Analysis and representation of test cases generated from LOTOS

Cataloged from PDF version of article.This paper presents a method to generate, analyse and represent test cases from protocol specification. The language of temporal ordering specification (LOTOS) is mapped into an extended finite state machine (EFSM). Test cases are generated from EFSM. The generated test cases are modelled as a dependence graph. Predicate slices are used to identify infeasible test cases that must be eliminated. Redundant assignments and predicates in all the feasible test cases are removed by reducing the test case dependence graph. The reduced test case dependence graph is adapted for a local single-layer (LS) architecture. The reduced test cases for the LS architecture are enhanced to represent the tester's behaviour. The dynamic behaviour of the test cases is represented in the form of control graphs by inverting the events, assigning verdicts to the events in the enhanced dependence graph. © 1995

Viroids : minimal genetic systems : (RNA, plant pathogens, replication, pathogenesis)

SViroids are nucleic acid species of relatively low molecular weight and unique structure that cause several important diseases of cultivated plants. Viroids are the smallest known agents of infectious disease. Unlike viral nucleic acids, viroids are not encapsidated. Despite their small size, viroids replicate autonomously in cells of susceptible plant species. Known viroids are single stranded, covalently closed circular, as well as linear, RNA molecules with extensive regions of intramolecular complementarity; they exist in their native state as highly base pairedrods. The biological properties of viroids are determined by their primary structures; viroids thus constitute genetic systems of minimal complexity.T. O. DIENER, Plant Virology Laboratory, Plant Protection Institute, Science and Education Administration, U.S. Department of Agriculture, Beltsville, MD

Working Together on Groundnut Virus Diseases Summary and recommendations of a meeting of international working groups on groundnut virus diseases 15-19 Aug 1993

At a meeting organized by ICRISAT in cooperation wi t h the Peanut Collaborative Research Support Program (Peanut CRSP) and the Virology Department , Scottish Crop Research Institute (SCRI), UK, scientists f rom 11 countries, representing the three working groups—'Groundnut viruses in Asia-Pacific region', 'Groundnut viruses in Af r ica' , and 'Transformation and regeneration of groundnut, and utilization of viral genes to induce resistance to virus diseases'—reviewed the progress made by the three working groups since their last meetings. Following general discussion, recommendations were made for global cooperative research on groundnut viruses, and specific recommendations for collaborative research were listed for each working group

Changing the ligand-binding specificity of E. coli periplasmic binding protein RbsB by rational design and screening

