Portable “lab-on-chip” platform for bovine mastitis diagnosis in raw milk

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, Especialidade de Ciências Biológicas e BiomédicasBovine mastitis is an economic burden for farmers mostly because of decreased milk yield, premature culling and cost of veterinary treatments. The identification of mastitis pathogens is of major importance in order for adequate control measures to be taken, to reduce the risk of appearance of chronic infections, and to target antimicrobial therapy. The aim of this study was to develop and validate a sensitive method for magnetic detection of Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis in raw milk samples. Mastitic milk samples were collected aseptically from 81 cows with subclinical mastitis, from 12 Portuguese dairy farms. Ninety one quarter milk samples were selected based on bacteriological results. All samples were submitted to PCR analysis. In parallel, these milk samples were mixed with a solution combining specific antibodies and magnetic nanoparticles, to be analyzed using a lab-on-a-chip magnetoresistive cytometer, with microfluidics sample handling. This immunological recognition was able to detect bacterial presence above 100 cfu/ ml, depending on antibody and targeted bacteria. Comparison with PCR results showed sensitivities of 73% and 41%, specificity values of 25% and 57%, and PPV values of 35% and 54% for magnetic identification of streptococci species with an anti-S. agalactiae antibody and an anti-GB Streptococcus antibody, respectively. Regarding staphylococci species, the sensitivity values found were of 57.1% and 79.3%, specificities of 75% and 50%, and PPV values of 40% and 95.8% for magnetic identification with an anti-S. aureus antibody and an anti-Staphylococcus spp. antibody, respectively. Both bacterial genus studies translated a fair expectation for a “cow-side” use application, making this integrated platform of potential use after further improvements for fast bacteriological infection screening. Some constraints are described as well as the method´s limitations in bacterial quantification.RESUMO - Plataforma portátil “lab-on-chip” para diagnosticar mastite bovina em leite crú - A mastite bovina representa um custo económico relevante para os produtores de leite principalmente devido ao decréscimo da produção leiteira, abate prematuro e custos associados ao tratamento veterinário. Consequentemente, a identificação atempada dos agentes etiológicos é crítica para a implementação de medidas de controlo adequadas, redução do risco de infecções crónicas e aplicação de uma terapia microbiana específica. O objectivo deste estudo foi desenvolver e validar um método de detecção magnética capaz de identificar Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis em amostras de leite crú. As amostras de leite mastítico utilizadas foram recolhidas de 81 animais com mastite subclínica, de 12 explorações leiteiras nacionais. As amostras de leite de 91 quartos de úbere foram selecionadas tendo em conta os resultados bacteriológicos. Todas as amostras foram analisadas por PCR e pelo citómetro magnetoresistivo “lab-on-chip”, tendo sido necessário neste caso, adicionar uma solução com partículas magnéticas funcionalizadas com anticorpos específicos. Este reconhecimento imunológico detectou presença bacteriana acima das 100 ufc/ml, dependendo do anticorpo e da bactéria-alvo. Comparando com os resultados da análise por PCR, este método de detecção magnética apresentou sensibilidades de 73% e 41%, valores de especificidade de 25% e 57%, e valores VPP de 35% e 54% para identificar espécies de Streptococcus com os anticorpos anti-S. agalactiae e anti-GB Streptococcus, respectivamente. No que diz respeito às espécies de Staphylococcus, os valores de sensibilidade encontrados foram de 57.1% e 79.3%, de 75% e 50% para a especificidade, e de 40% e 95.8% para VPP com os anticorpos anti-S. aureus e anti-Staphylococcus spp., respectivamente. Os dois estudos apontam para uma potencial utilização do tipo “cow-side”, tornando a plataforma integrada potencialmente utilizável para uma rápida monitorização de infecção bacteriológica, após melhorias futuras. O método desenvolvido apresenta algumas restrições e limitações relativamente à quantificação bacteriana

