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Development of high-speed imaging techniques for C. elegans nervous system studies
We report high-speed imaging techniques for C. elegans nervous systems studies.
We introduce C. elegans, the main model organism in this dissertation, and neuroscientific and biomedical studies using C. elegans involving calcium imaging, nerve regeneration, and drug screening. We review technologies including confocal microscopy and microfluidic devices used in the neuroscientific and biomedical studies
We discuss development of a high-speed laser scanning confocal microscope capable of flexible control of imaging conditions, fast imaging speed, and large field-of-view. We provides the design principles used in the development of the confocal microscope including the optical, electrical, and software implementation, and the details of the confocal microscope we built based on the design principles. We present the performance characterization of the confocal microscope, then a few sample images obtained with the confocal microscope.
We present development of time-lapse volumetric confocal imaging of whole animal C. elegans Ca²⁺ dynamics. We provide the design of the time-lapse volumetric confocal imaging system including a microfluidic device to accommodate the whole animal within the field-of-view of the imaging system. We examine the feasibility of the volumetric confocal imaging of a whole animal, and demonstrate imaging of the whole animal C. elegans neurons’ response to NaCl within a 630 × 150 × 25 μm³ volume at 2 Hz rate.
We report a high-throughput automated imaging platform for C. elegans nerve regeneration study. We describe the design of the automated imaging platform and the automation flow, and characterizes the performance of the platform. The imaging platform can obtain high-resolution 3D confocal images of 20 animals in 10 minutes. We show sample images of C. elegans anterior lateral microtubule nerve regeneration examples acquired via the automated imaging platform.
We demonstrate a planar laser activated neuronal scanning platform (PLANS), a high-throughput animal examination system for drug screening. We explain the construction of PLANS involving the optics, the microfluidic device, and the electronics. The PLANS system can scan an animal in less than 5 ms with a spatial sampling resolution of 3 μm FWHM. We show sample scanning results of a Huntington’s disease model of C. elegans.
We summarize the studies discussed in this dissertation, and suggest relevant future research to follow up on the studies.Electrical and Computer Engineerin
A microphysiological in vitro model of the renal proximal tubule reabsorptive barrier
Thesis (Ph.D.)--Boston UniversityMicrofabricated in vitro kidney tissue models replicate essential components of in vivo kidney physiology, providing a platform for direct observation of controlled yet physiologically-representative kidney tissue. Currently, static and flat cell culture environments serve as platforms to study cell behavior, tissue structure formation, renal disease mechanisms, and drug development. Petri dishes, well plates, and flasks sustain cell growth, but their environments lacks physiological cues that are present in the in vivo environment, prompting cell responses that may not be physiologically-representative. One alternative to these flat, static environments is to use animal models, which offer an in vivo environment but inherently come with uncontrollable fluctuations that introduce variables into the test setting. Microfabricated kidney tissue models improve upon other in vitro kidney tissue models by precisely controlling the geometry of device components via high-resolution fabrication and forming processes. Control over device component geometry consequently dictates control over mechanical parameters which influence and guide kidney cell and tissue structure and function. In addition, microfabrication methods create platforms compatible with the various cells, materials, and chemistries which also provide cues leading to replication of critical kidney function in vitro. The objective of this work is to develop an in vitro model of kidney tissue with physiologically-accurate replication of renal proximal tubule function. In chapter one, we have established a microphysiological model system of renal proximal tubule epithelia by a) characterizing the effect of user-defined physiological parameters on renal proximal tubule cells, and b) incorporating those parameters into a bilayer microfluidic device to model the renal reabsorptive barrier. In chapter two, we have characterized function o f our renal tissue model to establish metrics o f kidney-specific function , including reabsorption. In chapter three, we extend our proximal tubule model to include microvascular endothelial tissue and applied the metrics established in chapter 2 to quantify reabsorptive barrier function in the coculture model. This microphysiological model system provides an in vitro platform on which to model reabsorptive tissue barriers with kidney-specific function which enables meaningful applications for understanding biological transport phenomenon, observing underlying disease mechanisms, and improving the drug discovery process
Developing of an organ on chip device as novel in vitro platform to study organ mechanobiology: Peristalsis on a chip.
Developing of an organ on chip device as novel in vitro platform to study
organ mechanobiology: Peristalsis on a chip.
