Cyanobacteria in motion

This work was supported by a grant from the DFG (WI 2014/7-1) to A.W

Transformation of the filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna: Electroporation versus Natural Transformation

Der Großteil der aktuellen, auf Kohlenstoff basierenden Waren wird entweder aus pflanzlichen Rohstoffen oder aus Erdöl gewonnen. Die damit verbundene Nachfrage nach Ressourcen steigt auf Grund der wachsenden Erdbevölkerung und den allgemeinen Bestrebungen zur Verbesserung des Lebensstandards. Im Gegensatz dazu sind die Verfügbarkeit von Agrarflächen und fossilen Energiereserven begrenzt. Außerdem wird der Anstieg von CO2 in der Atmosphäre seit dem Beginn der industriellen Revolution im 19. Jahrhundert als Hauptbeitrag des Menschen zur globalen Erwärmung angesehen. Es gibt einige Strategien um die Abhängigkeit von fossilen Kohlenstoffquellen zu reduzieren, wie etwa die Entwicklung von regenerativen Energien oder erhöhte Energieeffizienz. Der Einsatz von Cyanobakterien in der Biotechnologie ist eine weitere Strategie, die das Potential besitzt Landwirtschaft und Erdölindustrie als Quelle für kohlenstoffbasierte Produkte zu ersetzen. Produkte, die sich von Cyanobakterien oder Pflanzen ableiten, führen nicht zur Erhöhung des CO2 Gehalts in der Atmosphäre. Im Vergleich zu Landpflanzen ist die Kultivierung von Cyanobakterien nicht abhängig von fruchtbarem Land und viele Arten der Cyanobakterien weisen höhere Wachstumsraten als Pflanzen auf. Außerdem sind einige Cyanobakterien genetisch manipulierbar, wodurch die Synthese natürlicher Produkte verstärkt werden kann oder die rekombinante Produktion von neuen Stoffen möglich ist. Die mögliche Produktpalette reicht von preiswerten Verbindungen, wie Biokraftstoffen, bis hin zu hochwertigen Produkten, wie pharmazeutischen Wirkstoffen. Auch wenn es im Bereich der rekombinanten Biotechnologie mit Cyanobakterien schon kommerzielle Anwendung gibt, befindet sich das gesamte Feld dennoch in seinen Kinderschuhen. Während im Bereich der metabolischen Optimierung, der molekularen Werkzeuge und der Bioreaktorentwicklung in den letzten Jahren und Jahrzehnten deutliche Fortschritte gemacht wurden, ist die Etablierung von neuen Organismen nach wie vor eine Herausforderung. Die Forschung konzentriert sich größtenteils auf wenige, leicht transformierbare Modelorganismen der Ordnungen Synechococcales und Nostocales, da die Etablierung von Transformationsprotokollen für neue Stämme und Arten oft eine Herausforderung darstellt. Allerdings wird die rekombinante Biotechnologie mit Cyanobakterien ohne ein breites Spektrum an nutzbaren Stämmen möglicherweise hinter ihrem Potential zurück bleiben, da vorteilhafte Eigenschaften von vielversprechenden Kandidaten nicht genutzt werden können. Diese Arbeit setzt sich mit der beschriebenen Limitierung auseinander, indem ein verlässliches und effizientes Transformationsprotokoll für Phormidium lacuna etabliert wurde. Diese Art wurde kürzlich von unserer Arbeitsgruppe als vielversprechend für die cyanobakterielle Biotechnologie charakterisiert. Da die Gattung Phormidium bislang noch nicht für genetische Manipulation zugänglich war, war es das Ziel dieser Arbeit ein Transformationsprotokoll zu entwickeln und das Potential für die Biotechnologie an Hand der rekombinanten Ethanolsynthese zu charakterisieren. Die rekombinante Produktion von Ethanol ist gut charakterisiert innerhalb der cyanobakteriellen Biotechnologie und ermöglicht den Vergleich mit anderen Cyanobakterien hinsichtlich Produktivität. VII Bei der Etablierung eines Protokolls zur Elektroporation wurde deutlich, dass Phormidium lacuna natürlich transformierbar ist. Natürliche Transformation ist bislang nur für wenige Stämme der Cyanobakterien beschrieben und dies ist der erste Bericht für die Ordnung Oscillatoriales. Natürliche Transformation erlaubt verlässlichen und effizienten Gentransfer mittels homologer Rekombination in Phormidium lacuna. Die Integration des Selektionsmarkers kanR ins Genom von Phormidium lacuna vermittelt eine deutliche Resistenz gegenüber Kanamycin (bis zu 14,3 mg/ml). Die kanR Sequenz verteilt sich sehr schnell in allen Genomkopien: Nach zwei Kulturzyklen nach der ersten Kultivierung der entsprechenden Transformanten war die kanR Sequenz in allen Genomkopien einer Zelle vorhanden. Phormidium lacuna Transformaten für die rekombinante Ethanolproduktion wurden generiert indem die codierenden Sequenzen für die Enzyme Pyruvatdecarboxylase und Alkoholdehydrogenase ins Genom integriert wurden. Die Ethanolproduktion wurde über die Ethanolkonzentration im Kulturüberstand mittels Gaschromatographie nachgewiesen. Allerdings konnte keine erhöhte Ethanolproduktion von Transformanten im Vergleich zum Wildtyp von Phormidium lacuna nachgewiesen werden. Mögliche Gründe hierfür und geeignete Schritte in Richtung einer biotechnologischen Anwendung von Phormidium lacuna wurden diskutiert. Der unerwartete Fund der natürlichen Transformation für Phormidium lacuna ist möglicherweise ein Hinweis darauf, dass die Fähigkeit zu natürlicher Transformation weiter unter den Cyanobakterien verbreitet ist, als bislang angenommen wurde. Um diese Fragestellung zu adressieren wurden der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit und die weiteren Beispiele, die in der Literatur beschrieben sind, mit den Cyanobakterien im Allgemeinen verglichen. Basierend auf der Homologie zu Proteinen, die an der natürlichen Transformation beteiligt sind, wurden cyanobakterielle Stämme vorgeschlagen, die potentiell transformierbar sind. Der Fund der natürlichen Transformation in dieser Arbeit hat viele Implikationen. Erstens: Phormidium lacuna ist nun effizient natürlich transformierbar, was eine essentielle Voraussetzung für die weiteren Arbeitsschritte mit diesem Organismus in Bereich der rekombinanten Biotechnologie darstellt. Zweitens: Da Phormidium lacuna leicht transformierbar ist und homozygote Transformanten in kurzer Zeit generiert werden können, bietet sich dieses Bakterium als vielversprechender Modellorganismus der filamentösen Cyanobakterien ohne Heterocysten an. Drittens: Der Fund von natürlicher Transformation in einer neuen Ordnung der Cyanobakterien weiß vermutlich daraufhin, dass natürliche Kompetenz eine weit verbreitete Eigenschaft innerhalb der Cyanobakterien ist und dass möglicherweise deutlich mehr Stämme zugängliche für rekombinante Biotechnologie sind

