Molecular cloning and expression of bovine nucleoplasmin 2 (NPM2): a maternal effect gene regulated by miR-181a

Background Nucleoplasmin 2 (NPM2) is an oocyte-specific nuclear protein essential for nuclear and nucleolar organization and early embryonic development. The aims of this study were to clone the bovine NPM2 gene, determine its temporal expression during oocyte development and early embryogenesis, and evaluate the potential role of miRNA-181a in regulation of its expression. Methods A 329 bp cDNA fragment was amplified from bovine fetal ovary using primers designed based on the conserved regions of the human and mouse NPM2 cDNA sequences. RACE experiments were performed to obtain the 5\u27 and 3\u27 ends of the bovine NPM2 cDNA. Real time PCR and Western blot analysis were used to examine the expression of bovine NPM2 in oocytes and early embryos. Co-expression of bovine NPM2 and miRNA-181a in Hela cells was performed to determine if expression of bovine NPM2 is regulated by miRNA-181a. Results The bovine NPM2 cDNA is 851 bp in length encoding a protein of 200 amino acids. The protein contains the conserved bipartite nuclear localization sequence and shows 53% and 62% identity with mouse and human NPM2, respectively. Expression of bovine NPM2 mRNA is restricted to ovaries. NPM2 mRNA is abundant in GV and MII stage oocytes, decreases in early cleavage stage embryos, and barely detectable in morula and blastocyst stage embryos. Similarly, expression of NPM2 protein is high in oocytes and early embryos but extremely low in blastocysts. The abundance of NPM2 mRNA is significantly lower in oocytes isolated from persistent versus growing dominant follicles (P \u3c 0.05). A miR-181a binding site in the 3\u27UTR of the NPM2transcript was identified. Transfection experiments showed that bovine NPM2 protein expression is reduced in Hela cells expressing miR-181a compared to control cells without miR-181a, indicating that translation of NPM2 is repressed by miR-181a. Conclusions Our data suggest that expression of bovine NPM2 is temporally regulated during early embryogenesis and miR-181a may play a role in its regulation

Epigenetic regulation in mammalian preimplantation embryo development

Preimplantation embryo development involves four stages: fertilization, cell cleavage, morula and blastocyst formation. During these stages, maternal and zygotic epigenetic factors play crucial roles. The gene expression profile is changed dramatically, chromatin is modified and core histone elements undergo significant changes. Each preimplantation embryo stage has its own characteristic epigenetic profile, consistent with the acquisition of the capacity to support development. Moreover, histone modifications such as methylation and acetylation as well as other epigenetic events can act as regulatory switches of gene transcription. Because the epigenetic profile is largely related to differentiation, epigenetic dysfunction can give rise to developmental abnormalities. Thus, epigenetic profiling of the embryo is of pivotal importance clinically. Given the importance of these aspects, this review will mainly focus on the epigenetic profile during preimplantation embryo development, as well as interactions between epigenetic and genetic regulation in these early developmental stages

DNA Methylation and miRNA-1296 Act in Concert to Mediate Spatiotemporal Expression of KPNA7 During Bovine Oocyte and Early Embryonic Development

Abstract Background: Epigenetic regulation of oocyte-specific maternal factors is essential for oocyte and early embryonic development. KPNA7 is an oocyte-specific maternal factor, which controls transportation of nuclear proteins important for early embryonic development. To elucidate the epigenetic mechanisms involved in the controlled expression of KPNA7, both DNA methylation associated transcriptional silencing and microRNA (miRNA)-mediated mRNA degradation of KPNA7 were examined. Results: Comparison of DNA methylation profiles at the proximal promoter of KPNA7 gene between oocyte and 6 different somatic tissues identified 3 oocyte-specific differentially methylated CpG sites. Expression of KPNA7 mRNA was reintroduced in bovine kidney-derived CCL2 cells after treatment with the methylation inhibitor, 5-aza-2′- deoxycytidine (5-Aza-CdR). Analysis of the promoter region of KPNA7 gene in CCL2 cells treated with 5-Aza-CdR showed a lighter methylation rate in all the CpG sites. Bioinformatic analysis predicted 4 miRNA-1296 binding sites in the coding region of KPNA7 mRNA. Ectopic co-expression of miRNA-1296 and KPNA7 in HEK293 cells led to reduced expression of KPNA7 protein. Quantitative real time PCR (RT-qPCR) analysis revealed that miRNA-1296 is expressed in oocytes and early stage embryos, and the expression reaches a peak level in 8-cell stage embryos, coincident with the time of embryonic genome activation and the start of declining of KPNA7 expression. Conclusions: These results suggest that DNA methylation may account for oocyte-specific expression of KPNA7, and miRNA-1296 targeting the coding region of KPNA7 is a potential mechanism for KPNA7 transcript degradation during the maternal-to-zygotic transition