Knowing the mechanical properties of the gastrointestinal (GI) tract appears to be important for
understanding the molecular and cellular responses to mechanical stimuli on physiological
processes such as foods, xenobiotic or drugs digestion/absorption. These processes are
mediated by various intestinal cells such as epithelial cells, interstitial cells, smooth muscle
cells, and neurocytes. The loss or dysfunction of specific cells or mechanical strength of cell
bowel wall directly results in GI tract disease. Reversing the abnormal status of pathogenic cells
has been considered crucial to treatment of gut diseases. Gut bioengineered models have been
developing for the purpose to replace the damaged tissues and to provide three-dimensional
platforms that mimic the in vivo environment to study drug development, absorption and
toxicity. Nevertheless, the need to develop more complex models in vitro to study mechanical
stress is growing. In this perspective, this project will allow us to get an automatized
microfluidic gut platform to evaluate the pathophysiology of the small intestine through the
study of the shear stress of the bolus on the epithelial cells layer at the lumen side of the healthy
or diseased 3D intestine models. To this aim, the major goals of this project are the the design
and fabrication of complex and innovative microfluidic device provided with an integrated
PDMS membrane designed to mimic the crypt-villus axis in order to promote the differentiation
of the intestinal epithelium and the establishment of peristaltic motion by means of an
automatized and controlled elettrovalve system. The platform was used to estimate the intestinal
transport properties of the bolus and the physiological condition of the shear stress under
peristaltic motion. An important feature of the device, is the possibility to induce a fluid flow
both at the basolateral and the lumen side of the intestinal epithelium, therefore the possibility
to introduce integrated electrodes in the apical side and basoteral side in order to be enable
continuous monitoring of cells behaviour and differentiation through TransEpithelial Electrical
Resistance measurements. The effect of PDMS membrane morphology, peristaltic motion and
shear stress on intestinal epithelial cell differentiation, mucus production and molecules
adsorption process has been evaluated. The development of the Peristalsis on chip device could
be reduce the poorly predictive preclinical evaluation generated by the phylogenetic distance
between laboratory animals and humans, the discrepancy between current in vitro systems and
the human body, and the restrictions of in silico modelling
Study of the influence of a DC electric field on the development of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans
Tese de mestrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012A bioelectricidade pode influenciar a polarização de uma célula, responsável pela divisão assimétrica, pelo que tem um impacto significativo no desenvolvimento de tecidos ao contribuir para controlar a migração e orientação de células e também a proliferação, diferenciação e apoptose celulares. Estas propriedades da bioelectricidade em tecidos biológicos tornam-na numa ferramenta importante em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, pois permite controlar várias respostas fisiológicas a estímulos eléctricos e usá-las para fins benéficos.
O nematóide Caenorhabditis elegans é um organismo primitivo, mas cuja fisiologia partilha várias características da biologia humana. Estas características, juntamente com a sua simplicidade de cultivar em grandes populações e de ser conveniente para análise e manipulação genética, tornam-no num dos organismosmodelo mais vastamente utilizados em investigação científica, existindo actualmente uma enorme quantidade de informação disponível sobre este nematóide. O embrião do C. elegans representa um modelo ideal para o estudo da divisão celular e da embriogénese, visto que o seu desenvolvimento é altamente reprodutível e facilmente observável. Além disso, o padrão de desenvolvimento do embrião é praticamente invariável, tornando possível construir um diagrama que representa toda a sua linhagem celular, o que facilita imensamente a análise da embriogénese.
A motivação deste projecto surge do conhecimento de que vários seres vivos, como a hidra ou a salamandra, possuem uma grande capacidade de regeneração que está grandemente relacionada com a bioelectricidade. Compreender e controlar os seus mecanismos será certamente um grande avanço na área de engenharia de tecidos e terá como consequência o surgimento de diversas potenciais aplicações.
Este projecto tem como objectivo aplicar a aplicação de um campo eléctrico DC num organismo vivo, de forma a induzir uma resposta por parte dele. Devido às suas características, o embrião do nematóide C. elegans foi escolhido como organismo modelo para a aplicação deste estímulo eléctrico. A principal assumpção é que o campo eléctrico aplicado ao longo do eixo antero-posterior do embrião do nematóide C. elegans, induza uma acumulação de carga oposta nas suas extremidades anterior e posterior com o intuito de alterar o potencial de membrana, onde se levantou a hipótese de poderem induzir respostas celulares diferentes em cada extremidade, causando alterações na embriogénese. A ideia surge de uma analogia à aplicação de um gradiente de temperatura ao longo desse mesmo eixo, sabendo-se actualmente que induz uma resposta relativamente à duração de ciclos celulares, visto que é fortemente dependente da temperatura.
Através dos resultados, pretende-se também avaliar a utilidade deste embrião como um organismo-modelo para o estudo do impacto de campos eléctricos DC em tecido vivo, visto que outros embriões, como de anfíbios ou pintos, apresentam grandes distúrbios no seu desenvolvimento quando estimulados com campos eléctricos contínuos, com consequências catastróficas no organismo final.
