Intrinsic Order and Disorder in the Bcl-2 Member Harakiri: Insights into Its Proapoptotic Activity

Harakiri is a BH3-only member of the Bcl-2 family that localizes in membranes and induces cell death by binding to prosurvival Bcl-xL and Bcl-2. The cytosolic domain of Harakiri is largely disorder with residual α-helical conformation according to previous structural studies. As these helical structures could play an important role in Harakiri's function, we have used NMR and circular dichroism to fully characterize them at the residue-atomic level. In addition, we report structural studies on a peptide fragment spanning Harakiri's C-terminal hydrophobic sequence, which potentially operates as a transmembrane domain. We initially checked by enzyme immunoassays and NMR that peptides encompassing different lengths of the cytosolic domain are functional as they bind Bcl-xL and Bcl-2. The structural data in water indicate that the α-helical conformation is restricted to a 25-residue segment comprising the BH3 domain. However, structure calculation was precluded because of insufficient NMR restraints. To bypass this problem we used alcohol-water mixture to increase structure population and confirmed by NMR that the conformation in both milieus is equivalent. The resulting three-dimensional structure closely resembles that of peptides encompassing the BH3 domain of BH3-only members in complex with their prosurvival partners, suggesting that preformed structural elements in the disordered protein are central to binding. In contrast, the transmembrane domain forms in micelles a monomeric α-helix with a population close to 100%. Its three-dimensional structure here reported reveals features that explain its function as membrane anchor. Altogether these results are used to propose a tentative structural model of how Harakiri works

Intrinsic Order and Disorder in the Bcl-2 Member Harakiri: Insights into Its Proapoptotic Activity

Harakiri is a BH3-only member of the Bcl-2 family that localizes in membranes and induces cell death by binding to prosurvival Bcl-xL and Bcl-2. The cytosolic domain of Harakiri is largely disorder with residual α-helical conformation according to previous structural studies. As these helical structures could play an important role in Harakiri's function, we have used NMR and circular dichroism to fully characterize them at the residue-atomic level. In addition, we report structural studies on a peptide fragment spanning Harakiri's C-terminal hydrophobic sequence, which potentially operates as a transmembrane domain. We initially checked by enzyme immunoassays and NMR that peptides encompassing different lengths of the cytosolic domain are functional as they bind Bcl-xL and Bcl-2. The structural data in water indicate that the α-helical conformation is restricted to a 25-residue segment comprising the BH3 domain. However, structure calculation was precluded because of insufficient NMR restraints. To bypass this problem we used alcohol-water mixture to increase structure population and confirmed by NMR that the conformation in both milieus is equivalent. The resulting three-dimensional structure closely resembles that of peptides encompassing the BH3 domain of BH3-only members in complex with their prosurvival partners, suggesting that preformed structural elements in the disordered protein are central to binding. In contrast, the transmembrane domain forms in micelles a monomeric α-helix with a population close to 100%. Its three-dimensional structure here reported reveals features that explain its function as membrane anchor. Altogether these results are used to propose a tentative structural model of how Harakiri works

Characterizing BCL-2 family protein domains in membranes:insertion, interaction and apoptotic modulation roles

