Advances, applications, and limitations of portable and rapid detection technologies for routinely encountered foodborne pathogens

Traditional foodborne pathogen detection methods are highly dependent on pre-treatment of samples and selective microbiological plating to reliably screen target microorganisms. Inherent limitations of conventional methods include longer turnaround time and high costs, use of bulky equipment, and the need for trained staff in centralized laboratory settings. Researchers have developed stable, reliable, sensitive, and selective, rapid foodborne pathogens detection assays to work around these limitations. Recent advances in rapid diagnostic technologies have shifted to on-site testing, which offers flexibility and ease-of-use, a significant improvement from traditional methods’ rigid and cumbersome steps. This comprehensive review aims to thoroughly discuss the recent advances, applications, and limitations of portable and rapid biosensors for routinely encountered foodborne pathogens. It discusses the major differences between biosensing systems based on the molecular interactions of target analytes and biorecognition agents. Though detection limits and costs still need further improvement, reviewed technologies have high potential to assist the food industry in the on-site detection of biological hazards such as foodborne pathogens and toxins to maintain safe and healthy foods. Finally, this review offers targeted recommendations for future development and commercialization of diagnostic technologies specifically for emerging and re-emerging foodborne pathogens

Phage-based biosensors for detection of microbes and biomarkers

The detection of microbial species and communities has always been an area of great importance. Rapid methods for microbial detection are especially important in the medicine, pharmacological, and food industry. The lack of rapid and cost-effective detection methods creates a challenge to control possible epidemics. New pathogenic microbes can cause a worldwide outbreak of diseases, pandemics. The majority of currently used detection methods for pathogens have low sensitivity and specificity. Human microbiota has been demanding and mostly unexplored area before modern high-throughput methods were established. These methods have elucidated a lot of connections between different diseases and composition changes of intestinal microbiota. However, sequencing a large number of samples takes a great deal of time, work and it requires centralized facilities. For microbiota, there are no actual comprehensive and rapid sensors. Biosensors have a great potential to respond to the challenges of microbial detection. The small physical size of the equipment, ease of use and operability outside centralized hospitals are appealing characteristics of this emerging class of diagnostic devices In this thesis, the applicability of newly developed rapid biosensors were evaluated as a tool for the detection of urinary tract infection and biomarkers. The studied methods are not based on traditional immunoassay detection technology, which usually relies on detecting a single antigen from the sample. Instead, a sensitive long lifetime luminescent europium label was used with different modulating probes to nonspecifically interact with simulated samples, but also with hospital samples. Chemical probes, or phages as biological probes, were used successfully to provide multiparameter luminescence data —a fingerprint from each sample. Phage-based methods were designed to meet the challenges of rapid detection of a single bacterial species. The second phage-based study was based on lysogenic phages and tested with hospital samples the assay time was reduced. The proof-of-principle method showed sensitivity and specificity at the 90% mark when compared to the standard culture method. The method was further developed and applied to detect specific biomarkers in a controlled chemical environment and finally to classify lethal prostate cancer against non-lethal ones from urine samples. The assay demonstrated a statistically significant difference between the two groups (pBakteriofageihin perustuvat biosensorit mikrobien ja biomarkkereiden havaitsemisessa Lääketieteessä, lääkeaineiden puhtaassa valmistuksessa ja elintarviketeollisuudessa mikrobien nopea havaitseminen on ensisijaisen tärkeää. Nopeille ja edullisille havaitsemismenetelmille on tarvetta varsinkin epidemioiden hallitsemisessa. Uudet patogeeniset mikrobit voivat aiheuttaa pandemioita, jotka alkuvaiheessa etenevät hyvin nopeasti maanosasta toiseen. Tämän päivän havaitsemismenetelmillä on yleisesti haasteita herkkyydessä ja spesifisyydessä. Ihmisen mikrobiota on ollut pitkään haastava ja tutkimaton alue. Tämä johtuu yksinkertaisesti siitä, ettei tähän tutkimusalueeseen ollut riittäviä tutkimusmenetemiä. Nämä nykyaikaiset menetelmät ovat selventäneet paljon yhteyksiä eri sairauksien ja suolen mikrobiotan koostumuksen muutosten välillä. Koko mikrobiotan testaukseen ei ole käytännössä todellisia pikatestijärjestelmiä. Biosensoreilla on mahdollista vastata mikrobien havaitsemisen asettamiin haasteisiin. Pieni koko, helppokäyttöisyys ja käytettävyys kenttäolosuhteissa ovat houkuttelevia tekijöitä orastavalle diagnostiikkalaitteiden luokalle. Tässä väitöskirjassa arvioitiin erilaisten nopeiden biosensorien soveltuvuutta mikrobien ja biomarkkerien havaitsemisessa. Työssä tutkitut menetelmät eivät perustuneet perinteisiin immunomääritystekniikoihin, jotka perustuvat yleensä yksittäisen antigeenin havaitsemiseen näytteestä. Tämän sijasta käytettiin näytteen kemialliselle ympäristölle herkkää europium-leimaa, jota käytettiin ei-spesifisesti vuorovaikutuksessa sekä simuloidun näytteen että potilasnäytteiden kanssa. Bakteriofagit toimivat biologisina koettimina ja tuottivat moneen eri parametriin perustuvaa luminesenssidataa -sormenjäljen jokaisesta yksittäisestä näytteestä. Bakteriofageihin perustuvat menetelmät kehitettiin ensin yksittäisten bakteerilajien havaitsemiseen ensin simuloiduissa olosuhteissa ja tämä jälkeen potilasnäytteistä. Menetelmää sovellettiin pidemmälle tunnistamaan spesifisistä biomarkkeria säädellyssä kemiallisessa ympäristössä. Lopulta menetelmää käytettiin luokittelemaan tappavat eturauhassyöpänäytteet ei-tappavista näytteistä. Luokittelutestin avulla havainnollistettiin tilastollisesti merkittävä ero näiden kahden näytetyypin välillä (p <0.0014). Yhteenvetona nämä havainnot osoittavat sen, että lantanidi-leimaan ja bakteriofaageihin perustuvaa menetelmää voidaan käyttää spesifisesti biomarkkerin, tai yksittäisen bakteerilajin havaitsemisee