A tecnologia dos micro-sistemas permite controlar eficazmente o ambiente celular de uma forma bastante precisa. Assim, um sistema microfluídico é usado como plataforma para estudar o impacto da aplicação do campo eléctrico ao embrião. Este é colocado no interior de um microcanal contendo PBS (tampão fosfato-salino), um bom electrólito e ao mesmo tempo biocompatível para o seu desenvolvimento. Recorrendo a eléctrodos de platina, é aplicada uma diferença de potencial nas extremidades do canal, o que torna possível a existência de uma corrente eléctrica que deverá resultar numa acumulação de carga oposta nas extremidades do embrião, visto que a sua resistividade deverá ser superior à do PBS. A largura e altura do canal são semelhantes à espessura do embrião, o que garante que o campo eléctrico passa através do embrião ou que seja desviado por ele, no caso de este ser isolante.
Tendo em conta que o campo eléctrico propaga-se através do canal em direcção ao embrião, é necessário saber qual a sua magnitude à volta dele. Além disso, interacções físicas como o efeito de Joule e reacções redox entre os eléctrodos e o electrólito podem alterar a temperatura e o pH no interior do canal e comprometer o desenvolvimento do embrião de forma indesejada. Assim é também efectuada uma caracterização física detalhada do sistema microfluídico, com o intuíto de saber quais os
principais fenómenos físicos que podem ocorrer no interior do canal durante a aplicação do campo eléctrico. Esta caracterização permite tomar as medidas necessárias para minimizar estes efeitos secundários que possam perturbar o normal desenvolvimento do embrião.
A caracterização física do sistema consiste essencialmente numa análise das interacções dos eléctrodos de platina com uma solução de cloreto de sódio, o principal constituinte do PBS e em determinar a relação entre a corrente eléctrica no canal e a diferença de potencial aplicada. Para isso são efectuadas medições experimentais e simulações recorrendo ao software de elementos finitos COMSOL Multiphysics. O procedimento experimental para a análise do impacto do campo eléctrico no embrião começa com a recolha de um embrião de um nematóide hermafrodita adulto, proveniente de uma cultura em pratos de agarose semeados com Escherichia coli como fonte de alimento. O embrião escolhido deve estar no início do desenvolvimento, de preferência após a meiose, de forma a poder ser estimulado o mais cedo possível. Sabese que perturbar os eventos iniciais da embriogénese pode ter consequências em todo o restante desenvolvimento, visto que este depende grandemente das primeiras divisões celulares.
Recolhido o embrião, este é inserido no microcanal, onde é fixado e permanece durante todo o ensaio experimental. De seguida, o campo eléctrico é aplicado através da aplicação de uma diferença de potencial nos eléctrodos em contacto com as extremidades do canal. Pontes salinas de agarose são utilizadas em algumas experiencias para evitar a contaminação do electrólito com produtos das reacções químicas que ocorrem na superfície dos eléctrodos. O desenvolvimento do embrião é observado através de microscópios invertidos equipados com contraste de fase. Imagens de time-lapse são capturadas e posteriormente analisadas recorrendo ao software ImageJ. Eventos da embriogénese seleccionados para análise são comparados para embriões em experiencias de controlo e embriões estimulados com o campo eléctrico.
Métodos de análise estatística são efectuados para auxiliar a comparação. Parâmetros a observar e comparar são os tempos de ocorrência dos eventos seleccionados e orientação e posição de células no embrião. O comportamento da minhoca juvenil após o nascimento também pode fornecer informação relativamente à embriogénese, pelo que também é analisado.
A caracterização do chip revelou que uma tensão de 5V é apropriada para criar um campo eléctrico com dimensões fisiológicas (cerca de 0.3mV/μm), não aumentando a temperatura para valores fora dos limites de desenvolvimento normal do embrião. Alterações do pH foram minimizadas através da utilização das pontes salinas inseridas nas entradas do canal.
