assumed without any previous background. Most of the works that we have compiled are currently located in Catalan public and private institutions (122). In addition to the pieces located in the museums, of the total number of cataloged works we have found 49 items that were not catalogued, they are in situ, on private collections or presently missing
    • ‚Ķ
    corecore