El objetivo de mi tesis doctoral es el estudio de los dominios transmembrana (TMD) de las proteínas de la familia Bcl-2. La principal función de esta familia de proteínas es la regulación del proceso apoptótico (1,2). Para Ello, se establece un balance de interacciones proteína-proteína entre los miembros pro- y antiapoptóticos de esta familia proteica (3,4). Nuestra hipótesis de trabajo postula que los fragmentos transmembrana de dichas proteínas pueden estar implicados no sólo en su localización subcelular sino también en el establecimiento de la red de interacciones entre proteínas Bcl-2 así como en el desarrollo de su función apoptótica.. Para corroborar esta hipótesis, hemos analizado la capacidad de interacción de los dominios transmembrana, de todos los miembros pro- y antiapoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2 mediante el sistema ToxR en bacterias, trasladando posteriormente los resultados a un sistema eucariótico por medio de ensayos de complementación de fluorescencia (BiFC). En primer lugar analizamos la capacidad de estos TMDs para homooligomerizar, utilizando tanto el sistema ToxR como BiFC, obteniendo resultados positivos en todos los transmembrana estudiados a excepción de Bid. Los ensayos de complementación de fluorescencia en células tumorales eucariotas permitieron además demostrar la localización mitocondrial de estas interacciones por ensayos de colocalización y fraccionamiento subcelular. El siguiente objetivo fue establecer el patrón de interacciones de cada uno de los TMD con el resto de proteínas de la familia Bcl-2 empleando de nuevo estos sistemas. El análisis de los resultados de ambos estudios nos ha permitido elaborar el primer mapa de interacciones producidas exclusivamente por los dominios transmembrana de las proteínas de la familia Bcl-2 (5). Uno de los puntos clave durante la realización de la tesis doctoral ha sido la búsqueda de aplicaciones clínicas para los TMDs en el campo de los tratamientos antitumorales. Por ello, realizamos la síntesis química de los fragmentos transmembrana de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w y Mcl-1 así como de las efectoras Bax y Bak. Utilizando la interferometría dual polarizada determinamos que los TMDs se asocian e insertan preferentemente en liposomas con una composición de tipo mitocondrial; demostramos además que esta asociación/inserción no afectaba a la membrana mitocondrial interna mediante ensayos de swelling mitocondrial. El siguiente objetivo fue determinar su capacidad para desestabilizar la membrana mitocondrial externa y producir la muerte celular. Específicamente alguno de los péptidos TMD, en mayor grado Bak y Bcl-xL pero también Bcl-2 y Bax, fueron capaces de desestabilizar liposomas con una composición mitocondrial, liberando su contenido de calceína el exterior. El “mitochondrial priming” se basa en sensibilizar a la mitocondria de la célula tumoral para que dicha célula sea más susceptible de responder a distintos tratamientos. Basándonos en esta idea, decidimos utilizar como segunda aproximación concentraciones subletales de éstos péptidos en combinación con el compuesto antitumoral cis-platino (CDDP) para determinar si estos péptidos transmembrana eran capaces de sensibilizar a la mitocondria. Los resultados mostraron que tanto Bcl-xL como Bak (y en un grado más moderado Bcl-2 y Bax) en concentraciones subletales fueron capaces de incrementar la sensibilidad de las líneas tumorales HeLa y HCT-116 frente al estímulo apoptótico de CDDP (6). Los resultados de este estudio abren la posibilidad del uso de estos péptidos transmembrana como herramienta farmacológica capaz de desestabilizar la mitocondria y sensibilizar a las células tumorales frente a estímulos apoptóticos.Apoptosis (programmed cell death) is executed by strongly regulated pathways to remove infected, damaged or ectopic cells. However, Apoptosis dysregulation is at the root of a variety of diseases. The BCL-2 family of proteins are involved in sensing various cellular stress linked to mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). Upon the induction of apoptosis, the integrity of the MOM is breached, resulting in the release of cytochrome c and other proteins into the cytoplasm. A series of protein-protein and protein-membrane interactions are thus activated and controlled in the membranes. Up to now, several studies reveal that these interactions are lead by the commonly shared BH3 domain (BCL-2 Homology domain) but characterizing their membrane interaction properties will further our understanding on the mechanistic role of the BCL-2 family of proteins in the MOMP and the complexity of regulating apoptosis. The putative TM domains of anti- apoptotic (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w and Mcl-1), pro-apoptotic (Bax, Bak) and BH3-only members have been characterized for their structure and interaction properties in a membrane context. The roles of these C-terminal putative TM domains in MOMP and apoptosis were further investigated on liposomes, isolated mitochondrial and whole cell. Overall the results demonstrate the capability of BCL-2 TMDs to establish an interaction network in the MOM. Furthermore, some of these BCL-2 TMDs can destabilize the MOM integrity, promoting cytochrome c release and apoptosis

Understanding and Drugging the Bcl-2 Transmembrane Interactome for Tumor Treatment

