Genome Mining Actinobacteria: Eliciting the Production of Natural Products

Antimicrobial resistance is an imminent threat that is expected to kill 10 million people per year by 2050. Natural products have been a major source of antimicrobial compounds and encompass a chemical space far greater than synthetic chemistry can provide and have evolved over the ages to have biological activities. The natural products produced by Streptomyces have provided us with two-thirds of the antibiotics currently used, as well as chemotherapeutics, antifungals, and immunosuppressants. In recent years, the drug discovery pipeline from Streptomyces has run dry, largely because laboratory culture conditions lack their natural stimuli, resulting in the rediscovery of the same natural products. However, with the advent of modern genomics, we now realize that the genomes of Streptomyces have the have a greater capacity for natural product production than what we have observed, which providing us with the hope of new drug leads. My doctoral research focused on two aims. First is the concept of eliciting Streptomyces to produce novel natural products; in other words, what triggers the production of natural products. Additional perspectives from ecology, evolution, and regulation evoked the idea that microbe-microbe interactions could be the key. Microscopic observations of the interactions between Streptomyces and yeast suggested that physical contact is essential for elicitation. Genomics, transcriptomics, and proteomics showed that 31% of the silent biosynthetic gene clusters are activated, notably an antifungal polyene cluster, as well as a suite of enzymes capable of digesting the cell wall of yeast. Arguably, Streptomyces can prey on yeast. The differential regulation of a homologous polyene gene clusters further suggested that natural product production is triggered by different ecological needs. Second, genome mining provides insight into the genetic potential of Actinobacteria to produce natural products via the identification of their gene clusters and is a proven method that aids in drug discovery. Here, I sequenced the genome of a rare Streptomonospora isolate and identified the novel persiamycin gene cluster and its associated product. Moreover, genome mining was applied to publicly available Streptomyces genomes, which resulted in the identification of two new gene clusters that produce the antibiotic komodoquinone B. KEYWORDS: Streptomyces, Actinobacteria, secondary metabolism, natural products, genome miningMikrobilääkeresistenssi on välitön uhka, joka uhkaa tappaa vuosittain 10 miljoonaa ihmistä vuoteen 2050 mennessä. Luonnontuotteet ovat olleet merkittävä mikrobilääkkeiden lähde. Lisäksi luonnontuotteet kattavat paljon laajemman kemiallisen alueen kuin synteettinen kemia voi tarjota, ja ne ovat aikojen kuluessa kehittyneet niin, että niillä on biologisia vaikutuksia. Streptomykeetti-organismin tuottamat luonnontuotteet ovat tuottaneet kaksi kolmasosaa käytössä olevista antibiooteista sekä kemoterapeuttisia aineita, sienilääkkeitä, immunosuppressantteja ja matolääkkeitä. Viime vuosina Streptomykeetti-bakteerin lääkkeiden kehittämiskanava on kuitenkin kuivunut. Nykyaikaisen genomiikan myötä olemme kuitenkin nyt ymmärtäneet, että Streptomykeeteillä on potentiaalia tuottaa vielä löytämättömiä luonnontuotteita, jotka antavat meille toivoa uusista lääkkeistä, erityisesti antibiooteista. Väitöstutkimuksellani oli kaksi tavoitetta. Ensimmäinen tarkoitus oli saada Streptomykeetit tuottamaan uusia luonnontuotteita; toisin sanoen tutkia sitä, mikä saa Streptomykeetin tuottamaan luonnontuotteita. Ekologian, evoluution ja säätelyn lisänäkökulmat herättivät ajatuksen, että mikrobien väliset vuorovaikutus voisivat olla avainasemassa. Mikroskooppiset havainnot Streptomykeetin ja hiivan välisestä vuorovaikutuksesta osoittivat, että fyysinen kontakti oli välttämätön yhdisteiden tuoton aktivoinnissa. Genomiikka, transkriptomiikka ja proteomiikka osoittivat, että jopa 31 prosenttia hiljaisista biosynteettisistä geeniryhmistä aktivoitui, samoin kuin joukko entsyymejä, jotka kykenevät pilkkomaan hiivan soluseinää. Tämä osoitti, että Streptomykeetit pystyvät saalistamaan hiivasoluja. Homologisten geeniryhmien erilainen säätely viittaa lisäksi siihen, että luonnontuotteiden tuotanto perustuu erilaisiin ekologisiin tarpeisiin. Toisena tavoitteena oli käyttää genomien louhintaa selvittääksemme Streptomykeetin geneettisestä potentiaalista tuottaa luonnontuotteita. Tässä työssä selvitimme harvinaisen Streptomonaspora bakteerin genomin ja tunnistin uuden persiamysiini-yhdisteen biosynteesireitin. Tämän lisäksi löysimme genomin louhinnan avulla kaksi uutta biosynteettistä geeniryhmää julkisista tietokannoista, joiden osoitimme olevan vastuussa komodokinoni B antibiootin tuotannosta. ASIASANAT: Streptomykeetit, Aktinobakteerit, sekundaarinen aineenvaihdunta, luonnonyhdisteet, genomin louhint