Portable lab-on-chip platform for bovine mastitis diagnosis in raw milk

Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica , apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015As medidas de prevenção e controlo da mastite bovina consistem em boas práticas de gestão aliadas à administração de antibióticos. Os conceitos actuais para uma utilização prudente de antibióticos e preocupações a nível de saúde pública têm vindo a reforçar a necessidade de um diagnóstico adequado e atempado. Geralmente, a mastite é detectada com base em sinais clínicos evidentes de condições anormais do leite e / ou do úbere das vacas ou por testes que indicam uma reacção inflamatória. O teste Califórnia Mastite, consiste na contagem de células somáticas e kits relativamente baratos de bio marcadores estão disponíveis para o efeito, mas estes apenas fornecem informações sobre a presença / ausência de inflamação. Nos últimos anos, a tecnologia de Lab-on-Chip teve grandes desenvolvimentos, apresentando inúmeras vantagens relativamente aos métodos tradicionais de detecção de biomoléculas: maior sensibilidade, uma resposta mais rápida, recurso a pequenas quantidades de reagentes, redução do tamanho dos dispositivos, fácil utilização e custos acessíveis. Com o crescente interesse da medicina, indústria farmacêutica, biotecnologia e controlo ambiental, a tendência será deslocar os laboratórios para mais próximo dos clientes, através desta tecnologia também designada Point-of-Care (POC). Paralelamente, a integração da tecnologia biológica em aplicações de engenharia alimentar tem tido particular interesse na última década. A identificação precoce dos agentes patogénicos causadores da mastite bovina tem uma grande importância para a implementação de medidas de controlo adequadas, reduzindo o risco de infecções crónicas e permitindo orientar a terapêutica antimicrobiana a ser prescrita. A rápida identificação dos agentes patogénicos, como Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. e, entre estes, a discriminação entre os principais agentes contagiosos Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae, irá contribuir para um decréscimo dos danos económicos e de saúde pública consequentes da mastite bovina. Apesar dos sistemas de citometria convencional fornecerem resultados rápidos e fiáveis, estes continuam a ser volumosos, o que dificulta a sua portabilidade, além de apresentarem custos relativamente elevados e serem de utilização complexa. Por seu lado, os sensores magnetoresistivos são micro fabricados, podem ser integrados em canais microfluídicos e conseguem detectar células marcadas magneticamente. Os sensores magnetoresistivos utilizados neste trabalho são designados por Spin-Valve, sendo constituídos por uma camada de metal não magnético entre duas camadas de metais magnéticos. Uma das camadas magnéticas apresenta uma magnetização fixa, devido a uma camada antiferromagnética adjacente que lhe fixa a magnetização, enquanto a magnetização da outra camada se encontra livre para rodar. Esta dissertação pretende desenvolver uma plataforma portátil que integra um magnete permanente como fonte de magnetização, vinte e oito sensores magnetoresistivos e microfluídica, tornando possível a detecção e quantificação, de forma dinâmica e em tempo real, de partículas magnéticas e células marcadas magneticamente, utilizando vários sensores. Para tal, utilizou-se como ponto de partida um protótipo já existente no INESC-MN, que embora funcional, apresentava limitações na integração do biochip com a fonte de magnetização das nanopartículas, neste caso um magnete permanente. Como as Spin-Valves são apenas sensíveis a uma direcção no plano, se bem alinhadas na zona de homogeneidade dos campos perpendiculares criados pelo magnete, este não afecta a sensibilidade dos sensores. No entanto, uma pequena inclinação do magnete pode criar componentes de campo magnético no plano do sensor e, por conseguinte, afectar a sua sensibilidade. O magnete utilizado neste trabalho tem dimensões 20x20x3mm3 e um campo magnético residual de 1.2-1.3T. O sistema de microfluídica é composto por quatro canais lineares e individuais com 50 μm de altura, 100 μm de largura e 1 cm de comprimento, alinhados com cada conjunto de sensores. O chip e os microcanais são montados face-a-face e selados através de um processo químico, sendo depois montados e soldados num circuito impresso. Neste caso particular, o biossensor é desenhado para ser capaz de detectar e quantificar pequenas variações de campo magnético causadas pela presença de marcadores superparamagnéticos que são funcionalizados com anticorpos para proteínas de parede celular específicas que estão presentes na superfície das células de interesse. As partículas superparamagnéticas são muito utilizadas neste tipo de aplicações pelo facto de, na ausência de campo magnético externo, apresentarem magnetização nula – estão num estado superparamagnético. Quando um campo magnético externo é aplicado, provoca a magnetização destas partículas conduzindo-as a um estado paramagnético. Uma partícula magnetizada verticalmente, ao fluir no microcanal, gera um campo variável sobre o sensor. Como resultado, um pico bipolar é a assinatura da passagem de uma partícula perpendicularmente magnetizada sobre o sensor. De forma a conseguir obter uma plataforma com as características identificadas acima, foram combinados vários componentes numa única plataforma, através de um processo faseado que incluiu: i) A microfabricação de sensores magnetoresistivos, através de técnicas de fotolitografia, etching e lift-off; ii) A fabricação de um sistema de microfluidica em PDMS; iii) A integração do chip com os microcanais de PDMS através de um processo de ligação químico; iv) desenvolver um estudo sobre os efeitos de campos magnéticos externos sobre os sensores magnetoresistivos devido à presença de magnetes permanentes; v) O desenvolvimento de um módulo com um sensor de efeito de hall, que