Periplasmic binding proteins (PBPs) form a superfamily of bacterial proteins with a conserved bilobal structure, which are involved in substrate scavenging for bacterial cells. A wide variety of natural ligand-binding domains has evolved. PBPs are composed of two domains connected by a hinge region, which form a binding pocket between the two domains. They can be found in two stable conformations; in absence of ligand the PBP adopts an open conformation, where the binding pocket is exposed. In presence of the ligand, the protein changes to the closed conformation where the ligand is buried in the middle of the protein. This project focused on the ribose-binding protein of Escherichia coli (RbsB). Ribose binding to RbsB stabilizes the closed state. RbsB-bound ribose is presented to a cytoplasmic transport channels (RbsAC), from where it is imported into the cell, or interacts to membrane receptors (i.e., Trg) and can elicit a chemotactic signal. Due to their unique ligand-binding characteristics and wide variety of natural binding pockets PBPs have been of interest for the development of biosensors and bioreporter systems. PBP bioreporters were initiated over 20 years ago by a development in the group of Hazelbauer, who fused the C-terminal part of the E. coli EnvZ osmoregulation histidine kinase to the N-terminal part of the Trg methyl-accepting chemotaxis receptor protein, creating a hybrid receptor Trz1. Ligand bound galactose-binding protein (GBP) and ribose-bound RbsB interact with Trz1, which eventually leads to phosphorylation of the response regulator OmpR, activating transcription from the ompC promotor (and any reporter gene fused to this). In 2003, Hellinga’s group proposed that based on crystal structure information of ligand-bound PBPs variants with new ligand recognition specificities could be designed by computational approaches. Notably, they claimed the design of a RbsB-variant with nM affinity for recognition of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). This idea inspired the scientific community, because it could easily extend PBP-binding to a tremendous variety of compounds, including non- natural molecules, and would thus permit a wide variety of biosensor and bioreporter systems based on RbsB/GBP and Trz1. Unfortunately, independent engineering of some of the most promising published mutants failed to reproduce the reported in vivo and in vitro results. These studies further concluded that the published variants were actually misfolded proteins and/or impaired in stability as result of the introduced ligand-pocket mutations. This fact was largely ignored by Hellinga’s publications. Still inspired by the concept and trying to understand the reason of such limited success, our group raised the hypothesis that changing from ribose to TNT in a single step was likely unfeasible, but given the wide range of naturally evolved PBP ligand binding pockets, a step by step change of ribose binding to a non-natural analogue should be possible. To test this, we selected compounds with distinct differences but still chemically similar to ribose: 1,3-cyclohexanediol (13CHD) and cyclohexanol (CH). Mutant ligand binding pockets that might accommodate 13CHD and/or CH were computationally simulated and calculated using Rosetta, from which a list of critical amino acid residues to mutate in RbsB was selected. These were then synthesized and cloned into E. coli; a resulting set of 2 million mutants containing one of five possible substitutions at each of 9 selected critical amino acid positions. The library was introduced into an E. coli bioreporter strain, which carries the Trz1 hybrid signaling pathway coupled to GFP production when the (new) ligand would bind the (mutant) RbsB. The main goals of this work were to screen and characterize mutants from this first library, and potentially improve mutants for the new ligand binding in further rounds of mutagenesis. In the first part of this work a precise and user-friendly high-throughput strategy to screen the mutant library was developed. Clones were grown as individual microcolonies in alginate beads, to reduce single cell GFP expression variability, which were screened by fluorescence activated cell sorting (FACS) for gain-of-function GFP expression in presence of 13CHD. Six mutants with modest (1.5- fold) but consistent induction with 1 mM 13CHD were isolated. Moreover, these mutants completely lost the capacity to react to ribose. The RbsB mutants were characterized in terms of periplasmic space abundance, stability, secondary structure and ligand affinity. Isothermal microcalorimetry confirmed 13CHD binding, although only two mutants were sufficiently stable upon purification. Circular dichroism and quantification of periplasmic space abundance suggested the mutants to be prone to misfolding and/or defects in translocation. In the second part of this work, we used random and semi-random mutagenesis to improve the affinity and/or stability of the six isolated mutants with 13CHD binding capacity. Several mutant libraries were produced and screened with the previous described strategy. Variants displaying higher expression levels of GFP in presence of 13CHD were collected by FACS, and were used as starting point for the next round of evolution. This mutagenesis and rigorous screening strategy allowed us to isolate 7 mutants with improved (3.2-fold) GFP induction in presence of 13CHD and in a concentration- dependent manner. Several variants were observed that displayed open and closed conformations simultaneously, suggesting