Extracellular vesicles, microRNA and the preimplantation embryo: non-invasive clues of embryo well-being

Elective single embryo transfer is rapidly becoming the standard of care in assisted reproductive technology for patients under the age of 35 years with a good prognosis. Clinical pregnancy rates have become increasingly dependent on the selection of a single viable embryo for transfer, and diagnostic techniques facilitating this selection continue to develop. Current progress in elucidating the extracellular vesicle and microRNA components of the embryonic secretome is reviewed, and the potential for these findings to improve clinical embryo selection discussed. Key results have shown that extracellular vesicles and microRNAs are rapidly detectable constituents of the embryonic secretome. Evidence suggests that the vesicular population is largely exosomal in nature, secreted at all stages of preimplantation development and capable of traversing the zona pellucida. Both extracellular vesicle and microRNA concentrations within the secretome are elevated for blastocysts with diminished developmental competence, as indicated either by degeneracy or implantation failure, whereas studies have yet to firmly correlate individual microRNA sequences with pregnancy outcome. These emerging correlations support the viability of extracellular vesicles and microRNAs as the basis for a new diagnostic test to supplement or replace morphokinetic assessment

Functional analysis of microRNA-130b in bovine oocyte maturation and preimplantation embryo development

MicroRNAs (miRNAs) are well known to regulate the proteins involved in various biological processes including development. The expression pattern of miRNAs is believed to vary between immature and in vitro matured bovine oocytes. Among these, miR-130b was reported to upregulated in immatured compared to matured oocytes. However, its functional role in cell viability, proliferation or transcription during bovine oocyte maturation and preimplantation embryo development is not known. Therefore, this experiment was aimed to investigate the functional role of miR-130b in oocyte maturation and oocyte surrounding cells and its involvement in preimplantation embryo development. For this, the spatiotemporal expression pattern of miR-130 family was performed throughout the bovine preimplantation stage embryos. Accordingly, miR-130b was found to be highly expressed in cumulus and granulosa cells, immature oocyte, morula and blastocyst stage embryos. Once the expression pattern of miR-130b was evaluated, its target genes were in silico analyzed and experimentally validated. Accordingly, MSK1, SMAD5, MEOX2, DOC1R and EIF2C4 were found to be the real targets of miR-130b. To investigate the involvement of miR-130b during oocyte maturation, immatured oocytes were microinjected with pre-miR-130b (precursor) or sequence specific antisense (inhibitor) of miR-130b, while scramble miRNA injected and uninjected oocytes were used as controls. The maturational status of the oocytes and the level of miR-130b target genes expression were assessed 22 hours post microinjection. The result showed that the first polar body extrusion was 86.3, 73, 85 and 84.6% in oocytes injected with pre-miR-130b, anti-miR-130b, scramble and uninjected controls, respectively. Similarly, mitotic staining showed that majority of oocytes injected with anti-miR-130b remains arrested at the telephase I stage (22%) and significantly reduced to reach Metaphase II compared to other oocyte groups. In addition, the mitochondrial activity was higher in pre-mir-130b and lower in anti-miR-130b injected oocytes compared to scramble and uninjected oocytes. This was associated with the reduction of miR-130b and increase of its target genes SMAD5 and MSK1 expression. Furthermore, oocyte surrounding cells are required for oocyte maturation, the involvement of miR-130b in cumulus and granulosa cell proliferation, lactate production and cholesterol level was assessed after transfection of pre-miR-130b or anti-miR-130b in both cell types. The inhibition of miR-130b resulted in reduction of cell proliferation and lactate production. However, knockdown of miR-130b did not change the cholesterol level