Expression der Matrix-Metalloproteinasen MMP-2, -7, -9 und -13 und ihrer Inhibitoren TIMP-1, -2 und -3 in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes

Plattenepithelkarzinome des oberen Aerodigestivtraktes stehen in Europa an sechster Stelle in der Häufigkeit ihres Auftretens und weisen in fortgeschrittenen Stadien trotz moderner Behandlungsmethoden eine relativ geringe 5-Jahres-Überlebensrate auf. Diese ist vor allem auf die hohe, in der Regel lymphogene Metastasierungsfrequenz zurückzuführen. Um bereits präoperativ das Risiko einer möglichen Metastasierung und die Aggressivität des Tumorwachstums einzuschätzen, zielen die Bemühungen verschiedener Arbeitsgruppen auf die Etablierung molekularer Marker. Besonderes Interesse gilt hierbei seit einigen Jahren der Gruppe der Matrix-Metalloproteinasen. Matrix-Metalloproteinasen bezeichnen eine Familie substratspezifischer Endopeptidasen, denen ein Zinkionen-Komplex im aktiven Zentrum gemeinsam ist. Alle Mitglieder der Familie können, neben anderen biologischen Funktionen, Bestandteile der Extrazellularmatrix abbauen. Die Regulation dieser Enzyme verläuft auf verschiedenen Ebenen, unter anderem durch spezifische Inhibitoren der aktiven Enzyme, TIMPs. Aufgrund ihrer Fähigkeiten kommen Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren eine tragende Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen zu, so auch in der Ausbreitung und Metastasierung maligner Tumoren. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Überwindung von Basalmembranen zur Metastasierung. Die MMPs -2 und -9 sind in der Lage, neben anderen Substraten das in Basalmembranen auftretende Kollagen IV abzubauen. Diese Fähigkeit besitzen die übrigen MMPs nicht. Auf diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Dissertation die RNA-Expression von MMP–2, -7, -9 und –13, sowie von TIMP–1, -2 und –3 in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes sowie in Plattenepithelkarzinom-Zelllinien untersucht. RNA aus 30 Gewebeproben und sieben Zelllinien wurde extrahiert, mit Hilfe von RT-PCR und Gel-Elektrophorese dargestellt, die Ergebnisse semiquantivativ erfasst und statistisch ausgewertet. MMP- und TIMP-RNA war sowohl in den Gewebeproben als auch in den Zelllinien nachweisbar. Von den MMPs war MMP–13 am häufigsten und stärksten nachweisbar, MMP-2 am schwächsten. Die drei TIMPs konnten in allen Fällen nachgewiesen werden. Statistisch signifikante Korrelationen fanden sich zwischen MMP-13 und dem Lymphknotenstatus, MMP-13 und TIMP-2, sowie MMP-9 und dem Fernmetatsasenstatus. Des weiteren ergaben sich Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen stärkeren MMP-2 und –9 RNA-Signalen und einem fortgeschrittenen Tumorstadium. Der Nachweis der betrachteten RNA in den Zelllinien war dem der Gewebeproben ähnlich; allerdings waren die Signale für die jeweilige RNA insgesamt schwächer. Korrelationen von MMP-Signalen mit Primärtumor-Lokalisationen ließen sich nicht aufweisen, ebenso wenig kongruente Muster innerhalb der MMP-Signale. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zusammenfassend lässt sich eine Rolle der untersuchten MMPs und TIMPs für das Invasions- und Metastasierungsverhalten von Karzinomen der oberen Luft- und Speisewege annehmen. Ihr prognostisches Potential ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt jedoch noch nicht abschließend geklärt

Untersuchung zellulärer und humoraler Immunparameter bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-/Halsbereich in Abhängigkeit von Tumorstadium und Therapieform