Metabolic pathway engineering of actinomycetes for novel antibiotics discovery

Microbes harbouring a profound wealth of chemical space have instigated tremendous attention for developing crucial therapeutic drugs. The genes encoding the enzymes responsible for synthesizing these specialized metabolites are often organized in so-called biosynthetic gene clusters (BGCs). While these clusters are potentially capable of producing novel drug candidate, most of them remain dormant in natural environmental conditions (or settings). Microorganisms seldom synthesize substantial quantities of the desired molecules in natural settings. Harnessing the dormant compound production requires careful optimization of the host cellular machinery, which can be accomplished by thorough engineering of silent biosynthetic pathways. My target, the genus Streptomyces is endowed with tremendous abilities to secrete a diverse array of metabolites. Besides, insilico analysis of their genomic sequences reveals enormous potential to generate novel metabolites not biosynthesized in natural environmental settings. Realizing such bountiful resources, I attempt to unveil Streptomyces’ true potential to generate novel metabolites by using various approaches. In the present dissertation, various novel approaches have allowed me to unveil novel specialized metabolites encoded by otherwise silent biosynthetic clusters. For this, (i) I developed single cell mutant selection (SCMS) platform, where mutants harboring a silent promoter are probed with a double reporter system using classical mutagenesis techniques. Mutants were sorted using FACS based on expression of reporter genes and mutants generated a novel metabolite with a distinct chemical scaffold, referred to as mutaxanthene. (ii) Next approach involved binary physical interaction studies between dead yeast and Streptomyces where the contact induced production of prodigiosin. My studies identified a master-regulator, namely mbkZ, for its regulatory roles in prodigiosin production in different hosts (S. coelicolor and Streptomyces sp. MBK6). (iii) Third approach exploited CRISPR/Cas9 system to unveil the functional role of sdmA within the showdomycin biosynthetic pathway. (iv) Final approach revealed the characterization of new bacterial lineage (Streptomonospora sp. PA3) isolated from the high-salt environment, which helped me to isolate and identify a novel polyketide persiamycin A. Using these different approaches allowed me to unveil the secret knowledge sealed within biosynthetic pathways of the studied organisms. In a nutshell, adopting these techniques has helped me discover and characterize novel metabolites. I believe these strategies may aid in the fight against antimicrobial resistance and speed up the drug discovery process. Furthermore, this dissertation has not only implications for future engineering of Streptomyces to increase metabolites production, but it also illustrates a SCMS state-of-art approach for generating novel therapeutic leads.Aktinomykeettien aineenvaihduntareittien muokkaus uusien antibioottien löytämiseksi Mikrobien tuottamat monimuotoiset luonnonyhdisteet ovat herättäneet suurta kiinnostusta lääkekehityksessä. Näiden erikoistuneiden metaboliittien tuotannosta vastaavia entsyymejä koodaavat geenit ovat yleensä järjestyneet niin sanottuiksi biosynteettisiksi geeniryppäiksi (BGC, engl. biosynthetic gene cluster). Nämä geeniryppäät saattavat tuottaa vielä tuntemattomia metaboliitteja, mutta yleensä ne ovat hiljaisia luonnollisessa ympäristössä. Yleensä mikro-organismit eivät tuota haluttua yhdistettä merkittäviä määriä luonnollisissa olosuhteissa. Näiden hiljaisten yhdisteiden hyödyntäminen lääkeaineiden kehityksessä vaatii solukoneiston huolellista optimointia, mikä voidaan saavuttaa muokkaamalla hiljaisia biosynteesireittejä. Kohdeorganismimme Streptomyces -bakteerit kykenevät tuottamaan lukuisia erilaisia sekundäärimetaboliitteja, jotka ovat kemialliselta rakenteeltaan erittäin vaihtelevia. Tämän lisäksi genomisekvenssien analyysi on paljastanut lukuisia lupaavia hiljaisia geeniklustereita, jotka saattaisivat aktivoituina tuottaa aikaisemmin tuntemattomia yhdisteitä. Tämän työn tarkoitus on käyttää useita erilaisia tekniikoita tämän hiljaisen biosynteettisen potentiaalin valjastamiseen. Väitöskirjatyössä käytin useita uusia menetelmiä hiljaisten geeniryppäiden koodaamien uusien yhdisteiden tuottamiseksi. Tätä tarkoitusta varten (i) kehitin yksisolujen mutanttivalinta (SCMS, engl. single cell mutant selection) alusta – menetelmän, missä hiljaisen geeniryppään aktiivisuutta seurataan tuplareportterisysteemillä. Seuloin menetelmällä mutanttikirjastoja reportterigeenien ilmenemisen perusteella FACS –laitteistoilla ja tuotin erityisen kemiallisen rakenteen omaavia mutaxanthene -yhdisteitä. (ii) Seuraavaksi tutkin hiivojen ja streptomykeettien fyysisen vuorovaikutuksen vaikutusta prodigiosiini –yhdisteen tuottoon. Tutkimukseni paljasti säätelygeeni mbkZ:n roolin prodigiosiinien tuotossa kahdessa eri isäntäkannassa (S. coelicolor ja Streptomyces sp. MBK6). iii) Kolmannessa menetelmässä käytin CRISPR/Cas9-menetelmää selvittääkseni sdmA geenin roolin showdomysiinin biosynteesireitillä. iv) Viimeisenä menetelmänä eristin uuden halofiilisen bakteerikannan (Streptomonospora sp. PA3) korkean suolapitoisuuden kasvuympäristöstä meren pohjasta. Kannasta eristettiin uusi persiamysiini A polyketidi. Näiden erilaisten lähestymistapojen avulla pystyin paljastamaan tutkittujen organismien biosynteettisten reittien sisälle suljetut salaisuudet. Lyhyesti, olemme pystyneet löytämään ja karakterisoimaan uusia metaboliitteja käyttämiemme tekniikoiden avulla. Uskomme, että käyttämämme strategiat auttavat kamppailuissa antibioottiresistenssiä vastaan ja nopeuttamaan uusien lääkkeiden löytämistä. Tämän lisäksi tutkielman tulokset sekä auttavat sekundaarimetabolliittien tuotannon tehostamista tulevaisuudessa streptomykeettejä muokkaamalla, että havainnollistaa SCMS –menetelmän käyttökelpoisuuden uusien terapeuttisten yhdisteiden tuotossa