[ES] La familia de proteínas Bcl-2 regula la apoptosis a través de una compleja red de interacciones. Las células tumorales suelen presentar mutaciones que afectan a su expresión o sus interacciones para mejorar la progresión tumoral. Además, alteraciones en su regulación también promueven la migración de células cancerígenas, la invasión y la metástasis. Para llevar a cabo sus funciones, las proteínas Bcl 2 interaccionan entre sí tanto en el citoplasma como en las membranas intracelulares. Los equilibrios de interacción de los dominios Bcl citosólicos se han investigado ampliamente y recientemente, se han propuesto como dianas terapéuticas. Sin embargo, el interactoma de los dominios transmembrana (TMD, del inglés transmembrane domains) sigue siendo poco conocido. Por ello, un conocimiento profundo de la biología de las proteínas Bcl-2 es necesario para explotar eficientemente sus superficies de unión en el tratamiento del cáncer. Para llevar a cabo este objetivo, nos hemos centrado en tres áreas: 1. La comprensión detallada de la contribución del TMD de Mcl-1 a su interactoma en membrana y su función. 2. El descubrimiento de nuevos inhibidores de Mcl-1 que actúen sobre su TMD y que permitan desarrollar una clase de drogas anticancerígenas aún por explorar. 3. La caracterización molecular de mutaciones relacionadas con el cáncer descritas en los TMD de Bcl-2 y Bcl-xL y sus implicaciones en la supervivencia de las células tumorales. La proteína antiapoptótica Mcl-1 inhibe a los miembros proapoptóticos Bak, Bax, Bok, Noxa, etc. Aunque se ha estudiado en detalle su actividad promoviendo la supervivencia celular, el mecanismo molecular por el cuál previene la apoptosis mediada por Bok aún no está claro. Además, el conocimiento de las actividades de Mcl-1, descritas hasta ahora, se basa exclusivamente en las estructuras resueltas de las regiones solubles en agua y en estudios centrados en los dominios citosólicos. Por primera vez, hemos demostrado la relevancia del TMD de Mcl-1 en su equilibrio de interacción. En este trabajo describimos su capacidad específica para homo- y hetero-oligomerizar con el TMD de Bok. También ponemos de manifiesto la influencia de estas interacciones en la modulación de apoptosis y resaltamos la relevancia clínica de los mutantes del TMD de Mcl-1 identificados en pacientes con cáncer. Muchos tumores hematológicos y sólidos sobre-expresan Mcl-1 como mecanismo para adquirir quimiorresistencia. Se han desarrollado miméticos de BH3 específicos para modular su actividad antiapoptótica en células cancerosas. Sin embargo, aún no disponemos de datos científicos que informen sobre su toxicidad y eficacia en humanos. En este trabajo, proponemos la novedosa interacción de los TMDs de Mcl-1 y Bok como un nuevo sitio de acción de fármacos quimioterapéuticos. Hemos identificado tres inhibidores de esta interacción con características que los hacen prometedores candidatos para el desarrollo farmacéutico, así como buenas herramientas moleculares para estudiar la interacción de los TMDs de Mcl-1 y Bok. Para modular la apoptosis, las células tumorales también presentan versiones mutadas de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL. En nuestro conocimiento, este es el primer estudio que analiza mutaciones somáticas de sus TMDs. Nuestro trabajo demuestra cómo estas mutaciones alteran el equilibrio en membrana de las proteínas. Además, nuestros resultados explican la influencia que algunos mutantes somáticos ejercen en la regulación de la apoptosis. En general, los resultados científicos que aparecen en esta tesis resaltan el papel de los Bcl TMDs en el interactoma de las proteínas Bcl-2. Estos hallazgos corroboran que las interacciones laterales entre los TMDs son específicas y contribuyen activamente a la funcionalidad de la proteína. Por lo tanto, comprender los Bcl TMDs puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología de las proteínas Bcl.[CA] La família de proteïnes Bcl-2 regula l'apoptosi a través d'una complexa xarxa d'interaccions. Les cèl·lules tumorals solen presentar mutacions que afecten la seua expressió o les seues interaccions per a millorar la progressió tumoral. A més, alteracions en la seua regulació també promouen la migració de cèl·lules cancerígenes, la invasió i la metàstasi. Per a dur a terme les seues funcions, les proteïnes Bcl-2 interaccionen entre si tant en el citoplasma com en les membranes intracel·lulars. Els equilibris d'interacció dels dominis Bcl citosòlics s'han investigat àmpliament i recentment, s'han proposat com a dianes terapèutiques. No obstant això, l'interactoma dels dominis transmembrana (TMD, de l'anglés transmembrane domains) continua sent poc conegut. Per això, un coneixement profund de la biologia de les proteïnes Bcl-2 és necessari per a explotar eficientment les seues superfícies d'unió en el tractament del càncer. Per a dur a terme aquest objectiu, ens hem centrat en tres àrees: 1. La comprensió detallada de la contribució del TMD de Mcl-1 al seu interactoma en membrana i la seua funció. 2. El descobriment de nous inhibidors de Mcl-1 que actuen sobre el seu TMD i que permeten desenvolupar una classe de drogues anticanceroses encara per explorar. 