Integration of virus-like particle macromolecular bioreceptors in electrochemical biosensors

Rapid, sensitive and selective detection of chemical hazards and biological pathogens has shown growing importance in the fields of homeland security, public safety and personal health. In the past two decades, efforts have been focusing on performing point-of-care chemical and biological detections using miniaturized biosensors. These sensors convert target molecule binding events into measurable electrical signals for quantifying target molecule concentration. However, the low receptor density and the use of complex surface chemistry in receptors immobilization on transducers are common bottlenecks in the current biosensor development, adding to the cost, complexity and time. This dissertation presents the development of selective macromolecular Tobacco mosaic virus-like particle (TMV VLP) biosensing receptor, and the microsystem integration of VLPs in microfabricated electrochemical biosensors for rapid and performance-enhanced chemical and biological sensing. Two constructs of VLPs carrying different receptor peptides targeting at 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) explosive or anti-FLAG antibody are successfully bioengineered. The VLP-based TNT electrochemical sensor utilizes unique diffusion modulation method enabled by biological binding between target TNT and receptor VLP. The method avoids the influence from any interfering species and environmental background signals, making it extremely suitable for directly quantifying the TNT level in a sample. It is also a rapid method that does not need any sensor surface functionalization process. For antibody sensing, the VLPs carrying both antibody binding peptides and cysteine residues are assembled onto the gold electrodes of an impedance microsensor. With two-phase immunoassays, the VLP-based impedance sensor is able to quantify antibody concentrations down to 9.1 ng/mL. A capillary microfluidics and impedance sensor integrated microsystem is developed to further accelerate the process of VLP assembly on sensors and improve the sensitivity. Open channel capillary micropumps and stop-valves facilitate localized and evaporation-assisted VLP assembly on sensor electrodes within 6 minutes. The VLP-functionalized impedance sensor is capable of label-free sensing of antibodies with the detection limit of 8.8 ng/mL within 5 minutes after sensor functionalization, demonstrating great potential of VLP-based sensors for rapid and on-demand chemical and biological sensing

Design Of Inorganic Peptide Bonded Fusion Biomolecules For Tracking Disease Related Proteins

Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014Thesis (PhD) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2014Hastalıklarla ilişki antijenlerin belirlenebilmesi hayat kurtarır. Bu nedenle araştırmacılar sürekli olarak daha hassas ve hızlı tanı sistemleri geliştirmek için çalışmaktadırlar. İlk olarak, ELISA yöntemi gibi tanı sistemlerinde standart olarak kullanılan kolorimetrik substratlar daha hassas ve hızlı görüntüleme sağlayan kemilüminesan subtratlar ile değiştirilmeye başlanmıştır. Bazı çalışmalar ise tanı sistemlerindeki aşamaların azaltılması konusuna yönelmiştir. Algılayıcı moleküller olan antikorlara kovalent olarak bağlanmış kuantum dot’lar gibi floresan moleküller veya genetik füzyon olarak bağlanmış yeşil floresans protein (GFP) aracılığıyla tek aşamalı tanı sistemleri geliştirilmiştir. Günümüzde ise farklı tanı stratejilerin ile yeni cihazların geliştirilmesi söz konusu olmaktadır. Yüzey plazmon rezonans (SPR) spektrometreleri protein-protein etkileşimlerini gerçek zamanda takip etmeyi sağlayan cihazlardır. Bu cihazlar sayesinde protein-protein etkileşimlerinin kinetik hesaplamalarının yapılması dışında ayrıca daha kesin sonuçlar elde edilmesini sağlanmaktadır. SPR cihazların temeli SPR çipi yüzeyinde bulanan ince altın tabakasının yaydığı yüzey plazmon rezonanslarına dayanmaktadır. SPR çipinin alt tarafında bulunan bir prizmanın içerisinden geçen bir ışık süzmesi gönderilmektedir. Işık süzmesinin altın tabakaya çarptıktan sonra ışık süzmesinin yansıma açısı ölçülmektedir. SPR çipi üzerinde proteinlerin geçişi sağlandığı zaman çip yüzeyine bağlanan proteinler altın tabakanın yaydığı yüzey plazmon rezonansını etkileyerek ışık süzmesinin yansıma açısını değiştirmektedir. Ölçülen yansıma açısındaki değişiklik çip yüzeyinde bağlanan protein miktarı ile doğru orantıda olmasından dolayı çip yüzeyinde etkileşime giren protein miktarı belirlenebilmektedir. Protein-protein etkileşimleri, SPR çipi yüzeyinde oluşan yüzey plazmon rezonans değişimine dayalı olması nedeniyle diğer tanı sistemlerinde gereken enzim veya floresans molekül gibi işaretleyici moleküller ihtiyaç duyulmaması SPR’a dayalı tanı sistemlerinin en büyük avantajıdır. SPR temelli tanı sistemleri umut vaat edici olmalarına karşın birkaç dezavantajları bulunmaktadır. Protein-protein etkileşimlerinin incelenebilmesi için öncelikle bir proteinin altın kaplı çip yüzeyine bağlanması gerekmektedir. Bu bağlama işlemi, öncelikle çip yüzeyinde bulunan altın tabakasının kullanım türüne göre farklı kimyasal kaplama molekülleri ile protein bağlaması için aktif hale getirilmesi gerekmektedir. Daha sonra da proteinlerin amino veya karboksi gruplarından bağlamak için ayrıca kimyasal reaksiyonlar gerekmektedir. Uygulanan bu kimyasal reaksiyonların bağlanacak proteinler üzerinde olumsuz etki gösterebileceği göz ardı edilemez. Diğer dezavantaj ise ELISA için de geçerli olmakla birlikte çip yüzeyine bağlanan proteinlerin yönlendirilmemiş olmasıdır. Bu nedenle bazı proteinlerin diğer proteinlere bağlanma bölgeleri, oluşturulan bağ nedenliyle perdelenmiş olur ve hedef molekülün tanısında veri kaybına neden olabilmektedir. Bu çalışma, kimyasal reaksiyonlar kullanmadan ve kendilerini yönlendirmiş bir şekilde SPR çipi yüzeyine bağlayabilen antikor yapıların geliştirilmesine odaklanarak SPR’a dayalı tanı sistemlerinde bir iyileştirilmeye gidilmesini hedeflemektedir. Hastalıklarla ilişkili proteinlerin takibinin yapılması için tasarlanacak sistem için model olarak Hepatit B virüsü yüzey antijenine bağlama özelliği olan bir rekombinant bir antikor kullanılacaktır. Hepatit B virüsü (HBV), Kronik Hepatit, siroz ve karaciğer kanserinin (hepatoselüler karsinoma, HCC) başlıca sebeplerindendir. Dünya sağlık örgütüne göre yaklaşık 2 milyar kişi HBV tarafından enfekte edilmiş