integrado numa plataforma de scanning permitisse quantificar os campos perpendiculares e longitudinais de magnetes; vi) a optimização do design do biochip de acordo com os dados obtidos; vii) O desenvolvimento de uma plataforma de suporte para a combinação do biochip com o magnete permanente; viii) A medição do momento magnético de um conjunto de partículas magnéticas com diferentes dimensões; ix) A validação experimental da eficiência do magnete permanente na magnetização de nanopartículas magnéticas, através de ensaios experimentais de detecção de nanopartículas de diferentes dimensões. x) O desenvolvimento de um programa de análise e contagem de eventos magnéticos utilizando o software Matlab®; xi) A avaliação experimental da detecção de células marcadas com partículas magnéticas. As medições experimentais foram realizadas utilizando uma plataforma electrónica desenvolvida pelo INESC-ID, há dois anos por um aluno de doutoramento, mostraram que a plataforma já optimizada permite a detecção de nanopartículas magnéticas e células marcadas magneticamente utilizando vários sensores magnetoresistivos, o que não era possível no protótipo anterior. Cinco tipos de partículas magnéticas, com dimensões entre os 2800 nm e os 50 nm, foram testadas nos vários canais. Foram observados picos correspondentes à passagem de partículas magnéticas em todas as amostras, excepto para as partículas com dimensões de 80 nm e 50 nm. Face a estes resultados conclui-se que, provavelmente: - Partículas de menores dimensões não apresentam tendência para formar aglomerados e, partículas individualizadas não têm momento magnético suficiente para serem detectadas; - Ou que a magnetização das partículas pelo magnete permanente é demasiado pequena para induzir um momento magnético significativo nas mesmas. Contudo, como neste caso é importante diminuir a probabilidade de ocorrência de falsos positivos, é relevante que partículas magnéticas que não estejam ligadas às moléculas de interesse não sejam detectadas pelo sensor. Deste modo, determinou-se que, para este sensor, as partículas de 80 nm ou 50 nm são as mais indicadas. Para validação da detecção de células foram realizadas experiências usando amostras de leite com Staphyloccocus spp. cedidas por uma colega do INESC-MN que está a desenvolver o seu trabalho de doutoramento em plataformas portáteis para análises ao leite. Estes testes com amostras biológicas foram realizados no INESC-MN, utilizando culturas de bactérias e protocolos de funcionalização e marcação magnética previamente desenvolvidos no Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA). As células foram marcadas magneticamente com partículas de 50 nm funcionalizadas com o anticorpo monoclonal anti-Staphyloccocus spp. e introduzidas no biochip para os testes de aquisição. Nesta fase foram utilizadas amostras de 500 μL contendo 10000 ufc e 8 x 108 partículas magnéticas funcionalizadas. Foram detectados picos, o que indica a capacidade desta plataforma para a detecção magnética de células marcadas. Para além disso, com o programa de contagem foi possível quantificar o número de eventos magnéticos ocorridos, tendo sido detectados 6063, para um número de colónias de 10000. Os resultados obtidos são bastante promissores, no entanto são necessários ainda estudos futuros para que este citómetro possa quantificar com maior precisão. Nomeadamente, um dos objectivos seria a medição realizada por vários sensores em simultâneo, de forma a obterem-se resultados mais confiáveis e precisos. Para tal, optimizações ao nível da aquisição do sinal, mais propriamente ao nível da plataforma electrónica de aquisição serão necessárias para que seja possível a medição com sensores em paralelo.Over the past decade, the drawbacks of conventional flow cytometers have encouraged efforts in microfabrication technologies and advanced microfluidics systems. Biosensor technology has been in exponentially development as it presents huge advantages when in comparison to traditional detection methods of biomolecules, such as high sensitivity, rapid response and small amount of reagents. Unlike external fluorescent/optical detectors, magnetoresistive (MR) sensors are micro-fabricated, can be integrated within microfluidic channels and can detect magnetically labelled biomolecules. Bovine mastitis is an economic burden for dairy farmers and control measures to prevent mastitis are crucial for dairy company sustainability. The present work describes a platform for dynamic mastitis diagnosis through detection of magnetically labelled cells with a magnetoresistive based cell cytometer, where a permanent magnet is used as magnetic source. A study about the effects of the magnetic fields over the MR sensors was developed in order to be possible to design and engineer a platform integrating the permanent magnet with the chip in such a way that the magnetic fields did not affect the MR sensors behaviour. Overall, assays were performed involving magnetic nanoparticles (MNP) and cells labelled with MNP. These assays were performed with a platform mentioned above, containing a permanent magnet assembled with the chip which was integrated with an electronic platform from INESC-ID, allowing signal acquisition from magnetized nanoparticles. In a very preliminary stage, magnetic particles between 2800 nm and 50 nm were tested flowing through a 100 μm wide, 50 μm high microchannel, with speeds around 50 μL/min being detected. Bipolar and unipolar signals with average amplitude of 15 μV – ~250 μV were observed corresponding to magnetic events. A home-made program to count magnetic events was developed in Matlab®. In particular it is presented an example for the validation of the platform as a magnetic counter that identifies and quantifies Staphylococcus spp. cells magnetically labelled with 50nm particles in a milk sample. In assays using 500 μL of milk sample, cells were detected with signal amplitude of 30 μV – ~200 μV