3. La caracterització molecular de mutacions relacionades amb el càncer descrites en els TMD de Bcl-2 i Bcl-xL i les seues implicacions en la supervivència de les cèl·lules tumorals. La proteïna anti apoptòtica Mcl-1 inhibeix als membres pro apoptòtics Bak, Bax, Bok, Noxa, etc. Encara que s'ha estudiat detalladament la seua activitat promovent la supervivència cel·lular, el mecanisme molecular pel qual prevé l'apoptosi mediada per Bok encara no és clar. A més, el coneixement de les activitats de Mcl-1, descrites fins ara, es basa exclusivament en les estructures resoltes solubles en aigua i en estudis centrats en els dominis externs a la membrana. Per primera vegada, hem demostrat la rellevància del TMD de Mcl-1 el seu equilibri d'interacció. En aquest treball descrivim la seua capacitat específica per a unir-se amb si mateix i per a hetero-oligomeritzar amb el TMD de Bok. També expliquem la influència d'aquestes interaccions en l'apoptosi i ressaltem la rellevància clínica dels mutants del TMD de Mcl-1 identificats en pacients amb càncer. Molts tumors hematològics i sòlids sobre-expressen Mcl-1 com un mecanisme per a adquirir quimioresistència. S'han desenvolupat mimètics de BH3 específics per a modular la seua activitat anti apoptòtica en cèl·lules canceroses. No obstant això, encara no disposem de dades científiques que informen sobre la seua toxicitat i eficàcia en humans. Per això, proposem la nova interacció dels TMDs de Mcl-1 i Bok com un lloc d'actuació de fàrmacs quimioterapèutiques. Hem identificat tres inhibidors d'aquesta interacció amb característiques que els fan prometedors candidats per al desenvolupament farmacèutic, així com bones eines moleculars per a estudiar la interacció dels TMDs de Mcl-1 i Bok. Per a modular l'apoptosi, les cèl·lules tumorals també presenten versions mutades de les proteïnes anti apoptòtiques Bcl-2 i Bcl-xL. En el nostre coneixement, aquest és el primer estudi que analitza mutacions somàtiques de les seues TMDs. El nostre treball demostra com aquestes mutacions alteren l'equilibri en membrana de les proteïnes. A més, els nostres resultats expliquen la influència que alguns mutants somàtics exerceixen en la regulació de l'apoptosi. En general, els resultats científics que apareixen en aquesta tesi ressalten el paper dels Bcl TMDs en l'interactoma de les proteïnes Bcl-2. Aquestes troballes corroboren que les interaccions laterals entre els TMDs són específiques de la seqüència i contribueixen activament a la funcionalitat de la proteïna. Per tant, comprendre els Bcl TMDs pot proporcionar nous coneixements sobre la biologia de les proteïnes Bcl[EN] The family of the Bcl-2 proteins modulates the apoptotic pathway by a complex network of interactions. Tumor cells frequently present mutations that affect Bcl-2 proteins expression or interactions to enhance cancer progression. Dysregulation of these proteins also promotes cancer cell migration, invasion, and metastasis. To execute their functions, Bcl-2 proteins interact in both the cytosol and intracellular membranes. Binding equilibria of Bcl extramembrane domains has been largely investigated and recently proposed as chemotherapeutic targets. However, the interactome of transmembrane domains (TMDs) remains poorly understood. In this scenario, a deep knowledge of the biology of Bcl-2 proteins is needed to exploit efficiently their binding surfaces for cancer treatment. To address this aim, our research focuses on three areas: 1. The detailed comprehension of the TMD contribution to both the Mcl-1 membrane interactome and protein functionality. 2. The discovery of new Mcl-1 inhibitors that target the transmembrane surface to develop a class of anticancer drugs currently unexplored. 3. The molecular characterization of cancer-related mutations within the Bcl-2 and Bcl-xL TMDs and their implications for the survival of cancer cells. Antiapoptotic Mcl-1 protein inhibits the proapoptotic members Bak, Bax, Bok, and Noxa, among others. Although its prosurvival activity has been well studied, the molecular mechanism to prevent Bok-mediated apoptosis remains unclear. Furthermore, understanding of Mcl-1 activities described to date is only based on water-soluble structures and studies focused on extramembrane domains. For the first time, we uncover the relevance of the Mcl-1 TMD in the interaction equilibria of the protein. In the present work, we describe its specific capacity to self-associate and hetero-oligomerize with the Bok TMD. We also explain the influence of these interactions in the apoptotic pathway and highlight the clinical relevance of Mcl-1 TMD mutants identified in tumor patients. Many hematological and solid malignancies overexpress Mcl-1 as an acquired chemoresistance mechanism. To modulate its antiapoptotic activity in cancer cells, specific BH3 mimetics have been developed; however, there is no scientific data yet regarding human toxicity and efficacy. In this work, we propose the novel Mcl-1 and Bok TMDs interaction interface as a drugging site in the development of chemotherapeutics. We identify three potential inhibitors of such molecular interface with promising features to become both drug candidates for pharmaceutical development and research toosl for the molecular study of the Mcl-1 and Bok TMDs interaction. To take advantage of apoptosis modulation, tumor cells also present mutated versions of the antiapoptotic members Bcl-2 and Bcl-xL. To our knowledge, this is the first study that analyzes patient-derived mutations within Bcl-2 and Bcl-xL TMDs and demonstrates how said mutations alter the membrane equilibria of these proteins. The results presented here also explain the functional influence of some somatic mutants in apoptosis regulation. Overall, the scientific results exhibited in this Thesis highlight the role of Bcl TMDs in the interactome of Bcl-2 proteins. These findings corroborate that lateral interactions between TMDs are sequence-specific and actively contribute to protein functionality. Therefore, understanding of Bcl transmembrane segments may provide new insights into the biology of Bcl 2 proteins for their pharmaceutical modulation in antitumoral therapy.The student has been granted with a PhD fellowship and a short-term fellowship from the Generalitat Valenciana (Subvenciones para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral, 2016-2019, and Grant for predoctoral stays out of the Comunitat Valenciana, 2019). This work has been supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (projects SAF2014-52614-R and SAF2017-84689-RLucendo Gutiérrez, E. (2020). Understanding and Drugging the Bcl-2 Transmembrane Interactome for Tumor Treatment [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/155914TESI