in the granulosa or cumulus cells. Apart from oocyte maturation and oocyte companion cell function, the role of miR-130b was investigated during preimplantation embryo development by microinjecting zygotes with pre-miR-130b or anti-miR-130b. The result has shown that the first cleavage rate was unaffected by knockdown or ectopic expression of miR-130b, but the rate of morula and blastocyst were significantly reduced in anti-miR-130b injected zygotes. Therefore this study provides the significant evidence that miR-130b may be required during bovine oocyte in vitro maturation and granulosa cell proliferation, morula and blastocyst formation, further functional in depth studies are necessary to understand whether miR-130b is involved in bovine oocyte in vivo maturation or embryo implantation.Funktionelle Analyse der microRNA miR-130b während der bovinen Oozytenmaturation und der preimplantativen Embryonalentwicklung MicroRNAs (miRNAs) sind dafür bekannt, dass sie eine regulatorische Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, wie in der Embryonalentwicklung spielen. Es wir angenommen, dass das Expressionsmuster von miRNAs zwischen immaturen und in vitro maturierten bovinen Oozyten variiert, wobei gezeigt wurde, da miR-130b in inmaturierten Oozyten hoch reguliert ist. Allerdings ist seine funktionelle Rolle in der Zellvitalität, Proliferation und Transkription während der bovinen Oozytenmaturation und der Präimplantiationsembryoentwicklung noch nicht bekannt. Daher war das Ziel dieser Studie die Bedeutung von miR-130b in der Maturation von Oozyten-, Granulosa- und Kumuluszellen und in der präimplantativen Embryoentwicklung zu untersuchen. Dafür wurde das Expressionsmuster der miR-130-Familie im bovinen embryonalen Präimplantationsstadium erstellt. MiR-130b war in Kumulus- und Granulosazellen, in immaturen Oozyten sowie im Morula- und Blastozystenstadium höher exprimiert. Die miR-130b Zielgen Identifizierung erfolgte mittels der In silico Analyse und der experimentellen Validierung durch den Luciferase-Assay. Dementsprechend konnten MSK1, SMAD5, MEOX2, DOC1R und EIF2C4 als Zielgene von miR-130b ermittelt werden. Um den Einfluss der miR-130b während der Maturation der Oozyten zu untersuchen, wurden in immaturierten Oozyten pre-miR-130b und sequenz-spezifische miR-130b Antisense (Inhibitor) mikroinjiziert, während mit scrambled miRNA injizierte und nicht injizierte Oozyten als Kontrolle dienten. 24 Stunden nach der Mikroinjektion wurde der Reifungsstatus der Oozyten mittels der ersten Polkörper-Extrusion, festgestellt. Sie betrug 86,3, 73, 85, und 84,6% bei Oozyten mit injizierter pre-miR-130b, anti-miR-130b, scramble RNA und nicht injizierte Kontrolle. Die Mehrheit der anti-miR-130b injizierten Oozyten blieb in der Telophase 1 (22%) stehen. Darüber hinaus konnte eine höhere mitrochendriale Aktivität in pre-miR-130b und eine niedrigere in anti-miR-130b injizierten Oozyten im Vergleich zu scramble RNA und nicht injizierte Oozyten gefunden werden. Dies konnte mit der Zunahme der Proteinexpression der miR-130b Zielgene SMAD5 und MSK1 assoziiert werden. Oozyten Companionzellen sind für die Oozytenmaturation erforderlich. Der Einfluss der miR-130b konnte bei der Zellproliferation, Laktatproduktion und beim Cholesterinspiegel durch die Transfektion der miR-130b Precursor RNA oder anti-miR-130b RNA in Kumulus- und Granulosazellen beobachtet werden. Mit der Reduktion der miR-130b folgte einen Reduzierung in der Zellproliferation und der Laktatproduktion, allerdings keine Änderungen im Cholesterinspiegel in Granulosa- oder Kumuluszellen. Neben der Maturation der Oozyten und der Oozyten Companionzellfunktion wurde die Rolle der miR-130b während der präimplantations Embryoentwicklung nach einer Mikroinjektion der miR-130b Precursor oder – Inhibitor in Zygoten untersucht. Das Ergebnis zeigte, dass die erste Teilungsrate unbeeinflusst vom Knockdown oder der Überexpression der miR-130b war, jedoch war die Morula/Blastozysten rate der anti-miR-130b injizierten Eizellen signifikant reduziert. Diese Studie liefert Hinweise dafür, dass die miR-130b während der bovinen Oozytenmaturation, der Granulosazellproliferation und der Morula- und Blastozystenformation funktionell beteiligt ist