Biosensors for On-Farm Diagnosis of Mastitis

Bovine mastitis is an inflammation of the mammary gland caused by a multitude of pathogens with devastating consequences for the dairy industry. Global annual losses are estimated to be around €30 bn and are caused by significant milk losses, poor milk quality, culling of chronically infected animals, and occasional deaths. Moreover, mastitis management routinely implies the administration of antibiotics to treat and prevent the disease which poses serious risks regarding the emergence of antibiotic resistance. Conventional diagnostic methods based on somatic cell counts (SCC) and plate-culture techniques are accurate in identifying the disease, the respective infectious agents and antibiotic resistant phenotypes. However, pressure exists to develop less lengthy approaches, capable of providing on-site information concerning the infection, and in this way, guide, and hasten the most adequate treatment. Biosensors are analytical tools that convert the presence of biological compounds into an electric signal. Benefitting from high signal-to-noise ratios and fast response times, when properly tuned, they can detect the presence of specific cells and cell markers with high sensitivity. In combination with microfluidics, they provide the means for development of automated and portable diagnostic devices. Still, while biosensors are growing at a fast pace in human diagnostics, applications for the veterinary market, and specifically, for the diagnosis of mastitis remain limited. This review highlights current approaches for mastitis diagnosis and describes the latest outcomes in biosensors and lab-on-chip devices with the potential to become real alternatives to standard practices. Focus is given to those technologies that, in a near future, will enable for an on-farm diagnosis of mastitisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Supervised discriminant analysis for droplet micro-magnetofluidics

We apply the technique of supervised discriminant analysis (SDA) for in-flow detection in droplet-based magnetofluidics. Based on the SDA, we successfully discriminate bivariant droplets of different volumes containing different encapsulated magnetic content produced by a GMR-based lab-on-chip platform. We demonstrate that the accuracy of discrimination is superior when the correlation of variables for data training is included to the case when the spatial distribution of variables is considered. Droplets produced with differences in ferrofluid concentration of 2.5 mg/ml and volume of 200 pl have been identified with high accuracy (98 %), indicating the significance of SDA for e.g. the discrimination in magnetic immuno-agglutination assays. Furthermore, the results open the way for the development of a unique magnetofluidic platform for future applications in multiplexed droplet-based barcoding assays and screening