Microbial Virulence Factors

Microbial virulence factors encompass a wide range of molecules produced by pathogenic microorganisms, enhancing their ability to evade their host defenses and cause disease. This broad definition comprises secreted products such as toxins, enzymes, exopolysaccharides, as well as cell surface structures such as capsules, lipopolysaccharides, glyco- and lipoproteins. Intracellular changes in metabolic regulatory networks, governed by protein sensors/regulators and non-coding regulatory RNAs, are also known to contribute to virulence. Furthermore, some secreted microbial products have the ability to enter the host cell and manipulate their machinery, contributing to the success of the infection. The knowledge, at the molecular level, of the biology of microbial pathogens and their virulence factors is central in the development of novel therapeutic molecules and strategies to combat microbial infections. The present collection comprises state of the art research and review papers on virulence factors and mechanisms of a wide range of bacterial and fungal pathogens for humans, animals, and plants, thus reflecting the impact of microorganisms in health and economic human activities, and the importance of the topic

Antimicrobial potential of Clostridium and closely related species derived from farm environmental samples : a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Food Technology at Massey University, Manawatū, New Zealand

The exploration of antimicrobial compounds from natural sources such as bacteria, has been fast tracked by the development of antimicrobial resistance to existing antimicrobials and the increasing consumer demand for natural food preservatives. So far, antimicrobial discovery has been biased towards aerobic and facultative anaerobic bacteria and fungi. Strict anaerobes such as Clostridium species have not been thoroughly investigated for their antimicrobial potential. The objective of the current study was to evaluate the antimicrobial potential of Clostridium and closely related species against bacteria associated with food spoilage, food safety, and human health. Tests on culture media inoculated with Clostridium and closely related species from farm samples (conditioned media/CMs) showed various degrees of antimicrobial activity. Farm 4 soil conditioned medium (F4SCM) showed potential for further investigation in the search for potent antimicrobials with its promising antimicrobial activity. Bacterial isolates (FS01, FS2.2, FS03, and FS04) belonging to Clostridium and closely related spp. associated with F4SCM showed antimicrobial potential as evident by culture-based and genome-based methods. F4SCM and FS03CM (CM prepared from FS03) metabolomes showed the presence of several putative antimicrobial metabolites. Among them, 2-hydroxyisocaproic acid (HICA) showed antimicrobial activity against a wide range of bacteria associated with food spoilage and safety indicating its potential as a bio-preservative agent in food products. The cell cytoplasmic membrane is a likely target of the HICA’s antimicrobial activity. Overall, this study demonstrates that anaerobic bacterial species, Clostridium, and closely related species can produce antimicrobial metabolites, that have potential applications in food preservation and human health. The knowledge obtained in this study will help future investigations to identify and characterize antimicrobials from these Clostridium and closely related bacteria and expands the understanding of the potential to produce antimicrobial compounds from the genus Clostridium and closely related species

Metabolome-based studies of virulence factors in Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen and an important causative agent of potentially life-threatening nosocomial infections in predisposed patients. The Gram-negative bacterium produces a large and diverse repertoire of small-molecule secondary metabolites that serve as regulators and effectors of its virulence. In this study, a range of mass spectrometry-based bacterial metabolomics approaches was used to investigate these small-molecule virulence factors and their interplay with pseudomonal metabolism as well as with phenotypic traits related to virulence. The groundwork was laid by exploring the metabolite inventory of P. aeruginosa and improving the coverage of its metabolome by the application of a custom software named CluMSID, that clusters analytes based on similarities of their MS² spectra. CluMSID led to the annotation of, i.a., 27 novel members of the class of alkylquinolone quorum sensing signalling molecules, which represent crucial players in the highly complex network that regulates pseudomonal virulence. The tool was developed towards a