ve enfekte edilen kişilerden 240 milyonunun enfeksiyonu kronikleşmiş durumdadır. Her yıl yaklaşık 600.000 kişi HBV’ye dayalı hastalıklardan hayatını kaybetmektedir. HBV, insan hepatositlerini enfekte ederek enfeksiyöz virionların ve yoğun miktarda hepatit B yüzey S antijeninin (HBsAg) kan dolaşım sistemine bırakılmasına neden olmaktadır. Bu nedenle dolaşım sisteminde HBsAg’nin varlığı HBV enfeksiyonu belirtecidir. HBV enfeksiyonu rutin olarak HBsAg’ye spesifik ELISA kitleri ile belirlenmektedir. Bu kitler dünya çapında yaygın olarak kullanılmaktadır. Fakat, bu kitler kullanılarak HBsAg varlığı ancak 3 saat gibi bir sürede tespit edilebilmektedir. Daha da önemlisi bu tür tanı sistemlerinde algılayıcı bir anti-HBsAg dışında bir de işaretleme için farklı bir anti-HBsAg antikoru gerekmektedir. Bu sebepten dolayı kitlerin maliyetini artırmaktadır. Bu nedenlerden dolayı oluşturulmak istenen yeni SPR temelli biyosensör stratejisi için HBV enfeksiyonu tanısı model olarak seçilmiştir. Bu kapsamda, öncelikle HBsAg’ye bağlanma özelliği olan rekombinant antikor geliştirmek amacıyla Faj gösterim teknolojisi kullanılmıştır. Faj gösterim teknolojisi ile rekombinant antikor geliştirmek için standart olarak deney farelerinin saf hedef antijen ile bağışıklanması gerekmektedir. Bu çalışmada ise, ilk yenilikçi yaklaşım olarak maliyeti yüksek olabilecek saf antijenlerin kullanılmasından ziyade bağışıklamalar için yüzeyinde HBsAg’yi sunan bakteriyofajlar kullanarak farelerin bağışıklanmasını sağlamak olmuştur. Fajların, hayvan bağışıklama çalışmalarında adjüvan olarak kullanıldığı bilinmektedir. TÜBİTAK Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulundan onay alındıktan sonra Hepatit B yüzey antijeni geni polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmış ve bir fajmit vektöre klonlanmıştır. Sonrasında E. coli TG1 suşuna rekombinant vektör kimyasal transformasyon ile aktarılmıştır. Daha sonra HBsAg’nin faj yüzeyinde expresyonu sağlanmış ve bu fajlar fare bağışıklamasında kullanılmıştır. Ardı ardına yüzeyinde HBsAg sunan fajlar ile yapılan üç enjeksiyon sonrasında farelerin oluşturduğu anti-HBsAg immün yanıta ELISA (Enzyme-linked immunosorbant assay) yöntemi ile bakılmıştır. Yapılan enjeksiyonlar sonucunda farelerde immün yanıt oluştuğu gösterilmiştir. Bu çalışmalar Uluslararası atıf endeksine giren “Advances in Biosciences and Biotechnology” dergisinde yayınlanmıştır. Bağışıklama sürecinden sonra immün yanıt gösteren farelerin dalağı alınmış ve antikor üreten B lenfositlerinden RNA izolasyonu yapılmıştır. RNA’ların cDNA’ya çevrilmesiyle bir cDNA kütüphanesi oluşturulmuştur. PZR yöntemi ile cDNA kütüphanesinden antikor ağır ve hafif değişken bölgeleri çoğaltılmış ve tek zincir rekombinant antikor (single chain variable fragment, scFv) gen kütüphanesi oluşturulmuştur. Elde edilen kütüphane fajmit vektöre klonlanmış ve E. coli TG1 bakterilerine kimyasal transformasyon ile aktarılmıştır. Daha sonra yüzeylerinde antikor kütüphanesi sunan fajlar elde edilmiş ve bu kütüphane HBsAg’ye karşı taranmıştır (Biopanning). HBsAg’ye bağlanan fajlar seçilmiş ve tekrar bir biopanning aşamasından geçilerek kütüphanesinin zenginleşmesi sağlanmıştır. Üç zenginleştirme aşamasından sonra faj klonlarının ayrı ayrı HBsAg’ye bağlanmaları ELISA ile kontrol edilmiştir. HBsAg’ye bağlanma özelliği olan antikorlar seçilmiş olmasına karşın TÜBİTAK Marmara Araştırma Merkezi Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü immünogenetik Laboratuarında daha önceden oluşturduğumuz Lig7 anti-HBsAg rekombinant antikoru kadar iyi bağlanma göstermediklerinden biyosensör çalışmalarına Lig7 antikoru ile devam edilmesine karar verilmiştir. Lig7 antikoru PZR ile çoğaltıldıktan sonra pQE2 bakteriyel ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Bu ekspresyon