Molecular mechanisms controlling neuronal Bak expression

Studies in the past three decades have provided a detailed understanding of the key mechanisms mediating apoptosis (a type of programmed cell death) in eukaryotic cells. Our knowledge of the molecular regulation of apoptotic factors is, however, incomplete.Recent evidence from genetic and molecular studies demonstrate that possibilities to activate cell death machinery in post-mitotic cells is more restricted than in most dividing cell types. The aim of our studies has been to better understand the unique features regulating apoptotic factors in neurons. Apoptosis in mammalian cells is controlled by Bcl-2 family proteins. Of those, the BH3-only subgroup and pro-apoptotic effectors Bak and Bax are particularly important in initiating apoptosis. In most types of neurons Bak expression is affected by an alternative splicing mechanism. Neuronal bak variant, N-Bak, encodes a putative BH3-only protein, but its existence has remained controversial. N-Bak mRNA is abundantly expressed, suggesting that post-transcriptional mechanisms may control N-Bak protein expression in neurons. This thesis addresses the molecular mechanisms, which regulate neuronal Bak expression in more detail. Using immunoblot analysis, we show that endogenous N-Bak protein is not constitutively expressed in healthy neurons. N-Bak protein expression remained undetectable upon nerve growth factor deprivation induced apoptosis in cultured sympathetic neurons. Similar results were obtained using primary cortical neurons in etoposide-induced intrinsic apoptosis model. Challenging neurons with cytotoxic drug, thapsigargin, did not reveal N-Bak protein expression, suggesting that its mRNA is translationally silent also in stressed primary neurons. The absence of N-Bak protein was further confirmed using quantitative mass spectrometry analysis, which did not reveal any peptide form samples representing healthy, stressed or apoptotic neurons. We also show that accelerated proteosomal degradation is not responsible for the absence of N-Bak protein in neurons. The open reading frame of N-Bak mRNA is prematurely terminated, being potential target for the nonsense mediated mRNA decay (NMD) pathway. We found that N-Bak mRNA is not a constitutively targeted by NMD, but instead, is relatively stable in neurons. Luciferase reporter assays showed that N-Bak mRNA is translationally repressed via cis-acting contextual elements in its untranslated regions. Finally, we demonstrate that N-Bak mRNA localizes into the uncharacterized granular structures in sympathetic neurons, and this distribution remains unchanged in apoptotic neurons. Our findings collectively demonstrate that multiple post-transcriptional mechanisms control N-Bak expression in neurons. These mechanisms may be part of the program that governs tight control over apoptosis in neurons. Our results also highlight the importance to further characterize diverse, still neglected post-transcriptional regulation mechanisms that can modulate apoptotic pathways in a various post-mitotic cells.Viimeisten kolmen vuosikymmenen tutkimustyön perusteella on saatu hyvä käsitys keskeisistä apoptoosia (ohjelmoitua solukuolemaa) välittävistä mekanismeista aitotumallisissa soluissa. Tietämyksemme näiden mekanismien säätelystä on kuitenkin edelleen vaillinainen. Viimeaikaiset tulokset geneettisistä ja molekyylitason tutkimuksista osoittavat, että solukuoleman käynnistyminen on rajoitetumpaa solutyypeissä, jotka eivät jakaudu (postmitoottiset solut), kuin useimmissa jakautuvissa soluissa. Tutkimukseni päämäärä on ollut apoptoosia hermosoluissa säätelevien tekijöiden erityispiirteiden parempi ymmärtäminen. Nisäkässoluissa apoptoosia säätelee Bcl-2-proteiiniperhe, jonka jäsenistä BH3-only-ryhmä ja apoptoosia edistävät proteiinit Bak ja Bax ovat erityisen tärkeitä apoptoosin aloitusvaiheessa. Useimmissa hermosolutyypeissä Bak-geenin ilmentymiseen vaikuttaa vaihtoehtoinen silmukointi. Neuronaalisen Bak:n silmukointimuodon, N-Bak:n, on esitetty koodittavan BH3-only ryhmän proteiinia, mutta tämän proteiinin olemassaolosta on ristiriitaisia käsityksiä. N-Bak-mRNA:ta on kuitenkin runsaasti hermosoluissa, mikä viittaa siihen, että geeniluennan jälkeiset säätelymekanismit säätelevät N-Bak-proteiinin ilmentymistä niissä. Tässä väitöskirjatyössä tutkimme molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät N-Bak:n ilmentymistä. Immunoblot-menetelmällä osoitimme, että N-Bak-proteiinia ei esiinny, ainakaan jatkuvasti, terveissä hermosoluissa. N-Bak-proteiinia ei havaittu sympaattisissa hermosoluissa, joille aiheutettiin apoptoosia poistamalta niiltä NGF-hermokasvutekijä, ja samankaltaisen tuloksen saimme aivokuoren hermosoluviljelmistä (cortical neurons), kun niille aiheutettiin apoptoosia etoposidilla. Myöskään hermosolujen käsittely myrkyllisellä thapsigargiinilla ei saanut N-Bak proteiinia näkyviin, mikä viittaa siihen, että sitä koodittavaa mRNA:ta ei käännetä proteiiniksi hermossoluviljelmissä edes stressitilanteessa. N-Bak-proteiinin puuttuminen osoitettiin lisäksi kvantitatiivisella massaspektrometriamenetelmällä, jossa ei löytynyt siitä peräisin olevia peptidejä terveissä, stressatuissa tai apoptoottisissa neuroneissa. Osoitimme vielä, että mahdollinen nopea hajotus proteasomeissa ei ole syynä N-Bak-proteiinin puuttumiseen. N-Bak-mRNA sisältää ennenaikaisen lopetuskodonin, mistä syystä se mahdollisesti hajotetaan NMD-reitin (nonsense mediated mRNA decay) kautta. Saimme selville, että N-Bak-mRNA ei joudu NMD-hajotusreitille vaan päinvastoin se on melko pysyvä hermosoluissa. Lusiferaasireportterimittaukset osoittivat, että tietyt N-Bak-mRNA:n ei-koodaavilla alueilla sijaitsevat alueet (cis acting elements) vaimentavat sen translaatiota. Lopuksi osoitimme, että N-Bak-mRNA paikantuu tuntemattomiin jyväsrakenteisiin sympaattisissa hermosoluissa, ja että tämä paikantuminen ei muutu apoptoottisissa soluissa. Loppupäätelmänä voidaan todeta, että tuloksemme osoittavat useiden geeniluennan jälkeisten mekanismien säätelevän N-Bak:n ilmentymistä hermosoluissa. Nämä mekanismit lienevät osa koneistoa, joka neuroneissa säätelee tiukasti apoptoosia. Tulostemme perusteella on myös syytä korostaaa, että on tärkeää tutkia enemmän huonosti tunnettuja geeniluennan jälkeisiä säätelymekanismeja, jotka vaikuttavat apoptoosireittien toimintaan useissa erilaistuneissa, jakautumattomissa solutyypeissä