Im Rahmen einer klinische Studie wurden bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf­/Halsbereich Lymphozyten­Subpopulationen phänotypisch und funktionell charakteri- siert sowie deren Aktivierungszustand anhand der Bestimmung des Interleukin­2­Titers und der Konzentration von löslichem Interleukin­2­Rezeptor a (sIL­2Ra) im Plasma gemessen. Hierbei interessierte der Einfluß des Tumors bzw. der Therapieformen wie Operation, Che­ mo­, Bestrahlungstherapie und kombinierte Radio­Chemotherapie auf diese immunologischen Parameter. Die Zusammensetzung der Populationen peripherer Blutlymphozyten wird durch die Größe und Malignität des Primärtumors sowie durch Lymphknotenmetastasen beeinflußt. In der An­ fangsphase, bei einer Tumormalignität G1, ist eine starke Reduzierung der LAK­Zellaktivität zu sehen, was mit suppressiven Faktoren, wie zum Beipiel Prostaglandin­E2, abgesondert von Monozyten, in Verbindung gebracht werden könnte. Der Anteil CD3­positiver Zellen ist im G3­Stadium sehr stark erniedrigt und deutet auf eine Herunterregulierung der zu dem CD3­ Komplex gehörenden e­Kette hin. Weiterhin war bei den HNO­Tumorpatienten der Anteil der CD4­Lymphozyten auffällig erniedrigt, während die Zahl der doppeltpositiven CD4 CD8 ­ Zellen sowie die HLA­DR­Werte erhöht war. Einen Monat nach einem operativen Eingriff ließ sich eine starke Zunahme der CD25­ Expression, besonders auf T­Lymphozyten erkennen. Die Chemotherapie mit Cisplatin, Fo­ linsäure, 5­FU, Fortecortin ­ eine sogenannte Polychemotherapie ­ bewirkte eine starke Erhö­ hung der NK­Zellpopulation und eine höhere Expression des CD25­Markers auf NK­Zellen sowie eine Zunahme der LAK­Zellfunktion. Die Veränderung der NK­Zellpopulation ist wahrscheinlich auf den Einsatz von Cisplatin und 5­FU zurückzuführen. Die Bestrahlungsthe­ rapie bewirkte eine signifikante Abnahme der T­Lymphozyten, besonders der CD4­T­ Helferzellen, bei gleichzeitiger Zunahme der CD4 CD8 ­positiven Zellen. B­Zellen sind g­Strahlen sensitiv, so daß unter Bestrahlung ihr Anteil vermindert wird. Die Erhöhung der NK­Zellpopulation ist wahrscheinlich auf eine Radioresistenz dieser Lymphozytensubpopula­ tion zurückzuführen. Die Radio­Chemotherapie beinhaltet drei Zyklen mit einem Zytostatika­ gemisch: Cisplatin, 5­FU, Folinsäure, Dexametason, Rescuvolin und Fortecortin und an­ schließender Behandlung mit g­Strahlen. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen deutlich, daß es unter dieser Radio­Chemotherapie zu einem signifikanten Abfall der CD3­ und CD2­positiven Zellen, besonders der zytotoxi­ schen T­Zellpopulation, sowie zu einer Erhöhung der CD25­exprimierenden Zellen kommt. Die Beziehungen der Zellen untereinander sind unter Operation, Betrahlung­ und Radio­ Chemotherapie nicht verändert, die Chemotherapie verursacht jedoch vermutlich ein Un­ gleichgewicht zwischen T­Helferzellen und Makrophagen bezüglich der Vermehrung von NK­Zellen. Bei Patienten ohne Therapie kam es zu einer Abnahme der CD3­positiven Zellen. Dies unterstützt die Hypothese der Herunterregulierung der e­Kette des CD3­Komplexes unter Tumoreinwirkung. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß die alleinige Bestimmung des Interleukin­2 Proteins keine Auskunft über die Wirkung des Tumors auf die Sezernierung dieses Peptids bei einer Tumorlokalisation im Gaumen­ und Zungenbereich gibt. Erst im Verlauf der Erkrankung können Änderungen durch virale Infektionen und der Einfluß verschiedener Therapiemodali­ täten beobachtet werden. Die Konzentration von sIL­2Ra verhielt sich proportional zur Tumorgröße. Dies unterstützt die Hypothese, daß dieser Rezeptor eher vom Tumor abstammt und nicht von den infiltrierten Lymphozyten. Die Konzentration von sIL­2Ra im Plasma war abhängig von der Therapieart. Sie erreichte wesentlich höhere Werte bei Tumorpatienten im Vergleich zu den Probanden. Der niedrigste Spiegel bei Patienten fand sich bei Bestrahlungstherapie (Median = 840 U/ml), die höchsten Werte bei Patienten mit Chemotherapie (Median = 1400 U/ml). Infiltrierende CD3 ­Lymphozyten im Primärtumor, identifiziert mit einen Antikörper gegen die e­Ketten, sind im Vergleich zu metastasierten Lymphknoten signifikant erniedrigt. Unter­ suchungen der peripheren Blutlymphozyten bei Patienten mit Primärtumor ergaben eine signi­ fikante Erhöhung der CD3­Populationen bei gleichzeitiger Erniedrigung des Anteils CD45­ positiver Zellen. Es bestand für CD45­positive Zellen ein signifikanter Zusammenhang zwi­ schen peripheren Blutlymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten

Einfluss von Vitamin-D auf die Zusammensetzung regulatorischer Populationen tumorinfiltrierender Leukozyten und deren Effektormoleküle bei Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs

Als sechst häufigste Tumorentität weltweit mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von rund 55 % gehören Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs zu den häufigsten Tumoren des Menschen und sind mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Hinzu kommt, dass unter anderem wegen der oft späten Diagnosestellung die Therapiemöglichkeiten trotz der intensiven Forschungsbemühungen der letzten Jahrzehnte nach wie vor begrenzt sind. Die häufig fortgeschrittenen Tumoren generieren zudem ein immunsuppressives Tumormikromilieu was medikamentöse Therapiemöglichkeiten weiter limitiert. All dies impliziert die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Therapieansätze. Mit seiner in der Literatur immer deutlicher belegten antitumoralen und immmunstimulierenden Wirkung bietet Vitamin-D hierbei einen vielversprechenden Ansatz. Aus mehreren Studien der vergangenen Jahre geht hervor, dass Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren oft unter einem Vitamin-D-Mangel leiden, der seinerseits wiederum mit schlechteren Prognoseaussichten assoziiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde vor diesem Hintergrund der Einfluss des Vitamin-D-Status von Kopf-Hals-Tumorpatienten auf die antitumorale Immunabwehr durch eine differenzierte Analyse des immunologischen Tumormikromilieus untersucht. Hierfür wurden Gewebeproben von 116 Kopf-Hals-Tumorpatienten immunhistochemisch gefärbt, das Expressionsverhalten von fünf Zielproteinen analysiert und mit dem Vitamin-D Serumspiegel der Patienten korreliert. Im Einzelnen wurden dabei CD20, CTLA4, FasL, FoxP3 und IL10 untersucht. Ein Vitamin-D-Mangelzustand wurde definiert ab einem 25-OH Vitamin-D-Serumspiegel unter 10 ng/ml, was auf 63 Patienten zutraf, während 53 Patienten einen Spiegel über 25 ng/ml aufwiesen und somit zu den ausreichend mit Vitamin-D versorgten Patienten des Kollektivs gezählt wurden. Im Anschluss erfolgte die semiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbungen mit Hilfe eines immunreaktiven Scores, der für zwei der fünf Zielproteine modifiziert und für weitere zwei Zielproteine erweitert wurde, um eine optimale Auswertung zu gewährleisten. Dabei wurde für alle Marker das intratumorale und das peritumorale immunologische Tumormikromilieu getrennt ausgewertet. Die immunhistochemischen Analysen zeigten dabei am eindrücklichsten bei CD20 eine positive Korrelation zwischen einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung und einer vermehrten Infiltration CD20 exprimierender Zellen (B-Lymphozyten). Die tumorale Infiltration mit B-Lymphozyten zeigte sich bei einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung statistisch signifikant gesteigert (p=0,0289), während im peritumoralen Gewebe von einer deutlichen Tendenz hin zu einer vermehrten Infiltration gesprochen werden kann (p=0,0662). Die statistische Analyse von CTLA4, FasL, FoxP3 und IL10 ergab keine statistisch signifikante Korrelation mit dem Vitamin-D-Serumspiegel der Patienten. Allerdings zeigte das Ausmaß 1 1. Zusammenfassung der Infiltration des Tumormikromilieus mit den durch die genannten Marker untersuchten Immunzellpopulationen einen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten. Insbesondere die erhöhte intratumorale Infiltration CD20 exprimierender Zellen sowie peritumorale Infiltration CTLA4 exprimierender Zellen korrelierte statistisch signifikant mit einem verlängertem Gesamtüberleben (p=0,0401 und p=0,0398). Auch die gesteigerte peritumorale Infiltration CD20 exprimierender Zellen und intratumorale Infiltration CTLA4 exprimierender Zellen zeigte eine deutliche Tendenz hin zu einem verlängerten Gesamtüberleben der Patienten (p=0,1394 und p=0,0604). FoxP3 als Surrogatmarker für