Development of a phage-based biosensor to detect Salmonella in food stuff

Tese de doutoramento Programa Doutoral em Engenharia Química e BiológicaFood- and waterborne illnesses are a serious public health concern worldwide and have stimulated research aiming at a rapid and accurate detection of pathogens by applying biosensing technologies. Salmonella, Campylobacter and E. coli are some examples of pathogens that have an enormous impact on public health. Many publications have mentioned different type of biosensors for a broad range of bacteria. These methods may circumvent the limitations that conventional microbiological techniques have. Pathogens of interest need culture enrichment steps to reach the detection limit, a process that requires time, as well as laboratory technicians with expertise skills. Detection of pathogens at a very early stage is not as easy as it seems, due to the necessity to unite a set of characteristics that enable the development of an inexpensive and robust biosensor. The ideal biosensing system should be rapid and accurate and should combine specificity and sensitivity, leading to a marginal amount of false positive or negative results. As the biosensor is composed of two parts, a biological and a sensor element, the biorecognition element of choice plays a crucial role when creating the perfect biosensor. Bacteriophages (or simply phages) are viruses that specifically recognize bacteria and this characteristic can be used as a potential "key" to solve problems related with bacterial detection. Moreover, the easy and low cost production of these viruses combined with their stability in harsh environmental conditions make them excellent competitors with other biological elements (e.g. antibodies, enzymes). The use of phages as a therapeutic agent and as an interface in detection systems has gained special interest of the research community. In many laboratories, phage-based platforms have been developed; however only a few have broken the barrier and went to the market as a clinical diagnostic tool. Nowadays, the food sector still uses conventional methods to detect Salmonella in food stuff that, as mentioned before, take times and requires expert skills. Notwithstanding the great improvements in the detection area, biosensing systems still lack sensitivity and give erroneous results. Furthermore, problems related to the detection of bacteria in a viable but nonculturable (VBNC) state is one of the concerns that can give false negatives. VBNC bacteria are not able to grow on standard bacteriological media, but are metabolically active, albeit very low, maintaining the capacity to cause diseases and therefore remain a potential risk in several health facilities and the food industry. The use of standard microbiological methods to detect if the bacterium is dead or alive is no practicable, since the presence of VBNC state is not detectable. Therefore, novel technologies that can overcome this barrier are imperative. The prevalence of this problem and the necessity of finding a detection technology that can fulfill the Salmonella detection needs, led to the proposal of the present work that explores phages as an interface in a magnetoresistive and magnetoelastic biosensor. The work presented herein describes the characterization of a broad host range lytic phage. PVP-SE1, is able to discriminate between cell viability states, including the VBNC condition. This phage was combined with highly sensitive magnetoresistive sensors originating a powerful detection system with highstandard performance at the accuracy, specificity but also sensitivity level, detecting bacteria concentrations in the order of 100 cells/μL (3-4 cells/sensor). Another strategy followed, aiming at circumventing the limitations of using whole phages in a biosensing interface, was the utilization of recognition peptides of phage origin, responsible for the identification of the hosts. The proof-of-concept was demonstrated with a model phage selected from landscape library as a streptavidin binder. The results showed that the streptavidin binding peptides extracted from the phage bind to streptavidin with the same or better affinity than the native phage. The same was demonstrated with the tail fibre proteins of phage PVP-SE1, heterologously expressed, which showed equal binding affinities compared to their parental phage. This work demonstrates how phages can be explored in the development of a biosensor, opening the possibility of using an accurate, sensitive, specific and cheaper device that can be applied to an emergent concern: foodborne pathogens.As doenças transmitidas através de alimentos e água contaminada são uma preocupação mundial e têm estimulado o desenvolvimento de métodos rápidos e precisos na área dos biossensores para a deteção de agentes patogénicos. Salmonela, Campylobacter e a E. coli são exemplos de espécies bacterianas patogénicos que tem um enorme impacto na saúde pública. Atualmente já existem diferentes tipos de biossensores desenvolvidos para uma ampla variedade de bactérias, que contornam as limitações das técnicas convencionais, tais como tempo de medida, devido à amplificação do microrganismo de interesse no seu adequado meio de cultura, e pela necessidade de técnicos com competências específicas. No entanto, a deteção de agentes patogénicos não é assim tão fácil como parece devido à necessidade de combinar um conjunto de características que permita o desenvolvimento de um biossensor robusto e pouco dispendioso. Um sistema de deteção ideal deve ser rápido, preciso e combinar características como especificidade e sensibilidade, de forma a conduzir a resultados livres de falsos positivos/negativos. Como o biossensor é composto por duas partes, i.e. um elemento biológico e um sensor, o elemento biológico escolhido tem um papel crucial no momento da criação de um biossensor perfeito. Bacteriófagos (ou simplesmente fagos) são vírus que infetam especificamente bactérias podendo essa característica ser utilizada como uma “chave” para solucionar problemas relacionados com a deteção de bactérias. Para além disso, a produção simples e económica destes vírus juntamente com a sua estabilidade em condições ambientais adversas, torna-os excelentes ferramentas de deteção, podendo competir com outros elementos biológicos (e.g. anticorpos, enzimas). A sua utilização como agentes terapêuticos e como interface em sistemas de deteção tem recebido uma atenção especial por parte da comunidade científica. Muitos laboratórios têm desenvolvido plataformas de deteção à base de fagos, no entanto, somente algumas conseguiram quebrar a barreira e entrar no mercado para serem usadas como ferramenta deteção para uso clinico. Hoje em dia, indústrias alimentares ainda usam métodos convencionais para detetar Salmonela na alimentação que, tal como previamente referido, são morosas e exigem mão de obra especializada. Mesmo utilizando diversas estratégias de deteção com diferentes plataformas e bio recetores, problemas com resultados falsos positivos e negativos permanecem difíceis de resolver. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis são uma preocupação, porque estão relacionadas com resultados falsos negativos. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis, não têm capacidade de crescer em meios de cultura convencional, mas encontram-se metabolicamente ativas, conservando a sua capacidade de causar doenças e de serem um potencial perigo em várias setores da saúde e na industria alimentar. Assim, a utilização de métodos de cultura padronizados para detetar se a bactéria está viva ou morta torna-se inviável, já que a presença de bactérias num estado viável, mas não cultivável não é detetada. Portanto, novas tecnologias que possam ultrapassar essa barreira são fundamentais. A prevalência deste problema e a necessidade de encontrar uma tecnologia de deteção que possa satisfazer as necessidades de deteção da Salmonela conduziu à proposta deste trabalho que explora os fagos como uma possível interface a usar em biossensores magneto-resistivos e magneto-elásticos. O trabalho presentado aqui descreve a caracterização de um fago lítico com um amplo espectro lítico, PVP-SE1. Este fago provou capacidade em discriminar os estados de viabilidade celular incluindo o estado viável, mas não cultivável. O fago foi combinado com sensores magneto-resistivos, que têm mostrado uma elevada sensibilidade. Esta combinação originou um poderoso sistema de deteção com um padrão de desempenho elevado, quer em termos de precisão e especificidade, quer em termos de sensibilidade, detetando concentrações de bactérias na ordem de 100 células/μL (3-4 células/sensor). Uma outra estratégia adotada, tendo por objetivo contornar as limitações da utilização dos fagos inteiros numa interface de um biossensor, passou pela utilização dos recetores dos fagos responsáveis pela identificação dos hospedeiros. Como prova de conceito um fago com especificidade de ligação à streptavidin foi selecionado a partir de uma biblioteca de fagos e usado como modelo. Os resultados demonstraram que os recetores do fago ligam-se à streptavidin com a mesma ou melhor afinidade do que o fago inteiro (original). O mesmo foi demonstrado com os recetores do fago PVP-SE1, demonstrando igualmente afinidades de ligação, comparativamente, com o seu fago parental. Este trabalho demonstrou como os fagos podem ser explorados no desenvolvimento de um biossensor abrindo a possibilidade de desenvolver um dispositivo preciso, sensível, específico e económico que possa ser aplicado a uma preocupação emergente: os patogénicos de origem alimentar