Mechanistic details of apoptosis-regulatory proteins BAX and BFL1 at the membrane level

252 p.La homeostasis de tejidos es considerado como el equilibrio entre la muerte y proliferación celular, y es por ello que su desregulación a menudo está asociada a diversas situaciones patológicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o el cáncer. Este equilibrio, se encuentra regulado principalmente por un mecanismo denominado apoptosis o suicidio celular. La familia de proteínas BCL2 se erige como pieza clave en la regulación de este mecanismo, principalmente, a nivel de la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MEM). En las últimas décadas, se han realizado avances de notoria importancia en el conocimiento sobre los mecanismos de acción e interacción de esta familia de proteínas, Sin embargo, importantes aspectos del proceso de activación de las proteinas proapoptóticas tipo BAX (BAX, BAK y quizás BOK) se encuentran vagamente descritos, desconociendo entre otros aspectos la disposición estructural exacta que la proteína BAX adopta en membrana o la cantidad mínima de subunidades de BAX necesarias para la formación del poro. Por otra parte, puesto que la membrana conforma el locus biológico de estas proteinas, el estudio del componente lipídico y de la propia membrana se encuentra actualmente en boga. Concretamente, el lípido especifico de la mitocondria, cardiolipina (CL), se ha erigido como uno de los moduladores claves de la apoptosis. Sin embargo, a pesar de su importancia, la función exacta de la CL en particular y de los lípidos en general, en las actividades de membrana de las BCL2, se encuentra vagamente descrita. Además, dilucidar el modo de acción de las proteinas antiapoptóticas o tipo BCL2, mediadoras del bloqueo de la actividad de las proapoptóticas, es considerado uno de los pilares fundamentales en el desarrollo de posibles dianas terapéuticas. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido avanzar en la comprensión de los mecanismos de acción de la familia de proteínas BCL2, así como de los factores reguladores que modulan su actividad durante la apoptosis. Concretamente, nos centramos en dos miembros de la familia: la proapoptótica multidominio prototípica BAX, y la poco estudiada proteína antiapoptótica BFL1. Para la consecución de estos objetivos, se han realizado estudios a nivel de membrana tanto en sistemas modelo como en células, mediante diversas técnicas biofísicas cuantitativas. Considerando todo referente a la topología de BAX en membrana, concluimos que en ausencia de estímulo apoptótico BAX adopta una estructura globular apoyando su C-terminal en la membrana, conformación a la cual hemos denominado "lipid primed", ya que el lípido parece favorecer la exposición del bolsillo hidrofóbico que actuará como receptor en el proceso apoptótico. Sin embargo, una vez activada, BAX adopta una configuración BH3 into groove donde la inserción del dominio core, pero no del dominio latch, se antoja indispensable para la formación del poro apoptótico. Referente a BFL1 y sus actividades de membrana, concluimos que BFL1 posee un mecanismo de acción multimodal (MODO-0 o retrotranslocación de BAX, MODO-1 o formación de un hetero-complejo con la proteína proapoptótica cBID y MODO-2 interacción con la proteína BAX activa) y bifuncional (fenotipo antiapoptótico y proapoptótico) regulado por la cantidad de CL en la membrana. BFL1 ejerce su actividad antiapoptótica mediada por interacciones canónicas BH3-into-groove mientras que en membranas con alto contenido en cardiolipina, las cuales imitan los microdominios de este lípido descritos en condiciones apoptóticas, BFL1 no solo pierde la capacidad de formar heterodímeros con los miembros proapoptóticos, sino que también es capaz de homodimerizar vía una superficie no descrita previamente situada en el dominio BH4 de la proteína