vektörünün özelliği, protein saflaştırma çalışmalarında kolaylık sağlayan Histidin kuyruğunun (His-Tag) daha sonra Histidin kuyruğu ile protein arasına yerleştirilmiş proteaz kesim bölgesi sayesinde Histidin kuyruğunun çıkarılabilmesidir. Bu sayede üretilen proteinin orijinal yapısına en yakın olabilecek şekli elde edilebilmektedir. Lig7 geni pQE2 vektörüne klonlandıktan sonra genetik füzyon olacak şekilde Prof. Dr. Candan TAMERLER ve grubunun (Moleküler Biyoloji- Genetik ve Biyoteknoloji Araştırma Merkezi, İstanbul Teknik Üniversitesi) karakterize etmiş olduğu altına bağlanma özelliği olan GBP1’yi (Gold Binding Peptide-1) kodlayan gen rekombinant vektöre klonlanmıştır. Klonlamalar sonrasında genetik füzyon yapı DNA dizi analizi ile kontrol edilmiş ve üç farklı füzyon yapı belirlenmiştir. Bu genetik füzyonların, Lig7 ile birleşmiş farklı GBP1 tekrarlarından (tek GBP1, 3’lü tekrar ve 5’li tekrar) olduğu tespit edilmiştir. Lig7 antikoru ile üç Lig7 GBP1 füzyon yapıları eksprese edilmiş ve His-tag aracılığı ile saflaştırılmıştır. Saflaştırılan altına bağlanma özelliği kazandırılmış anti-HBsAg bifonksiyonel rekombinant antikorların altın kaplı SPR çiplerine bağlanmaları Reichert SPR spektrometresiyle kontrol edilmiş ve bağlanmaları teyit edilmiştir. Daha sonra, çip yüzeyine yönlendirilmiş şekilde bağlanmış bifonksiyonel antikorların HBsAg’yi bağlama özellikleri yine SPR spektrometresiyle kontrol edilmiş ve HBsAg’nin çip yüzeyine tutulduğu gösterilmiştir. SPR spektrometresi ile yapılan kinetic çalışmalar sonucunda Lig7-GBP1, Lig7-3GBP ve Lig7-5GBP füzyon antikorlarının altına bağlanma kinetiği çok farklılık göstermemesine karşın GBP1 tekrar sayısının HBsAg’nin bağlanması açısından kayda değer farklılıklar gösterdiği tespit edilmiştir. Füzyon antikor yapılarının HBsAg için denge ayrışma sabitleri Lig7-GBP1, Lig7-GBP3 ve Lig7-5GBP için sırasıyla 315 nM, 30 nM ve 0,6 nM olarak belirlenmiştir. Bu değerlere bakıldığında GBP1 tekrarının artmasıyla antikorun HBsAg’ye olan “afinitesinin” arttığı görülmüştür. Ancak anti-HBsAg Lig7 antikoru her bir füzyon yapı için aynı olduğundan bağlanmadaki bu farkın antikorun HBsAg’nin bağlanmasına ne kadar elverişli olduğunun bir göstergesi olarak kabul edilmiştir. Bu nedenle altın çip yüzeyine yönlendirilmiş şekilde adsorbe edilmiş Lig7-5GBP bifonksiyonel antikorun konformasyonel olarak diğer iki antikora göre HBsAg’yi bağlamak için daha uygun olduğu görülmüştür. Antikorların altına bağlanma kinetiklerinin yaklaşık aynı olduğu düşünülürse tekrar sayınının altına bağlanma özelliğini arttırmasından çok, anti-HBsAg Lig7 antikorunun uygun konformasyonda sunulmasında etkili olduğu gözlemlenmiştir. Kimyasal bağlar oluşturarak SPR çipi üzerine bağlanmış Lig7’nin HBsAg’yi bağlama denge ayrışma sabitinin 31,4 nM olduğu hesaplanmıştır. Bu değerin, Lig7-3GBP’nin HBsAg için olan denge ayrışma sabiti ile yaklaşık aynı olduğu, Lig7-GBP ile karşılaştırıldığında ise daha düşük olduğu görülmüştür. Fakat Lig7-5GBP’nin HBsAg’ye olan afinitesinin kimyasal olarak bağlanmış Lig7’den de yaklaşık 50 kat daha iyi olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar da, tez çalışmalarının dayandığı, bifonksiyonel rekombinant antikorların yönlendirilmiş şekilde altın kaplı SPR çiplerinin üzerine kaplanarak SPR sistemlerinde biyosensör uygulamalarının iyileştirilmesi hipotezinin doğruluğunu göstermiştir. Sonuç olarak bu çalışmada, genetik olarak altına bağlanma özelliği kazandırılmış bir rekombinant antikorun yönlendirilmiş bir şekilde altın kaplı SPR Çipleri yüzeyine bağlandığı gösterilmiş, ve bu antikorun SPR spektrometresine dayalı tanı sistemlerinde kullanılabileceği ve hatta bir iyileştirme sağladığı gösterilmiştir.DESIGN OF INORGANIC PEPTIDE BONDED FUSION BIOMOLECULES FOR TRACKING DISEASE RELATED PROTEINSDoktoraPh