Cyanophycin: A Nitrogen-Rich Reserve Polymer

Cyanophycin is a nitrogen/carbon reserve polymer present in most cyanobacteria as well as in a few heterotrophic bacteria. It is a non-ribosomally synthesized polyamide consisting of aspartate and arginine (multi-l-arginyl-poly-l-aspartic acid). The following chapter provides an overview of the characteristics and occurrence of cyanophycin in cyanobacteria. Information about the enzymes involved in cyanophycin metabolism and the regulation of cyanophycin accumulation is also summarized. Herein, we focus on the main regulator, the PII signal transduction protein and its regulation of arginine biosynthesis. Since cyanophycin could be used in various medical or industrial applications, it is of high biotechnological interest. In the last few years, many studies were published aiming at the large-scale production of cyanophycin in different heterotrophic bacteria, yeasts and plants. Recently, a cyanobacterial production strain has been reported, which shows the highest so ever reported cyanophycin yield. The potential and possibilities of biotechnological cyanophycin production will be reviewed in this chapter

Cyanobacterial Acclimation to Changing Environmental Conditions - Roles for Group 2 Sigma Factors in Synechocystis sp. PCC 6803

Siirretty Doriast

Metabolic engineering strategies for an increased PHB production in cyanobacteria

Cyanobakterien repräsentieren einen der ältesten bakteriellen Phyla der Welt. Aufgrund ihrer globalen Verbreitung besitzen sie einen starken Einfluss auf globale Kohlenstoff- und Stickstoffkreisläufe. Trotz dieser großen Relevanz sind viele Aspekte ihres Metabolismus bislang schlecht erforscht. Ein Beispiel dafür ist Polyhydroxybutyrat (PHB), welches in vielen Cyanobakterien (auch dem Modelorganismus Synechocystis sp. PCC 6803) gebildet wird. Dieses intrazelluläre Polymer wird vornehmlich unter Stickstoffmangel synthetisiert, während Synechocystis in einen Überdauerungszustand namens Chlorose übergeht. Bislang sind die physiologische Relevanz von PHB sowie Einflussfaktoren auf dessen Biosynthese größtenteils unbekannt. In der vorliegenden Arbeit werden all diese Fragen adressiert und umfassend diskutiert. Um die physiologische Funktion des PHB zu erforschen wurde ein Synechocystis Wildtyp mit einer PHB-freien Mutante verglichen. Wir konnten zeigen, dass, im Gegensatz zu anderen Bakterien, PHB nicht als Kohlenstoffspeicher genutzt wird, und darüber hinaus keine Relevanz während der Recovery aus der Chlorose besitzt. Wichtige Faktoren für die PHB-Biosynthese sind sowohl die Beleuchtung als auch der Gasaustausch, wobei bei Tag/Nacht-Rhythmus (im Vergleich zu Dauerlicht), sowie bei hohem Gasaustausch mehr PHB gebildet wird. Interessanterweise wird PHB während der Recovery aus der Chlorose nicht abgebaut, sondern lediglich in kleinere Granula zerteilt und auf Tochterzellen verteilt. In anderen Organismen sind viele verschiedene Proteine am PHB-Metabolismus beteiligt, etwa während der Bildung, der Instandhaltung oder der Degradation der PHB Granula. In dieser Arbeit wurden mehrere Proteine untersucht, die einen Einfluss auf den PHB Stoffwechsel haben könnten. Dabei wurde ein neuer Regulator entdeckt, Slr0058, welcher die Anzahl und Größe von PHB-Granula beeinflusst. Bei der Untersuchung verschiedener Kohlenstoffwege stellte sich heraus, dass der Embden Meyerhof Parnas Weg der wichtigste für die PHB Bildung ist. Um den intrazellulären Ursprung des PHB zu ermitteln wurde verschiedene Knock-Out Mutanten untersucht, wie sich die PHB Biosynthese durch die Mutation ändert. Dabei zeigte sich, dass eine Beeinträchtigung des Glykogen-Stoffwechsels sich negativ auf die PHB Bildung auswirkt, was auf eine Verknüpfung beider Polymere hindeutet. Dieser Stofffluss wird durch einen neu entdeckten Regulator, Slr0944, gesteuert. Dieser Regulator ist besonders abundant während der Chlorose, wo er die Phosphoglycerat-Mutase inhibiert und dadurch den Kohlenstofffluss