Mechanistic details of apoptosis-regulatory proteins BAX and BFL1 at the membrane level

252 p.La homeostasis de tejidos es considerado como el equilibrio entre la muerte y proliferación celular, y es por ello que su desregulación a menudo está asociada a diversas situaciones patológicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o el cáncer. Este equilibrio, se encuentra regulado principalmente por un mecanismo denominado apoptosis o suicidio celular. La familia de proteínas BCL2 se erige como pieza clave en la regulación de este mecanismo, principalmente, a nivel de la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MEM). En las últimas décadas, se han realizado avances de notoria importancia en el conocimiento sobre los mecanismos de acción e interacción de esta familia de proteínas, Sin embargo, importantes aspectos del proceso de activación de las proteinas proapoptóticas tipo BAX (BAX, BAK y quizás BOK) se encuentran vagamente descritos, desconociendo entre otros aspectos la disposición estructural exacta que la proteína BAX adopta en membrana o la cantidad mínima de subunidades de BAX necesarias para la formación del poro. Por otra parte, puesto que la membrana conforma el locus biológico de estas proteinas, el estudio del componente lipídico y de la propia membrana se encuentra actualmente en boga. Concretamente, el lípido especifico de la mitocondria, cardiolipina (CL), se ha erigido como uno de los moduladores claves de la apoptosis. Sin embargo, a pesar de su importancia, la función exacta de la CL en particular y de los lípidos en general, en las actividades de membrana de las BCL2, se encuentra vagamente descrita. Además, dilucidar el modo de acción de las proteinas antiapoptóticas o tipo BCL2, mediadoras del bloqueo de la actividad de las proapoptóticas, es considerado uno de los pilares fundamentales en el desarrollo de posibles dianas terapéuticas. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido avanzar en la comprensión de los mecanismos de acción de la familia de proteínas BCL2, así como de los factores reguladores que modulan su actividad durante la apoptosis. Concretamente, nos centramos en dos miembros de la familia: la proapoptótica multidominio prototípica BAX, y la poco estudiada proteína antiapoptótica BFL1. Para la consecución de estos objetivos, se han realizado estudios a nivel de membrana tanto en sistemas modelo como en células, mediante diversas técnicas biofísicas cuantitativas. Considerando todo referente a la topología de BAX en membrana, concluimos que en ausencia de estímulo apoptótico BAX adopta una estructura globular apoyando su C-terminal en la membrana, conformación a la cual hemos denominado "lipid primed", ya que el lípido parece favorecer la exposición del bolsillo hidrofóbico que actuará como receptor en el proceso apoptótico. Sin embargo, una vez activada, BAX adopta una configuración BH3 into groove donde la inserción del dominio core, pero no del dominio latch, se antoja indispensable para la formación del poro apoptótico. Referente a BFL1 y sus actividades de membrana, concluimos que BFL1 posee un mecanismo de acción multimodal (MODO-0 o retrotranslocación de BAX, MODO-1 o formación de un hetero-complejo con la proteína proapoptótica cBID y MODO-2 interacción con la proteína BAX activa) y bifuncional (fenotipo antiapoptótico y proapoptótico) regulado por la cantidad de CL en la membrana. BFL1 ejerce su actividad antiapoptótica mediada por interacciones canónicas BH3-into-groove mientras que en membranas con alto contenido en cardiolipina, las cuales imitan los microdominios de este lípido descritos en condiciones apoptóticas, BFL1 no solo pierde la capacidad de formar heterodímeros con los miembros proapoptóticos, sino que también es capaz de homodimerizar vía una superficie no descrita previamente situada en el dominio BH4 de la proteína

Mechanistic details of apoptosis-regulatory proteins BAX and BFL1 at the membrane level