Role and modulation of maternal transcripts during the first cleavage divisions in bovine embryos

Ce travail porte sur l’identification, la fonction et la régulation des molécules maternelles d’ARNm qui dirigent la compétence développementale juste après la fécondation chez les bovins. Tout d’abord, en utilisant le modèle du temps écoulé jusqu’au premier clivage zygotique et à travers l’évaluation du transcriptome des embryons à 2-cellules, il fut possible de déterminer la signature moléculaire des niveaux extrêmes de compétence au développement et sélectionner des molécules candidates pour des études postérieures. Les résultats ont montré que les embryons de capacité développementale variable diffèrent dans certaines fonctions comme la réparation de l’ADN, le traitement de l’ARN, la synthèse de protéines et l'expression génique définies par des ARNm synthétisés par l’ovocyte. Pour obtenir une confirmation fonctionnelle, une paire de transcrits maternels (l’un détecté dans notre sondage précédent et l’autre étant une molécule reliée) ont été inhibés par « knock-down » dans des ovocytes. Les effets du knock-down de ces facteurs de transcription sont apparus avant la formation des blastocystes dû à une diminution de la capacité au clivage et celle à progresser après le stage de 8-cellules. L’analyse moléculaire des embryons knock-down survivants suggère qu’un de ces facteurs de transcription est un contrôleur crucial de l’activation du génome embryonnaire, qui représente une fenêtre développementale dans l’embryogenèse précoce. Dans la dernièr étude, nous avons testé si les facteurs de transcription d'intérêt sont modulés au niveau traductionnel. Des ARNm rapporteurs couplés à la GFP (Protéine fluorescente) contenant soit la version courte ou la version longue de la séquence 3’-UTR des deux molécules furent injectées dans des zygotes pour évaluer leur dynamique traductionnelle. Les résultats ont montré que les éléments cis-régulateurs localisés dans les 3’-UTRs contrôlent leur synchronisation traductionnelle et suggèrent une association entre la compétence développementale et la capacité de synthèse de ces protéines. Ceci conduit à l’idée que ces facteurs de transcription cruciaux sont aussi contrôlés au niveau traductionnel chez les embryons précoces. Les connaissances acquises ont joué un rôle essentiel pour définir le contrôle potentiel des molécules maternelles sur les embryons au début de leur développement. Cette étude nous montre aussi une utilisation potentielle de cette information ainsi que les nouveaux défis présents dans le secteur des technologies reproductives.This work explores the identity, the function, and the regulation of maternal mRNA molecules that drive developmental competence shortly after fertilization in cattle. First of all, by using the model of the time of first zygotic cleavage and assessing the transcriptome of 2-cell embryos, it was possible to determine the molecular fingerprint of extreme levels of developmental competence and select candidate molecules for further monitoring. Data implied that early embryos of variable developmental capacity differ in functions including DNA repair, RNA processing, protein synthesis, and gene expression that are dictated by oocyte-synthesized mRNA. To obtain a functional confirmation, a pair of maternal transcripts (one detected in our previous survey and other related molecule) were knocked-down in oocytes that were further cultured. The effects of ablating these transcription factors were evident before blastocyst formation due to a decrease in cleavage capacity, as well as progression past the 8-cell stage. The molecular analysis of surviving knocked-down embryos suggested that one of these transcription factors is a pivotal orchestrator of the activation of the embryonic genome, a critical developmental window in early embryogenesis. In the last survey, we asked whether the transcription factors of interest are modulated at the translational level. Reporter mRNAs containing either short or long versions of the 3’-UTR sequences of both molecules were injected in zygotes to look at their translational dynamics. Results showed that cis-acting elements located in the 3’-UTRs govern their timely translation and suggested an association between developmental competence and protein synthesis capacity. This led to the notion that these crucial transcription factors are also controlled at the translational level in early embryos. The acquired knowledge was instrumental to define the possible control operated by maternal molecules on embryos at the onset of their development, as well as some of the challenges and potential use of this information in the field of reproductive technologies