reguliert. Aufgrund der ähnlichen Materialeigenschaften zu Polypropylen wird PHB häufig als eine biobasierte und biologisch abbaubare Alternative angesehen, was von großer biotechnologischer Relevanz ist. Die Eigenschaft einer Δsll0944 Mutante, während der Chlorose vermehrt Glykogen abzubauen, wurde genutzt, um einen PHB Überproduktionsstamm zu erzeugen. Dazu wurden in einem Δsll0944 Stamm PHB-Biosynthese-Gene überexprimiert, wodurch der höchste jemals gemessen PHB Gehalt in einem phototrophen Organismus erzeugt wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern unser Verständnis vom PHB Metabolismus in Synechocystis und legen somit die Grundlage für eine nachhaltige, CO2-neutrale PHB Produktion.Cyanobacteria constitute one of Earth’s oldest and most diverse bacterial phyla. Due to their expansion all around the globe they are strongly influencing global carbon and nitrogen cycles. Although cyanobacteria are so important for the maintenance of these global cycles, many aspects of their metabolism are still poorly understood. One example is the metabolism of polyhydroxybutyrate (PHB), which is produced in many cyanobacteria like the model organism Synechocystis sp. PCC 6803. This intracellular biopolymer is mainly produced under conditions of nitrogen starvation when Synechocystis undergoes a transformation into a resting state termed chlorosis. However, the physiological function of PHB as well as corresponding factors influencing its biosynthesis are mostly unknown. In the present work, all these questions were investigated and comprehensively discussed. To investigate the physiological function of PHB, a Synechocystis wildtype was compared to a PHBfree mutant strain. We could show that in Synechocystis, unlike in other bacteria, PHB is not used as a carbon storage and is furthermore not required for resuscitation from chlorosis. Factors influencing the formation of PHB are the aeration as well as the illumination regime, with more PHB being formed during day/night rhythm (compared to continuous light) and with high gas exchange in the culture. Interestingly, we could show that PHB is not degraded after resuscitation but is instead only disaggregated to smaller granules and distributed among dividing cells. In other organisms, a variety of different proteins are involved in the PHB metabolism, including the formation, the maintenance as well as the degradation of the PHB granules. In this work we investigated several proteins, which are putatively involved in the PHB metabolism and discovered the novel regulator Slr0058, which is affecting the number and size of PHB granules. Different carbon pathways were analyzed for their impact on the PHB production, where the Embden Meyerhof Parnas pathway turned out to be the most important one. To analyze, where the carbon required for the formation of PHB is derived from, several knockout strains were analyzed for their ability to produce PHB. Whenever glycogen metabolism was disturbed, it negatively influenced the accumulation of PHB, indicating a direct link between both carbon-polymers. The carbon flux between both polymers was shown to be influenced by the protein Sll0944. This regulator is highly upregulated during chlorosis and inhibits the phosphoglycerate mutase, whereby it regulates the glycogen catabolism. Since PHB exhibits similar material properties to polypropylene, PHB is often considered as a biobased and biodegradable plastic substitute, which is of high biotechnological interest. The ability of a Δsll0944 mutant strain to rapidly degrade glycogen was exploited to create a PHB overproduction strain. To achieve this, PHB biosynthesis genes were overexpressed in a Δsll0944 background to create the strain PPT1, which produced the highest rates of PHB ever achieved in a phototrophic bacterium. The results generated in this work deepen the understanding of the PHB metabolism in Synechocystis and lay the foundation for a sustainable, carbon neutral production of PHB