Love Wave Biosensors: A Review

In the fields of analytical and physical chemistry, medical diagnostics and biotechnology there is an increasing demand of highly selective and sensitive analytical techniques which, optimally, allow an in real-time label-free monitoring with easy to use, reliable, miniaturized and low cost devices. Biosensors meet many of the above features which have led them to gain a place in the analytical bench top as alternative or complementary methods for routine classical analysis. Different sensing technologies are being used for biosensors. Categorized by the transducer mechanism, optical and acoustic wave sensing technologies have emerged as very promising biosensors technologies. Optical sensing represents the most often technology currently used in biosensors applications. Among others, Surface Plasmon Resonance (SPR) is probably one of the better known label-free optical techniques, being the main shortcoming of this method its high cost. Acoustic wave devices represent a cost-effective alternative to these advanced optical approaches [1], since they combine their direct detection, simplicity in handling, real-time monitoring, good sensitivity and selectivity capabilities with a more reduced cost. The main challenges of the acoustic techniques remain on the improvement of the sensitivity with the objective to reduce the limit of detection (LOD), multi-analysis and multi-analyte detection (High-Throughput Screening systems-HTS), and integration capabilities. Acoustic sensing has taken advantage of the progress made in the last decades in piezoelectric resonators for radio-frequency (rf) telecommunication technologies. The so-called gravimetric technique [2], which is based on the change in the resonance frequency experimented by the resonator due to a mass attached on the sensor surface, has opened a great deal of applications in bio-chemical sensing in both gas and liquid media. Traditionally, the most commonly used acoustic wave biosensors were based on QCM devices. This was primarily due to the fact that the QCM has been studied in detail for over 50 years and has become a mature, commercially available, robust and affordable technology [3, 4]. LW acoustic sensors have attracted a great deal of attention in the scientific community during the last two decades, due to its reported high sensitivity in liquid media compared to traditional QCM-based sensors. Nevertheless, there are still some issues to be further understood, clarified and/or improved about this technology; mostly for biosensor applications. LW devices are able to operate at higher frequencies than traditional QCMs [5]; typical operation frequencies are between 80-300 MHz. Higher frequencies lead, in principle, to higher sensitivity because the acoustic wave penetration depth into the adjacent media is reduced [6]. However, the increase in the operation frequency also results in an increased noise level, thus restricting the LOD. The LOD determines the minimum surface mass that can be detected. In this sense, the optimization of the read out and characterization system for these high frequency devices is a key aspect for improving the LOD [7]. Another important aspect of LW technology is the optimization of the fluidics, specially the flow cell. This is of extreme importance for reducing the noise and increasing the biosensor system stability; aspects that will contribute to improve the LOD. The analysis and interpretation of the results obtained with LW biosensors must be deeper understood, since the acoustic signal presents a mixed contribution of changes in the mass and the viscoelasticity of the adsorbed layers due to interactions of the biomolecules. A better understanding of the transduction mechanism in LW sensors is a first step to advance in this issue; however its inherent complexity leads, in many cases, to frustration [8]. The fabrication process of the transducer, unlike in traditional QCM sensors, is another aspect under investigation in LW technology, where features such as: substrate materials, sizes, structures and packaging must be still optimized. This chapter aims to provide an updated insight in the mentioned topics focused on biosensors applications