versatile and user-friendly R package hosted on Bioconductor, whose functionalities and benefits are described in detail. The new findings on the alkylquinolone chemodiversity led to further studies with a mechanistic focus that probed the substrate specificity of the enzyme complex PqsBC. It was demonstrated that PqsBC accepts different medium-chain acyl-coenzyme A substrates for the condensation with 2-aminobenzoylacetate and thereby produces alkylquinolones with various side chain lengths, whose distribution is a function of substrate specificity and substrate availability. Moreover, it was shown that PqsBC also synthesises alkylquinolones with unsaturated side chains. The focus was further broadened from metabolite and pathway-centred questions to a more global perspective on pseudomonal virulence and metabolism, which directed attention at PrmC, an enzyme with a partially unknown function indispensable for in vivo virulence. An untargeted metabolomics experiment yielded insights into the role of PrmC and its influence on the pseudomonal endo- and exometabolome. Finally, clinical P. aeruginosa strains with different virulence phenotypes were examined by untargeted metabolomics in order to disclose metabolic variation and interconnections between virulence and metabolism. The analysis resulted in the discovery of a putative virulence biomarker and enabled the construction of a random forest classification model for certain virulence phenotypes based only on metabolomics data. In summary, this study demonstrated the potential of metabolomics for the investigation of P. aeruginosa virulence factors and thereby contributed towards the comprehension of the complex interplay of metabolism and virulence in this important pathogen.Pseudomonas aeruginosa ist ein wichtiger opportunistischer Erreger potenziell lebensbedrohlicher nosokomialer Infektionen bei prädisponierten Patienten. Das Gram-negative Bakterium produziert ein vielfältiges Repertoire an niedermolekularen Sekundärmetaboliten, die als Regulatoren und Effektoren seiner Virulenz dienen. In dieser Studie wurde eine Reihe von Massenspektrometrie-basierten Ansätzen der bakteriellen Metabolomik verwendet, um diese niedermolekularen Virulenzfaktoren und ihre Wechselwirkungen mit dem pseudomonalen Metabolismus sowie mit virulenzassoziierten phänotypischen Merkmalen zu untersuchen. Die Grundlage bilden die Untersuchung des Metaboliteninventars von P. aeruginosa und die Verbesserung der analytischen Abdeckung des Metaboloms durch die Anwendung einer selbstentwickelten Software namens CluMSID, die MS²-Spektren nach Ähnlichkeit clustert. CluMSID führte zur Annotation von u.a. 27 neuen Mitgliedern der Klasse der Alkylchinolone, die als Quorum-Sensing-Signalmoleküle entscheidende Akteure im hochkomplexen Netzwerk der Virulenzregulation darstellen. Das Tool wurde zu einem R-Paket entwickelt, das auf Bioconductor verfügbar ist und dessen Funktionalitäten und Vorteile ausführlich beschrieben werden. Die neuen Erkenntnisse über die Chemodiversität der Alkylchinolone führten zu weiteren Studien mit mechanistischem Schwerpunkt, die die Substratspezifität des Enzymkomplexes PqsBC untersuchten. Es wurde nachgewiesen, dass PqsBC verschiedene mittelkettige Acyl-Coenzym-A-Substrate für die Kondensation mit 2-Aminobenzoylacetat akzeptiert und dadurch Alkylchinolone mit verschiedenen Seitenkettenlängen produziert, deren Verteilung eine Funktion der Substratspezifität und der Substratverfügbarkeit ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass PqsBC auch Alkylchinolone mit ungesättigten Seitenketten synthetisiert. Im Weiteren wurde der Fokus von Metaboliten- und Stoffwechselweg-zentrierten Fragen hin zu einer globaleren Perspektive der pseudomonalen Virulenz und des Metabolismus erweitert, was die Aufmerksamkeit auf PrmC lenkte, ein Enzym mit teilweise unbekannter, für die in vivo-Virulenz unverzichtbarer Funktion. Ein globales Metabolomik-Experiment lieferte Einblicke in die Rolle von PrmC und seinen Einfluss auf das pseudomonale Endo- und Exometabolom. Schließlich wurden klinische P. aeruginosa-Stämme mit unterschiedlichen Virulenzphänotypen mittels ungerichteter Metabolomik untersucht, um metabolische Variationen und Zusammenhänge zwischen Virulenz und Metabolismus aufzudecken. Die Analyse resultierte in der Entdeckung eines putativen Virulenzbiomarkers und ermöglichte die Konstruktion eines Random-Forest-Klassifikationsmodells für bestimmte Virulenzphänotypen, das nur auf Metabolomik-Daten basiert. Zusammenfassend hat diese Studie das Potenzial der Metabolomik für die Untersuchung der Virulenzfaktoren von P. aeruginosa aufgezeigt und damit zum Verständnis des komplexen Zusammenspiels von Metabolismus und Virulenz bei diesem wichtigen Pathogen beigetragen