they were impaired in transition dynamics. Moreover, our screening strategy largely ignores potential variants with improved binding and closed conformation stability, but that are unable to interact with Trz1 receptor (e.i., trigger the signaling cascade). Finally in the third part of this work, we developed and tested an in vivo system to characterize the quality of the translocation process and receptor interactions. Wild-type- and mutant-RbsB proteins were fused to mCherry reporter protein to study protein abundance and subcellular localization. Whereas RbsB-mCherry proteins clearly localized to the periplasmic space and centered in polar regions depending on chemoreceptor availability, mutant-RbsB-mCherry expression resulted in high proportions of cells devoid of clear foci and low proportions of cells with multiple fluorescent foci, suggesting poorer translocation and mislocalisation. In addition, polar foci of mutants were less fluorescent, suggesting poorer chemoreceptor binding. By spiking further derivative mutant libraries generated by error-prone PCR without or with different proportions of E. coli expressing wild-type RbsB-mCherry we could estimate the potential improvement and deterioration of mutants with wild- type-like periplasmic localisation. The in vivo translocation system may thus be used to detect mutants with better signal transduction capacity. In conclusion, we firmly showed that design of PBP receptor proteins with new binding capacities for non-natural compounds is feasible, but still largely a matter of trial and error. The combination of computational simulations, random mutagenesis and rigorous screening allowed us to isolate variants with new recognition for 13CHD and loss of ribose binding. However, our results also showed that most predicted ligand-binding pocket mutations lead to poorly folding and functioning proteins, and it is likely that the dynamic transition needed between open and closed conformations of (here) RbsB is insufficiently understood and currently predictable to allow rational expansion to a wide range of new ligands. -- Les protéines de liaison périplasmiques (PLP) constituent une superfamille de protéines bactériennes avec une structure bilobée. Elles sont impliquées dans la captation de substrats pour les cellules bactériennes, et montrent grande diversité de domaines de liaison à des composés naturels. Les PLP sont composées de deux domaines connectés par une région charnière, ce qui forme une poche de liaison au substrat entre les deux domaines. Les PLP montrent deux états stables : ouverte en l’absence de ligand, conformation dans laquelle la poche de liaison est exposée, et fermée quand le ligand est séquestré dans la poche de liaison. Ce projet a porté sur l’étude de la PLP RbsB liant le ribose chez Escherichia coli. La liaison du ribose stabilise l’état fermé de RbsB et permet l’interaction avec le transporteur cytoplasmique RbsAC et son passage dans le cytoplasme de la cellule, ou son interaction avec des récepteurs membranaires tels que Trg permettant en une réponse chimiotactique. Étant données leurs caractéristiques uniques de liaison aux ligands et la grande variété de poches de liaison naturellement observée chez les PLP, elles présentent un grand intérêt pour le développement de biosenseurs et de systèmes biorapporteurs. Les premiers biorapporteurs basés sur des PLP ont été développés 20 ans auparavant par le groupe de Hazelbauer. Cette équipe a fusionné la partie C-terminale de la protéine kinase à histidine impliquée dans l’osmorégulation (EnvZ) et l’extrémité N-terminale du récepteur chimiotactique accepteur de groupement méthyle (Trg), pour créer le récepteur hybride Trz1. Les PLP liant le galactose (GBP) et le ribose (RbsB) interagissent avec Trz1, ce qui entraine la phosphorylation du régulateur réponse OmpR qui lui-même va activer la transcription à partir du promoteur du gène ompC (ou n’importe quel système rapporteur placé en aval de ce promoteur). En 2003, le groupe de Hellinga proposait que, sur la base de la structure cristallographique de différents PLP liées à leur ligand, des variants reconnaissant de nouveaux ligands pourraient être générés sur la base d’une approche informatique. En particulier, cette équipe se targue d’avoir générer un variant de RbsB permettant de lier le 2,4,6-trinitrotoluène (TNT) avec une affinité de l’ordre du nanomolaire. Cette idée a inspiré la communauté scientifique car cette approche pourrait s’étendre à une diversité incroyable de composés naturels ou non, ce qui permettrait le développement de biosenseurs et biorapporteurs variés basés sur ce système. Malheureusement, la construction des mutants les plus prometteurs par des équipes indépendantes n’ont pas permis de rapporter de l’activité in vivo et/ou in vitro. Cela a été ignoré dans les publications du groupe Hellinga. Inspirés par ce concept et voulant savoir quelles étaient les raisons de ce succès quelque peu limité, notre groupe a émis l’hypothèse que le changement de spécificité de RbsB du ribose au TNT en une étape était probablement infaisable mais, étant donnée la grande diversité de poches de liaisons naturellement observées chez les LPL, un changement pas à pas du ribose vers un composé analogue non naturel devrait être possible. Pour tester cela, nous avons sélectionné des composés distincts du ribose mais présentant tout de même des similarités : 1,3-cyclohexanediol (13CHD) and cyclohexanol (CH). Des mutants qui pourraient accueillir le 13CHD et/ou CH ont été générés par simulation