Biosensors for Environmental Monitoring

Real-time and reliable detection of molecular compounds and bacteria is essential in modern environmental monitoring. For rapid analyses, biosensing devices combining high selectivity of biomolecular recognition and sensitivity of modern signal-detection technologies offer a promising platform. Biosensors allow rapid on-site detection of pollutants and provide potential for better understanding of the environmental processes, including the fate and transport of contaminants.This book, including 12 chapters from 37 authors, introduces different biosensor-based technologies applied for environmental analyses

Affimer-based impedimetric biosensors: the new analytical platform for biorecognition applications

Thanks to their high sensitivity and specificity, short-processing times, low cost of production, small size, and no requirement for professional users, biosensors have increasingly gained popularity. Electrochemical impedance biosensors have successfully been applied to detect a wide range of target analytes including whole cells, proteins, and small molecules. However, there are some limitations, for example reproducibility and non-specific binding, which still require further development. The main objective of this thesis is to develop impedimetric biosensors using Affimers, novel non-antibody binding proteins, as bioreceptors to detect a small molecule target, dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), and a protein biomarker, fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3). Initial work in this thesis was the selection of Affimers using phage display technology. Affimers were selected from a phage library provided by the BioScreening Technology Group (BSTG) at the University of Leeds. The selected Affimer-encoding sequences were then subcloned into the pET expression vector and expressed in E.coli cells. Prior to using the selected Affimers for biosensor fabrication, specific interaction of the Affimers with their analytes was investigated using ELISA, surface plasmon resonance (SPR) and immunoprecipitation (pull-down) assay. Even though none of the Affimers against DDT succeeded in binding specifically to DDT, some of the Affimers against FGFR3 showed binding to it and were then utilised for biosensor fabrication. Two sensor fabrication methods, the ELISHA “gluing” protocol and NeutrAvidin-biotin linkage, were tested and the latter one was selected for further study. By using the NeutrAvidin-biotin interaction method to functionalise the sensor surfaces, several parameters such as Affimer concentration, NeutrAvidin concentration and blocking agents to minimise non-specific binding were optimised. The fully fabricated Affimer-based biosensors were incubated with the analyte (FGFR3) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was employed to interrogate FGFR3 binding. The data showed that the Affimer-based sensors could detect FGFR3 protein to very low levels. However, further optimisation is still needed in order to minimise non-specific binding effects and make the sensors work consistently. The work presented in this thesis is the first Affimer-based impedimetric biosensor for the detection of FGFR3, a promising biomarker for early diagnosis of bladder cancer. This sensor platform may not only provide an effective tool for bladder cancer surveillance, but also pave the way of designing a new analytical method for monitoring other protein biomarkers of disease

Exploring the Potential of Antibody Mimetics for Detecting Environmental Contaminants