Magnetic components and microfluidics optimization on a Lab-on-a-chip platform

Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Sinais e Imagens Médicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Desde 1934, quando Moldovan criou o primeiro instrumento que poderia ser descrito como um citómetro de fluxo, este equipamento tornou-se um importante componente em várias especialidades dentro do laboratório clínico para o diagnóstico, prognóstico e monitorização de um número incontável de doenças. Esta tecnologia biofísica suspende entidades biológicas num fluxo de fluido, sinalizando-as usando reconhecimento biomolecular, para depois as detetar através de um aparelho de detecção eletrónica. Com o crescimento das técnicas de fabricação de semicondutores e microfluídos, foram e continuam a ser feitas muitas tentativas de criar citómetros de fluxo do tipo Lab-on-a-Chip (LOC), o que certamente irá afastar os equipamentos usados hoje me dia nos laboratórios por equipamentos usados in situ de custo e tamanho reduzidos, portáteis e sem necessidade de pessoal especializado. Após uma revisão bibliográfica das técnicas e princípios de funcionamento dos equipamentos já existentes foi possível perceber que a utilização de partículas magnéticas (PM) pode ter várias vantagens quando comparadas com o uso convencional de deteção por fluorescência, removendo assim a necessidade de integrar e alinhar componentes ópticos, permitindo uma medição direta e a construção de um citómetro de fluxo LOC com preparação, separação e deteção de amostras totalmente magnético. No INESC-MN foi feito um protótipo que permite a deteção de um tipo de PMs em tempo real a velocidades da ordem de cm/s usando sensores magnetoresistivos integrados em canais microfluídicos mas a primeira demonstração desta técnica para aplicações de citómetro foi realizada através da detecção de células Kg1-a marcadas com PMs de 50 nm que passaram, através de um canal microfluídico, sobre 3 sensores magnetoresistivos demonstrando que, para amostras de elevada concentração, pode ter a mesma eficiência que um hemocitómetro, mas com menor erro. Tendo como ambição um dispositivo LOC capaz de contar várias entidades biológicas na mesma amostra, um módulo de contagem com vários canais paralelos é necessário. Nesse sentido, foi projetado um novo chip com 4 colunas separadas por 3 mm, cada uma com 7 sensores do tipo válvula de spin (SV) com uma área de deteção de 100x4 μm2 distanciados 150 μm uns dos outros. Os sensores são abordados individualmente por uma linha de corrente de alumínio de 300 nm e passivados com 300 nm de nitreto de silicio. Alinhados com as colunas de sensores, 4 canais de polydimethylsiloxane (PDMS) com uma secção de 20 μm de altura e 100 μm de largura foram irreversivelmente colados ao chip por ultravioleta-ozono (UVO) criando o canal onde a amostra irá fluir. Para que as PMs sinalizem a sua passagem é necessário colocá-las sob um campo magnético forte o suficiente para induzir a sua magnetização e para que, consequentemente, as PMs emanem um campo marginal significativo. Aproveitando a insensibilidade das SVs às componentes perpendiculares ao seu plano (xy), aplica-se um campo magnético nesse sentido (z) para magnetizar as partículas. As PMs ao passarem sobre o sensor geraram um sinal bipolar devido ao campo marginal criado pela sua magnetização perpendicular. Como é apresentado na simulação do sinal, a amplitude do mesmo depende apenas da altura da partícula em relação ao sensor e da magnetização das mesmas, idealmente, uma saturação da magnetização das partículas e o máximo de proximidade aos sensores geraria a maior amplitude possível. O campo magnético perpendicular foi criado usando um magnete de neodímio posicionado sob a placa de circuito impresso (PCB), onde o chip do citómetro é colado e as ligações entre o chip e a PCB soldadas por ultrassons com fio de alumínio. Na abordagem usada em Loureiro et al., 2011, um magnete de 20 mm x 10 mm x 1 mm foi simplesmente colado sob a PCB, mas devido aos campos magnéticos serem sempre fechados as componentes x e y criam desvios nas curvas de transferência dos sensores deixando apenas 1 ou 2 sensores de uma coluna do chip operacionais. Numa abordagem seguinte foi usado um magnete 20 mm x 20 mm x 3 mm distanciado 2 cm abaixo da PCB, isto tornou as curvas de transferência dos sensores adequadas para medição, mas fez com que a componente z do campo magnético não fosse grande o suficiente para que as PMs emanassem um campo magnético suficientemente forte. Percebendo as falhas de cada uma das configurações anteriores, foram feitas simulações do campo magnético que iria influenciar o chip originado por magnetes de vários tamanhos a várias distancias para perceber qual conseguiria fornecer uma maior área em que as componentes x e y fossem menores que 10 Oe e em que a componente z fosse de pelo menos 1 kOe. Através das simulações foi concluído que o magnete de 20 mm x 10 mm x 1 mm o mais próximo possível do chip seria a melhor solução, mas que um alinhamento preciso seria necessário. Para esse fim, foi fabricado numa fresadora um sistema de alinhamento em PMMA. Para que o alinhamento fosse o correto foram feitos 4 furos de alinhamento no sistema de PMMA e na PCB e para reduzir a distancia ao máximo foi feita uma bolsa na PCB da mesma área que o chip deixando a distancia do magnete aos sensores de 1 mm (0.3 mm de PCB + 0.7 mm de substrato de silício). Com isto, o alinhamento em x foi conseguido, mas para alinhar em y foi criado