informatique en utilisant le programme Rosetta, lequel a fourni une liste d’acides aminés critiques à muter. Une librairie de mutant a été synthétisée, celle-ci contenant 2 millions de variants de RbsB avec 1 substition parmi 5 possibles à 9 positions sélectionnées pour leur aspect critique dans la reconnaissance du substrat. La librairie a été introduite et criblée chez une souche reportrice d’E. coli contenant la chaine de signalisation hybride Trz1 couplée à la production de la protéine fluorescente verte (GFP) lorsque le (nouveau) ligand se liera à la protéine RbsB (sauvage ou mutante). Le but principal de ce travail était de caractériser cette librairie de mutants, et éventuellement d’améliorer la capacité de ces mutants à lier un autre composant par des cycles de mutagénèses additionnels. Dans la première partie de ce travail, une stratégie simple et efficace pour cribler la librairie de mutant a été développée. Les différents clones/variants ont été cultivés individuellement en microcolonies dans des billes d’alginate afin de réduire la variabilité du signal GFP observé au niveau de la cellule unique. Les billes ont été analysées par trieur de cellules reposant sur la fluorescence (FACS) afin de détecter des mutants présentant une activité GFP accrue en présence de 13CHD. Six mutants ont été isolés pour leur modeste mais significative induction (1,5 fois) en présence de 1 mM de 13CHD. De plus, ces mutants avaient totalement perdu leur capacité à réagir au ribose. Les mutants RbsB ont été caractérisés plus en détails pour leur localisation dans périplasme, leur stabilité, leur abondance et leur affinité pour le ligand. La technique de microcalorimétrie isotherme a confirmé que ces mutants lient le 13CHD, bien que seulement 2 de ces protéines mutantes se soient révélées suffisamment stables après purification. L’analyse par dichroïsme circulaire et la quantification de l’abondance des protéines dans l’espace périplasmique suggèrent que les protéines mutantes sont sujettes à un mauvais repliement et/ou un problème dans la translocation du cytoplasme au périplasme. Dans une seconde partie, nous avons muté les six mutants isolés précédemment de façon aléatoire ou semi-aléatoire afin d’améliorer leur affinité pour le 13CHD et/ou leur stabilité. Plusieurs librairies de mutants ont été produites et analysées selon la méthode décrite plus tôt. Les variants montrant une plus forte expression du système rapporteur GFP en présence de 13CHD ont été isolés par FACS, et utilisés comme point de départ pour la prochaine étape d’évolution. Cette mutagénèse et l’analyse rigoureuse des librairies nous ont permis d’isoler 7 mutants avec une augmentation de 3,2 fois du signal GFP en présence de 13CHD, et d’une façon dose-dépendante. Plusieurs variants ont montré qu’ils adoptaient la conformation ouverte et fermées au sein de la population bactérienne. Cette dernière observation suggère que ces mutants sont affectés dans leur capacité à passer d’une conformation à l’autre. De plus, notre stratégie de crible ne tient pas compte les variants qui montreraient une liaison accrue et une bonne stabilité de la conformation fermée, mais qui seraient incapables d’interagir avec le récepteur Trz1 (et donc de déclencher la cascade de signalisation du rapporteur). Finalement, dans la troisième partie de ce travail, nous avons développé et testé un système in vivo permettant de caractériser la qualité du processus de translocation dans l’espace périplasmique et l’interaction avec les récepteurs. Les protéines RbsB sauvage et mutantes ont été fusionnées à la protéine fluorescente rouge mCherry afin de visualiser l’abondance et la localisation sub-cellulaire des protéines au niveau de la cellule unique en utilisant la microscopy à épifluorescence et le traitement des images obtenues. Alors que la protéine de fusion RbsB sauvage montre une localisation périplasmique centrées au niveau des pôles de la cellule dépendamment de la disponibilité des chimiorécepteurs, les fusions avec les variants de RbsB montraient une forte proportion de cellules dépourvues de foci, et une faible proportion de cellules avec de multiples foci, suggérant une plus faible liaison aux chimiorécepteurs. En analysant plus en détails des librairies de mutants générées par PCR mutagène, en mélangeant ou non avec des cellules contenant la protéine de fusion RbsB sauvage, nous avons pu estimer l’amélioration potentielle ou la détérioration des qualités des mutants RbsB par rapport au sauvage en terme de localisation périplasmique. Ce système de translocation in vivo pourrait être utilisé afin de détecter des mutants permettant une meilleure transduction du signal. En conclusion, nous avons montré que la conception de protéines réceptrices PLP présentant de nouvelles capacités de liaison pour des composés non naturels est bien faisable, mais repose encore sur une stratégie d’essais et erreurs. La combinaison de simulations informatiques, de mutagénèses aléatoires et de crible rigoureux nous a permis d’isoler des variants de RbsB avec une capacité à reconnaitre le 13CHD, tout en ne liant plus le ribose. Néanmoins, nos résultats ont également montré que la plupart des prédictions de mutations au niveau de la poche de liaison ont mené à un mauvais repliement ou fonctionnement des protéines. Il est très probable que la dynamique de transition entre la conformation ouverte et fermée (de RbsB pour cette étude) ne soit pas encore assez bien comprise, et donc actuellement non prédictable pour permettre le test d’une grande variété de nouveaux ligands