Over the past 15-20 years, there has been growing interest and concern from the scientific and regulatory communities over the potential risks of emerging environmental contaminants (ECs). State-of-the-art techniques used for monitoring ECs do not provide the high spatial and temporal resolution measurements required to better understand and mitigate the risks. Immunoassays, which use antibodies to detect a target compound with high affinity, specificity and selectivity, partly address these limitations. However, the use of antibodies for the detection of small-sized, non-immunogenic environmental contaminants, presents a number of challenges. Recent advances in protein engineering have led to the emergence of antibody mimetics that offer the high affinity and specificity associated with antibodies, but with reduced batch-to-batch variability, increased stability, and in vitro selection to ensure rapid discovery of binders against a wide range of targets. This study explores the potential of Affimers, a recent example of antibody mimetics, as suitable bioreceptors for the detection of small organic molecules. Methylene blue (MB), a redox-active molecule used as a fabric dye and diclofenac (DCF), an important environmental contaminant, were selected as the target compounds and Affimers against MB and DCF were developed by the BioScreening Technology Group, University of Leeds. The objectives of this project were to a) demonstrate that the developed Affimers can bind to the selected targets with very high affinity, b) assess their performance in the complexity of environmental water samples (selectivity), and c) investigate the potential of an Affimer-based assay for small molecule detection. Target immobilisation for Affimer characterisation was achieved using long-chained alkanethiol linkers coupled with oligoethylene glycol (LCAT–OEG) and the immobilisation approach was evaluated through electrochemical measurements and infrared spectroscopy. Subsequently, binding between the immobilised targets and target-specific Affimers was quantified using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D). Affimer affinity studies revealed Affimer dissociation constants (KD=13.7 nM and 73 nm for MB and DCF Affimers respectively) was comparable to that of high affinity antibodies. Furthermore, the high selectivity of MB-Affimers was demonstrated using limnetic water samples. Finally, an Affimer-based competition ELISA was demonstrated (LOD=75 nM), illustrating the potential of Affimers as bioreceptors in immunoassays for the detection of small-sized, non-immunogenic compounds. These findings are very promising, encouraging further research into Affimer-based assays and biosensors in order to introduce a novel, alternative path for rapid, on-site monitoring of contaminants in the environment

Nuevas estrategias para el desarrollo de biosensores ópticos aplicados al análisis de micotoxinas y hongos toxigénicos en alimentos

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Químicas, Departamento de Química Analítica, leída el 15-07-2019Mycotoxins are a diverse group of low molecular weight compounds produced as secondary metabolites by numerous species of filamentous fungi. This assemblage is chemically and toxigenically rather heterogeneous, but generally these toxins are known to cause disease and death in human and other vertebrates even at low concentrations. Mycotoxigenic fungi grow on a wide range of conditions and they can produce mycotoxins into the matrices on which they grow, often food intended for human consumption or animal feed. As a result of the ubiquitous nature of mycotoxigenic fungi, particularly in temperate and tropical regions of the world, mycotoxin contamination is often inevitable, and some calculations have estimated that approximately 25–50% of world crops are contaminated with these toxins. Although the awareness related to the hazards of mycotoxins as food and feed contaminants is growing, there are no absolute measures available for eliminating mycotoxins from agricultural products. While mycotoxin occurrence in the field can be decreased by good agronomic practices and planting resistant varieties, in the end, analytical methods capable of detecting mycotoxins and toxigenic fungi even at low concentration are of key importance for ensuring food safety...Las micotoxinas son metabolitos secundarios tóxicos producidos por algunas cepas de hongos que contaminan alimentos, especialmente cereales y hortalizas. Estos compuestos de bajo peso molecular son químicamente y toxigénicamente heterogéneos; sin embargo, muchas de estas toxinas pueden originar enfermedades, y en ocasiones la muerte, tanto en humanos como en otros vertebrados. Los hongos toxigénicos crecen en muchas condiciones muy diversas, lo que puede dar lugar a la aparición de micotoxinas en los alimentos destinados tanto al consumo humano como al animal. Los hongos toxigénicos están ampliamente distribuidos por todo el mundo, particularmente en las regiones templadas y tropicales, por lo que la contaminación natural por micotoxinas es casi inevitable. De hecho, se estima que aproximadamente el 25–50% de los cultivos mundiales están contaminados por estas toxinas, y la preocupación sobre los peligros asociados a su presencia en alimentos es cada día mayor. Actualmente, no existen alternativas viables para su eliminación en los productos agrícolas; aunque el empleo de buenas prácticas agrícolas o la plantación de variedades resistentes a los hongos, pueden ayudar a mejorar este problema. En cualquier caso, se requieren métodos analíticos sensibles y selectivos para la detección de micotoxinas y hongos toxigénicos, a bajas concentraciones, afin de garantizar la seguridad alimentaria...Depto. de Química AnalíticaFac. de Ciencias QuímicasTRUEunpu