um trilho no sistema de PMMA onde o magnete pudesse deslizar, controlando-o pela rotação de um parafuso com passo de 0.5 mm. Para colocar o magnete na posição ideal, foi medida consecutivamente a curva de transferência do 4º sensor de uma das colunas, num campo magnético de -141 Oe a 141 Oe, até que este tivesse um campo de acoplamento efectivo (Hf) de aproximadamente 0 Oe, o que significa que a curva de transferência estaria perfeitamente centrada em zero e criaria um sinal bipolar perfeito. Após o alinhamento e posicionamento do magnete, todos os sensores foram caracterizados e, nesses resultados, podemos ver perfeitamente o efeito das componentes x e y do magnete. Com o lado longo do magnete paralelo ao lado longo das SVs e alinhado de forma que o Hf fosse o mais próximo de 0 Oe no 4º sensor de uma coluna, percebemos que a componente x (lado longo) do campo magnético criado pelo magnete tem efeitos na sensibilidade dos sensores fazendo com que esta caia à medida que nos afastamos do centro do magnete. Enquanto que a componente y tem efeitos sobre o Hf dos sensores tornando-o mais positivo à medida que medimos a 3ª, 2ª e 1ª linha de sensores e tornando-o mais negativo quando medimos a 5ª, 6ª e 7ª linha. São também apresentadas simulações dos canais microfluídicos para perceber como a velocidade das partículas afeta o sinal e qual a velocidade máxima permitida para que placa de aquisição eletrónica seja capaz de o detetar. Com estas conclusões, um novo chip foi desenhado e fabricado. Neste novo chip a distância entre as colunas de SVs foi reduzida para apenas 1 mm, o que obrigou também à alteração dos canais microfluídicos, ao tamanho do chip e da estrutura de PDMS. Também são apresentadas simulações que mostram que se um segundo magnete, alinhado com o primeiro, for colocado sobre os canais microfluídicos poderá melhorar a magnetização e a homogeneidade do campo, o que permitirá que os 4 canais tenham a mesma sensibilidade e um desvio padrão de Hf menor. Todos os antecedentes teóricos, os métodos de microfabricação e técnicas de caracterização usados são apresentados e descritos.The diagnosis, prognosis and monitoring of diseases serves for the only purpose of preserving and improving life. Being this the greatest objective of the human kind, since ever that efforts have been made to better our ways to do that. One of those, a very important component in several specialties within the clinical laboratory is the flow cytometer, a biophysical technology which uses biomolecular recognition to sort and count biological entities by suspending them in a stream of fluid and detecting them through an electronic detection apparatus. The improvement of the semiconductor and microfluidic fabrication techniques have created the chance to bring the expensive, specialized and bulky equipment out of the laboratories and generate new machines able of having the same efficiency but with smaller price, size, allowing portability and removing the need for specialized personnel. This is the concept behind the next generation of in pointof- care apparatus, the La-on-a-Chip (LOC). At INESC-MN it is understood the potential that magnetic particles (MP) have in a LOC flow cytometer and as such a real-time detection of single magnetic particles magnetoresistive based cytometer was prototyped. Demonstration of this technique for cytometer applications was accomplished by indicating that for high concentration samples it can have the same efficiency as the hemocytometer method but with lesser error. This thesis has as objective the optimization of the magnetic and microfluidic components of a LOC to allow the parallelization of measurements and enabling the real-time measurement of different particles at the same time. For this purpose, a bibliographic review of the theoretical backgrounds, of the fabrication and characterization techniques, of the different detecting principles and of the already existing magnetoresistive counting modules was made to get a deeper understanding of the optimization possibilities. The present work describes the above-mentioned platform for dynamic detection of magnetic labels with a magnetoresistive based flow cytometer, where a permanent magnet is used to magnetize the labels enabling them to trigger the sensor. Several simulations of the magnetic fields created by the permanent magnet and the microfluidic channels were done and analyzed in order to characterize the MPs signal, understand which would be the best positioning of these components and which fluid velocities would be in the range of the electronic read-out capabilities. This study led to the fabrication of a micromachined polymethylmethacrylate (PMMA) alignment system to correctly position the permanent magnet under the cytometer’s chip. This made the control over the magnet’s positioning more sensible and thus reducing the influence of its unwanted magnetic components on the chip. The approximation of the magnet to the chip enhanced the signal by optimizing the MPs magnetization and consequently the signal amplitude, the precise alignment corrected the sensors response by improving its sensitivity and removing them from saturation states. Through this new setup all the sensors in the chip became operational. Finally, using the several techniques of microfabrication also describe in this thesis, a new chip was designed and fabricated to improve even more the sensors sensitivity and consequently augment the number of the cytometer’s counting channels