regulatorische T-Zellen zeigte eine geringe, nicht-signifikante Tendenz zu einem verlängerten Gesamtüberleben bei einer hohen peri- und intratumoralen Infiltration der exprimierenden Zellen (p=0,3421 und p=0,5964). Keinen signifikanten Überlebensvorteil ergab eine gesteigerte Infiltration von FasL und IL10 exprimierender Leukozyten. Insgesamt wiesen Patienten des untersuchten Kollektivs mit einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung unabhängig von den zuvor dargestellten Markern ein statistisch signifikant verlängertes Gesamtüberleben auf verglichen mit Patienten mit einem Vitamin-D-Mangel (p=0,0233). ein Zusammenfassend demonstrieren die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Ergebnisse, dass ausreichender Vitamin-D-Serumspiegel bei Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs immenser Bedeutung für die Prognose- und Therapieaussichten ist. Der Einfluss von Vitamin-D auf die Immuninfiltration des Tumormikromilieus und die Effektormoleküle einzelner Leukozyten-Subpopulationen wurde in dieser Arbeit deutlich und deutet eine stimulierende Wirkung auf die antitumorale Aktivität des Immunsystems bei Kopf-Hals-Karzinompatienten an. Perspektivisch sind weitere molekulargenetische Untersuchungen notwendig, um zusätzliche immunmodulatorische Wirkungsweisen und das antitumorale Potential von Vitamin-D zu entschlüsseln. Neben der leitliniengerechten und aktuell etablierten multimodalen Therapie von Kopf-Hals-Tumoren, könnte die kostengünstige Substitution von Vitamin-D zu einer Steigerung der Effektivität der bisherigen Therapieansätze, insbesondere der bereits klinisch etablierten Immuntherapie durch Checkpointinhibitoren, und gleichzeitig zu verbesserten Prognoseaussichten führen.As the sixth most common tumor entity worldwide with a 5-year survival rate of around 55%, squamous cell carcinoma of the head and neck are among the most common tumors in humans and are associated with an unfavorable prognosis. In addition, despite intensive research efforts in recent decades, treatment options are still limited, partly due to the commonly late diagnosis. The often-advanced tumors also generate an immunosuppressive tumor microenvironment, which further limits drug therapy options. All together this implies the need to develop new therapeutic options. With its antitumor and immunostimulatory effects, which has been increasingly proven in the literature, vitamin-D offers a promising approach. Several studies in recent years have shown that patients with head and neck tumors often suffer from vitamin-D-deficiency, which in turn is associated with a poorer prognosis. Against this background, the present study investigated the influence of the vitamin-D-status of head and neck tumor patients on the antitumor immune defense by means of a differentiated analysis of the immunological tumor environment. For this purpose, tissue samples from 116 head and neck tumor patients were stained immunohistochemically, the expression behavior of five target proteins was analyzed and correlated with the patients´ vitamin-D-serum-levels. Specifically, CD20, CTLA4, FasL, FoxP3, and IL10 were examined. Vitamin-D-deficiency was defined as a 25-OH-vitamin-D serum-level below 10 ng/ml, which was the case for 63 patients, whereas 53 patients had a level above 25 ng/ml and thus belonged to the sufficiently vitamin-D-supplied patients of the collective. The immunohistochemical staining was then evaluated semi-quantitatively using an immunoreactive score, which was modified for two of the five target proteins and extended for further two target proteins in order to ensure optimal evaluation. The intratumoral and peritumoral immunological tumor microenvironment was evaluated separately for all markers. The immunohistochemical analyses showed a positive correlation between an adequate vitamin-D-supply and an increased infiltration of CD20 expressing cells (B lymphocytes), most impressively in the case of CD20. Tumoral infiltration with B lymphocytes was