Functional analysis of bovine DNMT1 during bovine embryo development and its association with Bull fertility traits

This study was conducted to investigate the effects of suppressing and inhibiting DNMT1 on the embryonic development and bull fertility traits. In the first approach, in vitro produced zygotes were assigned randomly into four groups namely: those injected with Smartpool siRNA (SpsiRNA), 5aza-2’-deoxycytidine (5-AZA), nuclease free water and non-injected control. The proportions of different stages of embryos were assessed 48 and 72 hr post microinjection (pmi) while blastocyst rate was assessed at day 8 pmi. A second objective was to identify the effects of SNPs in DNMT1, DNMT3a and DNMT3b on bull fertility traits namely: non-return rate (NRR), sperm quality traits namely: sperm volume per ejaculate, sperm concentration, sperm motility, survivability after thawing, and sperm flow cytometric parameter namely: positive acrosome status (PAS), plasma membrane integrity (PMI) and DNA fragmentation index (DFI): and embryonic development in terms of time at first cleavage, late cleavage and blastocyst. For this, 310 breeding bull sperms obtained station and 350 embryos were genotyped at those loci using DNA samples. The proportions of the 8-cell embryos were lower in SpsiRNA and 5-AZA injected groups. The lowest total blastocyst rate was observed in 5-AZA treatment group. Microinjection of SpsiRNA has reduced the target mRNA by 80 and 50% in 8-cell and blastocyst stage embryos. Lower protein expression was also observed at 8-cell stage in embryos that were injected with SpsiRNA. The highest apoptotic index was found in SpsiRNA and 5-AZA injected groups. The microinjection of SpsiRNA and 5-AZA has increased the expression of IGF2 by 1.67 and 1.55 times. Analysis of variance revealed association of SNP of DNMT1 with NRR and PAS, while DNMT3a and DNMT3b were found to be associated with NRR as well as sperm motility. In addition, combined loci analysis of variance among DNMT1 x DNMT3a x DNMT3b showed significant association with NRR, sperm motility and survivability after thawing. SNP of DNMT1 gene was significant correlated with embryonic development. In conclusion, this gene evidently plays a critical role in bovine preimplantation and associates with bull fertility traits and embryonic development. Following validation of this result in an independent population, there is a great potential to use these loci as markers of fertility to enhance embryonic development.Funktionelle Analyse des bovinen DNMT1 während der embryonalen Entwicklung und seine Assoziation mit der Fruchtbarkeit von BullenDiese Studie wurde durchgeführt, um den repressiven und hemmenden Einfluss von DNMT1 (DNA methyltransferase 1) auf Merkmale der Bullenfruchtbarkeit und der embryonalen Entwicklung zu untersuchen. Im ersten Untersuchungsschritt wurden invitro erzeugte Zygoten zufällig in vier Gruppen aufgeteilt. Diese wurden mit drei unterschiedlichen Injektionen behandelt: der Injektion (a) mit Smartpool siRNA (SpsiRNA), (b) mit 5 aza-2’-deoxycytidine (5-AZA) und (c) mit Nuklease freiem Wasser. Gruppe 4 verblieb als unbehandelte Kontrolle bestehen. Das Verhältnis der unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Embryonen wurde 48 und 72 hr post Mikroinjektion (pmi) erfasst, wohingegen die Rate der Blastocysten 8 Tage pmi aufgezeichnet wurde. Im zweiten Abschnitt dieser Forschungsarbeit wurde der Einfluss der SNP von DNMT1, DNMT3a und DNMT3b in zwei unterschiedlichen Merkmalskomplexen geprüft. Zum einen wurde die Fruchtbarkeit von Bullen an Hand der Parameter Non-Return-Rate (NNR), Spermienqualität, sowie Plasma Membran Integrität (PMI), Akrosomen Integrität (PAS) und DNA Integrität (DFI) untersucht. Des Weiteren standen Merkmale der Embryonalentwicklung im Mittelpunkt. Zu diesem Zweck wurden die DNA von 310 Spermienproben von Bullen und 350 Embryonen an den entsprechenden Genorten genotypisiert. Die Anzahl der sich um 8-Zell-Stadium befindlichen Embryonen 72 hr nach pmi war geringer in den Gruppen die mit SpsiRNA und 5-AZA injiziert wurden. Die geringste Blastocystenrate wurde in der mit 5-AZA behandelten Gruppe beobachtet. Mikroinjektion von SpsiRNA bewirkte eine Reduktion der Target mRNA in Blastocysten und 8-Zell-Embryonen. Die Mikroinjektion von SpsiRNA und 5-AZA steigerten die Expression von IGF2. Die Varianzanalyse wies eine Assoziation des SNP in DNMT1 mit NRR und PAS vor, während DNMT3a und DNMT3b einen signifikanten Einfluss auf NNR und Spermienmotilität hatten. Zusätzlich zeigte eine kombinierte Genort Varianzanalyse von DNMT1 x DNMT3a x DNMT3b einen signifikanten Effekt auf NNR, Spermienmotilität und Überlebenfähigkeit nach dem Auftauen. Das Gen DNMT1 spielt eine entscheidende Rolle in der bovinen Preimplantation und es lässt sich mit Merkmalen der Bullenfruchtbarkeit und embryonalen Entwicklung assoziieren. Dies könnte ein Hinweis auf einen nützlichen, genetischen Marker zur Verbesserung der Merkmale sein, der durch weitere unabhängige Studien bewiesen werden kann.</p