Microfluidic Systems for Pathogen Sensing: A Review

Rapid pathogen sensing remains a pressing issue today since conventional identification methodsare tedious, cost intensive and time consuming, typically requiring from 48 to 72 h. In turn, chip based technologies, such as microarrays and microfluidic biochips, offer real alternatives capable of filling this technological gap. In particular microfluidic biochips make the development of fast, sensitive and portable diagnostic tools possible, thus promising rapid and accurate detection of a variety of pathogens. This paper will provide a broad overview of the novel achievements in the field of pathogen sensing by focusing on methods and devices that compliment microfluidics

Microfluidic applications of functionalized magnetic particles for environmental analysis: focus on waterborne pathogen detection

The continuous surveillance of drinking water is extremely important to provide early warning of contamination and to ensure continuous supplies of healthy drinking water. Isolation and detection of a particular type of pathogen present at low concentration in a large volume of water, concentrating the analyte in a small detection volume, and removing detection inhibiting factors from the concentrated sample, present the three most important challenges for water quality monitoring laboratories. Combining advanced biological detection methods (e.g., nucleic acid-based or immunology-based protocols) with microfluidics and immunomagnetic separation techniques that exploit functionalized magnetic particles has tremendous potential for realization of an integrated system for pathogen detection, in particular, of waterborne pathogens. Taking advantage of the unique properties of magnetic particles, faster, more sensitive, and more economical diagnostic assays can be developed that can assist in the battle against microbial pathogenesis. In this review, we highlight current technologies and methods used for realization of magnetic particle-based microfluidic integrated waterborne pathogen isolation and detection systems, which have the potential to comply in future with regulatory water quality monitoring requirement

Biosensors for European zoonotic agents: a current Portuguese perspective

Emerging and recurrent outbreaks caused by zoonotic agents pose a public health risk. They result in morbidity and mortality in humans and significant losses in the livestock and food industries. This highlights the need for rapid surveillance methods. Despite the high reliability of conventional pathogen detection methods, they have high detection limits and are time-consuming and not suitable for on-site analysis. Furthermore, the unpredictable spread of zoonotic infections due to a complex combination of risk factors urges the development of innovative technologies to overcome current limitations in early warning and detection. Biosensing, in particular, is highlighted here, as it offers rapid and cost-effective devices for use at the site of infection while increasing the sensitivity of detection. Portuguese research in biosensors for zoonotic pathogens is the focus of this review. This branch of research produces exciting and innovative devices for the study of the most widespread pathogenic bacteria. The studies presented here relate to the different classes of pathogens whose characteristics and routes of infection are also described. Many advances have been made in recent years, and Portuguese research teams have increased publications in this field. However, biosensing still needs to be extended to other pathogens, including potentially pandemic viruses. In addition, the use of biosensors as part of routine diagnostics in hospitals for humans, in animal infections for veterinary medicine, and food control has not yet been achieved. Therefore, a convergence of Portuguese efforts with global studies on biosensors to control emerging zoonotic diseases is foreseen for the future.Centro de Investigação Desenvolvimento e Inovação da Academia Militar (CINAMIL) from Academia Militar/Instituto Universitário Militar by project SIPA (Sistema Integrado de Proteção Alimentar)info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Nanocomposite polymer beads for cell detection

Circulating tumor cells (CTCs) may induce metastases when detached from the primary tumor. The numbers of these cells in blood offers a valuable prognostic indication. Magnetoresistive sensing is an attractive option for CTC counting. In this technique, cells are labeled with nancomposite polymer beads that provide the magnetic signal. Bead properties such as size and magnetic content must be optimized in order to be used as a detection tool in a magnetoresistive platform. Another important component of the platform is the magnet required for proper sensing. Both components are addressed in this work. Nanocomposite polymer beads were produced by nano-emulsion and membrane emulsification. Formulations of the oil phase comprising a mixture of aromatic monomers and iron oxide were employed. The effect of emulsifier (surfactant) concentration on bead size was studied. Formulations of polydimethilsiloxane (PDMS) with different viscosities were also prepared with nano-emulsion method resulting in colloidal beads. Polycaprolactone (PCL) beads were also synthetized by the membrane emulsification method. The beads were characterized by different techiques such as dynamic light scattering (DLS), thermogravimetric analysis (TGA) and scanning electron microscopy (SEM). Additionally, the magnet dimensions of the platform designed to detect CTCs were optimized through a COMSOL multiphysics simulation