252 p.La homeostasis de tejidos es considerado como el equilibrio entre la muerte y proliferación celular, y es por ello que su desregulación a menudo está asociada a diversas situaciones patológicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o el cáncer. Este equilibrio, se encuentra regulado principalmente por un mecanismo denominado apoptosis o suicidio celular. La familia de proteínas BCL2 se erige como pieza clave en la regulación de este mecanismo, principalmente, a nivel de la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MEM). En las últimas décadas, se han realizado avances de notoria importancia en el conocimiento sobre los mecanismos de acción e interacción de esta familia de proteínas, Sin embargo, importantes aspectos del proceso de activación de las proteinas proapoptóticas tipo BAX (BAX, BAK y quizás BOK) se encuentran vagamente descritos, desconociendo entre otros aspectos la disposición estructural exacta que la proteína BAX adopta en membrana o la cantidad mínima de subunidades de BAX necesarias para la formación del poro. Por otra parte, puesto que la membrana conforma el locus biológico de estas proteinas, el estudio del componente lipídico y de la propia membrana se encuentra actualmente en boga. Concretamente, el lípido especifico de la mitocondria, cardiolipina (CL), se ha erigido como uno de los moduladores claves de la apoptosis. Sin embargo, a pesar de su importancia, la función exacta de la CL en particular y de los lípidos en general, en las actividades de membrana de las BCL2, se encuentra vagamente descrita. Además, dilucidar el modo de acción de las proteinas antiapoptóticas o tipo BCL2, mediadoras del bloqueo de la actividad de las proapoptóticas, es considerado uno de los pilares fundamentales en el desarrollo de posibles dianas terapéuticas. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido avanzar en la comprensión de los mecanismos de acción de la familia de proteínas BCL2, así como de los factores reguladores que modulan su actividad durante la apoptosis. Concretamente, nos centramos en dos miembros de la familia: la proapoptótica multidominio prototípica BAX, y la poco estudiada proteína antiapoptótica BFL1. Para la consecución de estos objetivos, se han realizado estudios a nivel de membrana tanto en sistemas modelo como en células, mediante diversas técnicas biofísicas cuantitativas. Considerando todo referente a la topología de BAX en membrana, concluimos que en ausencia de estímulo apoptótico BAX adopta una estructura globular apoyando su C-terminal en la membrana, conformación a la cual hemos denominado "lipid primed", ya que el lípido parece favorecer la exposición del bolsillo hidrofóbico que actuará como receptor en el proceso apoptótico. Sin embargo, una vez activada, BAX adopta una configuración BH3 into groove donde la inserción del dominio core, pero no del dominio latch, se antoja indispensable para la formación del poro apoptótico. Referente a BFL1 y sus actividades de membrana, concluimos que BFL1 posee un mecanismo de acción multimodal (MODO-0 o retrotranslocación de BAX, MODO-1 o formación de un hetero-complejo con la proteína proapoptótica cBID y MODO-2 interacción con la proteína BAX activa) y bifuncional (fenotipo antiapoptótico y proapoptótico) regulado por la cantidad de CL en la membrana. BFL1 ejerce su actividad antiapoptótica mediada por interacciones canónicas BH3-into-groove mientras que en membranas con alto contenido en cardiolipina, las cuales imitan los microdominios de este lípido descritos en condiciones apoptóticas, BFL1 no solo pierde la capacidad de formar heterodímeros con los miembros proapoptóticos, sino que también es capaz de homodimerizar vía una superficie no descrita previamente situada en el dominio BH4 de la proteína

Maleimide constrained BAD BH3 domain peptides as BCL-xL Inhibitors: A Versatile Approach to Rapidly Identify Sites Compatible with Peptide Constraining

Development of protein–protein interaction (PPI) inhibitors remains a major challenge. A significant number of PPIs are mediated by helical recognition epitopes; although peptides derived from such epitopes are attractive templates for inhibitor design, they may not readily adopt a bioactive conformation, are susceptible to proteolysis and rarely elicit optimal cell uptake properties. Constraining peptides has therefore emerged as a useful method to mitigate against these liabilities in the development of PPI inhibitors. Building on our recently reported method for constraining peptides by reaction of dibromomaleimide derivatives with two cysteines positioned in an i and i + 4 relationship, in this study, we showcase the power of the method for rapid identification of ideal constraining positions using a maleimide-staple scan based on a 19-mer sequence derived from the BAD BH3 domain. We found that the maleimide constraint had little or a detrimental impact on helicity and potency in most sequences, but successfully identified i, i + 4 positions where the maleimide constraint was tolerated. Analyses using modelling and molecular dynamics (MD) simulations revealed that the inactive constrained peptides likely lose interactions with the protein as a result of introducing the constraint

CHARACTERIZATION OF INTERACTIONS BETWEEN HEPATITIS C VIRUS AND HOST PROTEINS AND THEIR EFFECTS ON APOPTOSIS

Ph.DDOCTOR OF PHILOSOPH