In Vitro Fertilization

The field of In Vitro Fertilization is a relatively new field in medicine, constantly on the move. This field is an exquisite example of the vast power in the complementary use of basic research with clinical practice and opened a new route of great basic and clinical research possibilities. The knowledge base that allowed the accomplishment of the idea of in vitro fertilization and embryo transfer has much developed since. The vast body of research pertaining to this field allowed deepening our understanding in the processes related to reproduction. In this book on in vitro fertilization we present new and interesting updated information in various aspects of this field. This work is a result of collaborative work of an international group of professionals dedicated to contribute to the advancement of our knowledge

Bovine microRNomics: Implications during oocyte maturation and pathophysiology of endometrium

MicroRNAs which are known for posttranscriptional gene regulation are evidenced for their essential role during animal development and disease. In this study, identification and expression profiling of bovine miRNAs during oocyte maturation are scrutinized using heterologous approach, while miRNA regulated novel molecular signature underlying bovine subclinical endometritis was dissected using an integrative approach. Primarily, identification and expression profiling of microRNAs during bovine oocyte maturation was investigated using miRCURYTM locked nucleic acids (LNA) array (Exiqon, Vedbaek, Denmark) microarray that consist of 454 capture probes for human, mouse and rat miRNAs. The result revealed differential expression of 59 miRNAs, of which 31 and 28 miRNAs were found to be preferentially expressed in immature and matured oocytes, respectively. Here, 32 new bovine orthologous miRNAs were identified using a heterologous approach. Furthermore, the preliminary attempt to dissect the specific function of miR-99a and miR-100 in invitro cumulus cell showed that both miRNAs down regulate bovine tribbles homologue 2 (TRB2). On the other hand, genome wide RT2 miRNA PCR array consisting of 354 well characterized human miRNA primers was used to analyze miRNA expression in the uterine cytobrush samples taken from cows with subclinical endometritis and healthy. The result showed the aberrant expression of 23 miRNAs in cows with subclinical endometritis as compared to the healthy ones. Interestingly, the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for high ranking target genes of aberrantly expressed miRNAs identified gene networks, canonical pathways and biological functions that converged to array of signaling pathways and cellular activities inherent to the endometrium during estrous cycle and pregnancy. Furthermore, the luciferase assay data substantiated the primary information from bioinformatic prediction and enabled us to deduce a convincing link between the aberrantly expressed miRNAs and target genes. Taken together, identification and dynamic expression pattern of