Molecular Cloning of Sugarcane Mosaic Virus Complementary-Dna: Use as a Probe for the Detection of Virus Infection and Viral-Rnas.

DNA complementary (cDNA) to the RNA genome of sugarcane mosaic virus strain H (SCMV-H) was synthesized using avian myeloblastosis virus reverse transcriptase and oligo(dT) as primer. Second strand synthesis used the same enzyme and oligo(dG) primer after tailing the first strand with oligo(dC). Double-stranded cDNA was inserted into the PstI site of plasmid pBR322 by the G-C tailing method and cloned in Esherichia coli HB101. Twenty recombinant clones containing SCMV-H sequences were obtained, but most had inserts less than 500 base pairs (0.5 kbp). Two plasmids, S47-6 and S47-20, however, had larger inserts of 1.2 kbp and 2.7 kbp, respectively and were used for further study. These two plasmids had some SCMV-H sequences in common, but did not share any BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, or SalI restriction sites. Dot blot hybridization, which involves spotting crude plant extracts on nitrocellulose filters and hybridizing with (\u2732)P-labeled recombinant S47-6 or S47-20 plasmid DNA, proved to be a rapid and sensitive method for detecting SCMV-H infection. Sap from SCMV-infected plants diluted 1/1000 to 1/3000 gave detectable hybridization signals as did 15 to 40 pg purified viral RNA. Dot blot hybridization also revealed that SCMV strain I, but not SCMV strains A, B, D, M, and J, has sequences in common with the strain H-derived clones. Northern hybridization of single-stranded RNA from SCMV-infected tissue showed that, besides genomic RNA, a series of smaller RNAs with sizes of 7.9, 6.6, 4.7, 2.8, 1.5, 1.2, 0.9, and 0.7 kb hybridized to the probe. No discrete viral double-stranded RNA species were found. Serologically specific electron microscopy of plant extracts was used to demonstrate a series of discrete less-than-full-length virus particles, two of which correlate with the 7.9 and 6.6 kb RNAs