Cryo-EM structure of a functional monomeric Photosystem I from Thermosynechococcus elongatus reveals red chlorophyll cluster

A high-resolution structure of trimeric cyanobacterial Photosystem I (PSI) from Thermosynechococcus elongatus was reported as the first atomic model of PSI almost 20 years ago. However, the monomeric PSI structure has not yet been reported despite long-standing interest in its structure and extensive spectroscopic characterization of the loss of red chlorophylls upon monomerization. Here, we describe the structure of monomeric PSI from Thermosynechococcus elongatus BP-1. Comparison with the trimer structure gave detailed insights into monomerization-induced changes in both the central trimerization domain and the peripheral regions of the complex. Monomerization-induced loss of red chlorophylls is assigned to a cluster of chlorophylls adjacent to PsaX. Based on our findings, we propose a role of PsaX in the stabilization of red chlorophylls and that lipids of the surrounding membrane present a major source of thermal energy for uphill excitation energy transfer from red chlorophylls to P700

Hydrocarbons Are Essential for Optimal Cell Size, Division, and Growth of Cyanobacteria.

Cyanobacteria are intricately organized, incorporating an array of internal thylakoid membranes, the site of photosynthesis, into cells no larger than other bacteria. They also synthesize C15-C19 alkanes and alkenes, which results in substantial production of hydrocarbons in the environment. All sequenced cyanobacteria encode hydrocarbon biosynthesis pathways, suggesting an important, undefined physiological role for these compounds. Here, we demonstrate that hydrocarbon-deficient mutants of $\textit{Synechocystis }$ sp. PCC 7002 and $\textit{Synechocystis }$ sp. PCC 6803 exhibit significant phenotypic differences from wild type, including enlarged cell size, reduced growth, and increased division defects. Photosynthetic rates were similar between strains, although a minor reduction in energy transfer between the soluble light harvesting phycobilisome complex and membrane-bound photosystems was observed. Hydrocarbons were shown to accumulate in thylakoid and cytoplasmic membranes. Modeling of membranes suggests these compounds aggregate in the center of the lipid bilayer, potentially promoting membrane flexibility and facilitating curvature. In vivo measurements confirmed that $\textit{Synechocystis }$ sp. PCC 7002 mutants lacking hydrocarbons exhibit reduced thylakoid membrane curvature compared to wild type. We propose that hydrocarbons may have a role in inducing the flexibility in membranes required for optimal cell division, size, and growth, and efficient association of soluble and membrane bound proteins. The recent identification of C15-C17 alkanes and alkenes in microalgal species suggests hydrocarbons may serve a similar function in a broad range of photosynthetic organisms.T.L. was supported by BBSRC Research Grant BB/J016985/1 to C.W.M. D.J.L-S. was supported by the Environmental Services Association Education Trust. L.L.B was supported by a BBSRC Doctoral Training Grant (BB/F017464/1)