certain class of miRNAs during bovine oocyte maturation suggests their potential involvement in early embryo development; where as, aberrant expression of uterine miRNAs in animals with subclinical endometritis potentially interfere with the tight uterine gene regulation.Bovines microRNomics: Bedeutung während der Eizellreifung und die Pathophysiologie des Endometriums MikroRNAs (miRNAs), die bereits für die Regulierung von posttranskriptionalen Genen bekannt sind, konnte eine essentielle Rolle für die Entwicklung von Tieren und Krankheiten nachgewiesen werden. In dieser Studie wurden bovine miRNAs während der Eizellenreifung identifiziert und mittels verschiedener Methoden das Expressionsprofil untersucht. miRNAs, die eine neuartigen molekulare Signatur auf Grundlage einer subklinischen Endometritis zeigten wurden mit Hilfe eines integrativen Untersuchungsansatzes erforscht. Zuerst wurde die Identifikation und die Erstellung von Expressionsprofilen von miRNAs während der bovinen Eizellenreifung mittels des „miRCURYTM locked nucleic acids (LNA) array“ (Exiqon, Vedbeak, Denmark) durchgeführt. Dieser Microarray besteht aus 454 bekannten Sonden von Mensch, Maus und Ratten miRNAs. Die Ergebnisse zeigten 59 unterschiedlich exprimierte miRNAs, von denen 31 hauptsächlich in unreifen und 28 in reifen Eizellen überexprimiert wurden. Hierbei wurden mit verschiedenen Ansätzen 32 neue orthologe bovine miRNAs identifiziert. Des Weiteren wurden erste Versuche durchgeführt, um die spezifischen Funktionen von miR-99a und miR-100 innerhalb eines „in-vitro“ Kumuluszellen Modells zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass miR-99a und miR-100 die Expression des bovinen tribbles homologue 2 Gens (TRB2) runter regulieren. Zum Anderen wurde mittels eines genomweitem RT2 miRNA PCR Arrays, bestehend aus 354 gut beschriebenen humanen miRNA Primern, an uterinen Cytobrush-Proben von Kühen die entweder an subklinischer Endometritis erkrankt oder gesund waren, Expressionsanalysen durchgeführt. Das Ergebnis dieses Versuches zeigte abweichende Expressionen von 23 miRNAs in Geweben von Kühen mit subklinischer Endometritis im Vergleich zu den gesunden Tieren. Interessanterweise konvergieren die mittels der Igenuity Pathway Analyse(IPA), identifizierten Gennetzwerke, bekannten Pathways sowie biologische Funktionen mit den Signalwegen und zellulären Aktivitäten innerhalb des Endometriums während des Östruszyklus und der Trächtigkeit. Des Weiteren bestätigte der Luziferase Assay die vorangegangenen Informationen der bioinformatischen Auswertung und ermöglichte uns einen schlüssigen Zusammenhang zwischen der veränderten miRNA Expression und den Zielgenen abzuleiten. Zusammengefasst, zeigt die Identifikation sowie das dynamischen Expressionsmuster der bestimmten Klasse von miRNAs während der bovinen Eizellreifung ihren potentiellen Einfluss auf die frühe Embryonalentwicklung; wohingegen die unterschiedliche Expression der uterinen miRNAs bei Tieren mit subklinischer Endometritis möglicherweise die uterine Genregulation beeinträchtigt