Microbial stress. From sensing to intracellular and population responses

We initially devised this Research Topic (RT) as a valuable initiative to collect high-quality scientific articles from the participants of the 4th European Federation of Biotechnology (EFB) Microbial Stress meeting held in Kinsale, Ireland, April 2018. The scope of the RT is based on the scientific content of that “Microbial Stress: from Systems to Molecules and back” meeting. Indeed, over 40% of the articles eventually accepted for publication were contributed by meeting participants, but notably the remaining 60% was contributed by authors that work in this field. The collection of 22 original research and 2 review articles, contributed by 163 authors collectively, deal with the many different aspects of the microbial responses to biotic and abiotic stresses, relevant to many fields: from host-pathogen interactions to biotechnology, from bioremediation to food processing, from molecular and single-cell to population studies. The RT showcases the rapid developments of the microbial stress research on a range of microorganisms and stress conditions, and confirms that understanding microbial physiology under stress can be a trigger for the development of new methodologies as well as helping to integrate the knowledge from many different microbiological fields of research. The retrospective analysis of the articles contributed to this RT allowed them to be assigned to one of four main sub-topics: (i) impact of weak organic acids and low pH on micro-organisms, from clinical to biotechnological contexts; (ii) adaptive responses in microbial pathogens to abiotic/environmental stress; (iii) oxidative and metal stress, from clinical to bioremediation contexts, and (iv) regulation of transcription and translation under stress, from epigenetic aspects to the role of second messengers and sRNA