A comparação entre embriões de controlo e embriões estimulados revela que não existem grandes diferenças entre os eventos da embriogénese de embriões de controlo e embriões estimulados pelo campo eléctrico, o que sugere que o embrião resiste ao campo eléctrico, talvez devido à barreira de permeabilidade presente na sua carapaça. Pequenas diferenças nos tempos embriológicos entre embriões de controlo e estimulados sugerem que o campo eléctrico possa ter efeitos a longo prazo na embriogénese, retardando os seus eventos mais tardios. As diferenças são demasiado pequenas para se poder tirar alguma conclusão, contudo, os resultados sugerem que deveria ser feita uma análise mais detalhada ao ciclo celular de certas células do início da embriogénese, o que não foi possível com o equipamento disponível. Comparando estes resultados com os de outros estudos com embriões, como por exemplo em anfíbios ou pintos, conclui-se que o impacto do um campo eléctrico DC no desenvolvimento do embrião do nematóide C. elegans não é tão significativo como nesses modelos, o que os torna preferíveis para estudos com embriões intactos. No entanto, existe ainda a possibilidade de estudos a nível de células isoladas extraídas do embrião e também não é de descartar a hipótese de aplicar um campo eléctrico AC ou de tentar remover a carapaça do embrião em futuras investigações.Bioelectricity has an impact on the development of tissues because it can influence cell polarization, essential for asymmetric cell division. This feature may be an important tool for tissue engineering and regenerative medicine applications. The nematode Caenorhabditis elegans is a primitive organism, but whose physiology shares several characteristics of human biology. Its embryo is an ideal model for the study of cell division and embryogenesis, since its development is almost invariant and highly reproducible and readily observable. This project has the objective of studying the impact of a DC electric field in the C. elegans embryo development and to assert if this organism is a good model for further research in this field. To accomplish it, a DC electric field is applied in a microchannel filled with PBS, where to the embryo is confined. Embryogenesis is studied by analysing selected development stages, which are compared for control and electric field experiments. To optimize the application of the
electric field to the embryo and minimize other physical phenomena which can disturb embryogenesis, a detailed physical characterization of the microfluidic system is also performed.
The results show that there are no big differences in the events of embryogenesis, suggesting that the embryo resists to the electrode field, perhaps due its eggshell. Nevertheless, small differences in embryological times suggest that the electric field can have long term effects on embryogenesis, and that a more detailed analysis should be performed.
In summary, the embryo nematode C. elegans is not as suited to study the impact of DC electric fields in embryogenesis as other embryo models, such as amphibians. However, there is still the possibility of studies of single isolated embryo cells. Besides, it is not discarded the possibility of applying an AC electric field or attempting to remove the eggshell in future studies
Bone regeneration in patient-specific scaffolds from microfluidics to computational simulation
Los trastornos musculoesqueléticos y sus correspondientes enfermedades óseas son una de las principales causas de dolor y discapacidad, así como una carga social y económica para nuestra sociedad. Cuando la función articular se ve afectada o los defectos óseos son demasiado grandes para los injertos óseos, los implantes protésicos son el método estándar para tratar los trastornos musculoesqueléticos graves, aunque existe la necesidad clínica de que los implantes permanezcan activos durante un período de tiempo más largo y reduzcan las tasas de revisión. Para abordar la mayor durabilidad de los implantes ortopédicos, recientemente han surgido implantes impresos en tres dimensiones (3D) para fabricar superficies porosas específicas del paciente en la superficie del hueso-implante, mejorando así la fijación biológica del implante. La traslación de los principios de la medicina regenerativa a la ortopedia permitiría definir una nueva generación de implantes que completen la transición de materiales inertes a andamios bioactivos que guíen el proceso de regeneración ósea. A corto plazo, es probable que los andamios ortopédicos regenerativos impresos en 3D aumenten la vida útil del implante, mientras que a largo plazo puedan degradarse una vez que el tejido huésped esté completamente reparado. El objetivo global de esta tesis es evaluar el potencial regenerativo asociado a los andamiajes óseos impresos en 3D para aplicaciones ortopédicas específicas del paciente.Para ello, el primer estudio tuvo como objetivo determinar el papel del entorno mecánico del huésped en el proceso de regeneración ósea guiado por andamios óseos impresos en 3D en aplicaciones de carga. Se desarrolló un modelo computacional de regeneración ósea impulsada por un mecanismo en andamios porosos y se basó en la especificidad del sujeto, el sitio de implantación y la sensibilidad al entorno mecánico. A continuación, se simuló el crecimiento óseo en el interior de andamiajes porosos de titanio implantados en el fémur distal y la tibia proximal de tres cabras y se comparó con los resultados experimentales. Los resultados mostraron que el crecimiento óseo en el interior cambió de un patrón de distribución homogéneo, cuando los andamios estaban en contacto con el hueso trabecular, a un crecimiento óseo localizado cuando los andamios se implantaron en una ubicación diafisaria. En general, la dependencia de la respuesta osteogénica de la biomecánica del huésped sugirió que, desde una perspectiva mecánica, el potencial regenerativo dependía tanto del andamio como del entorno del huésped.El segundo estudio de esta tesis tuvo como objetivo evaluar la actividad osteogénica específica del paciente en un entorno controlado in vitro donde las células óseas humanas, aisladas de sujetos individuales, imitan los rasgos esenciales del proceso de formación ósea. Los sistemas in vitro tradicionales ya permitieron demostrar que los osteoblastos humanos primarios embebidos en una matriz fibrada de colágeno se diferencian en osteocitos en condiciones específicas. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la traslación de este entorno a la escala de órgano en un chip crea una unidad funcional mínima para recapitular la maduración de los osteoblastos hacia los osteocitos y la mineralización de la matriz. Con este propósito, se sembraron osteoblastos humanos primarios en un hidrogel de colágeno de tipo I, para conocer mejor el papel de la densidad de siembra de células en su diferenciación a osteocitos. Los resultados muestran que las células cultivadas a mayor densidad aumentan la longitud de la dendrita con el tiempo, dejan de proliferar, exhiben morfología dendrítica, regulan positivamente la actividad de la fosfatasa alcalina y expresan marcadores de osteocitos. Este estudio reveló que los sistemas de microfluídica son una estrategia funcional que permite crear un modelo de tejido óseo específico del paciente e investigar el potencial osteogénico individual de las células óseas del paciente.En conjunto, los resultados de esta tesis enfatizan la importancia de utilizar un sistema de modelado múltiple al investigar el proceso de regeneración in vivo guiado por armazones óseos específicos adecuados al paciente. Ambos actores de una estrategia regenerativa libre de células in situ, a saber, el andamio y el paciente, tienen un efecto significativo en el resultado regenerativo final y necesitan ser modelados. Las técnicas avanzadas de in vitro e in silico, combinadas con datos de in vivo, evalúan aspectos distintivos del proceso de regeneración ósea para aplicaciones específicas del paciente. Las futuras estrategias personalizadas de ingeniería de tejidos podrían depender de la integración de esos modelos para mitigar en última instancia la variabilidad en el proceso de regeneración ósea guiado por un andamio específico para el paciente.<br /
Cardiac Meets Skeletal: What's New in Microfluidic Models for Muscle Tissue Engineering
In the last few years microfluidics and microfabrication technique principles have been extensively exploited for biomedical applications. In this framework, organs-on-a-chip represent promising tools to reproduce key features of functional tissue units within microscale culture chambers. These systems offer the possibility to investigate the effects of biochemical, mechanical, and electrical stimulations, which are usually applied to enhance the functionality of the engineered tissues. Since the functionality of muscle tissues relies on the 3D organization and on the perfect coupling between electrochemical stimulation and mechanical contraction, great efforts have been devoted to generate biomimetic skeletal and cardiac systems to allow high-throughput pathophysiological studies and drug screening. This review critically analyzes microfluidic platforms that were designed for skeletal and cardiac muscle tissue engineering. Our aim is to highlight which specific features of the engineered systems promoted a typical reorganization of the engineered construct and to discuss how promising design solutions exploited for skeletal muscle models could be applied to improve cardiac tissue models and vice versa
Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip
Developing physiologically relevant in vitro models for studying periodontitis is crucial for understanding its pathogenesis and developing effective therapeutic strategies. In this study, we aimed to integrate the spheroid culture of periodontal ligament stem cells (PDLSCs) within a spheroid-on-chip microfluidic perfusion platform and to investigate the influence of interstitial fluid flow on morphogenesis, cellular viability, and osteogenic differentiation of PDLSC spheroids. PDLSC spheroids were seeded onto the spheroid-on-chip microfluidic device and cultured under static and flow conditions. Computational analysis demonstrated the translation of fluid flow rates of 1.2 μl min-1 (low-flow) and 7.2 μl min-1 (high-flow) to maximum fluid shear stress of 59 μPa and 360 μPa for low and high-flow conditions, respectively. The spheroid-on-chip microfluidic perfusion platform allowed for modulation of flow conditions leading to larger PDLSC spheroids with improved cellular viability under flow compared to static conditions. Modulation of fluid flow enhanced the osteodifferentiation potential of PDLSC spheroids, demonstrated by significantly enhanced alizarin red staining and alkaline phosphatase expression. Additionally, flow conditions, especially high-flow conditions, exhibited extensive calcium staining across both peripheral and central regions of the spheroids, in contrast to the predominantly peripheral staining observed under static conditions. These findings highlight the importance of fluid flow in shaping the morphological and functional properties of PDLSC spheroids. This work paves the way for future investigations exploring the interactions between PDLSC spheroids, microbial pathogens, and biomaterials within a controlled fluidic environment, offering insights for the development of innovative periodontal therapies, tissue engineering strategies, and regenerative approaches.</p
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