statistically significantly increased with a sufficient vitamin-D-supply (p=0.0289), while in peritumoral tissue there was a clear tendency towards increased infiltration (p=0.0662). The statistical analysis of the molecules CTLA4, FasL, FoxP3 and IL10 showed no statistically significant correlation with the vitamin-D-serum-level of the patients. However, the extent of infiltration of the tumor microenvironment with the immune cell populations examined by the aforementioned markers showed a significant influence on the overall survival of patients. In particular increased intratumoral infiltration of CD20 expressing cells and peritumoral infiltration of CTLA4 expressing cells correlated statistically significantly with prolonged overall survival (p=0.0401 and p=0.0398). Increased peritumoral infiltration CD20 expressing 3 1. Zusammenfassung cells and intratumoral infiltration CTLA4 expressing cells also showed a significant tendency towards prolonged overall patient survival (p=0.1394 and p=0.0604). FoxP3 as a surrogate marker for regulatory T-cells showed a small, non-significant trend towards prolonged overall survival with high peri- and intratumoral infiltration of the expressing cells (p=0.3421 and p=0.5964). Increased infiltration of FASL and IL10 expressing leukocytes did not result in a significant survival benefit. Overall, patients in the investigated population with an adequate vitamin-D-supply showed a statistically significant increase in overall survival compared to patients with a vitamin-D-deficiency (p=0.0233), irrespective of the markers described above. In summary, the results obtained in the present study demonstrate that a sufficient serum vitamin-D-level in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck is of immense importance for the prognosis and therapy prospects. The influence of vitamin-D on the immune infiltration of the tumor microenvironment and the effector molecules of individual leukocyte subpopulations was clearly demonstrated in this study and suggests a stimulating effect on the antitumor activity of the immune system in head and neck cancer patients. In the future, further molecular genetic studies are necessary to decipher additional immunomodulatory modes of action and the antitumor potential of vitamin-D. Besides the guideline-compliant and currently established multimodal therapy of head and neck tumors, the cost-effective substitution of vitamin-D could lead to an increase in the effectiveness of existing therapeutic options, in particular the already clinically established immunotherapy with checkpoint inhibitors, and at the same time to improved prognostic prospects

Einfluss von Vitamin D auf die tumorspezifische Immunabwehr bei Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich

Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich gehören, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 50 %, zu den Tumorerkrankungen mit einer sehr schlechten Prognose, die sich auch in den letzten Jahrzehnten bei nur wenigen neuen Behandlungsansätzen nicht wesentlich verbessert hat. Ursache hierfür ist zum einen die in der Mehrzahl der Fälle erst sehr späte Diagnosestellung, zum anderen stellt die Behandlung dieser Tumorerkrankungen für Ärzte wie auch die Patienten eine große Herausforderung dar. Aus diesem Grund muss nach Methoden geforscht werden, die den Patienten neue Therapieoptionen ermöglichen. Ein Ansatz stellt dabei das Vitamin D mit seinen vielfältigen Wirkungen auf den menschlichen Organismus dar. Verschiedene Studien konnten zeigen, dass Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich häufig einen deutlichen Vitamin-D-Mangel aufweisen. In Zusammenhang mit der in den zurückliegenden Jahren gewonnenen Erkenntnis, dass Vitamin D einen entscheidenden Einfluss auf das Immunsystem hat, stellt sich die Frage, inwieweit bei Patienten mit einem Kopf-Hals-Tumor Vitamin D die Immunabwehr im Allgemeinen und insbesondere die antitumorale Funktion des Immunsystems beeinflussen kann. Dazu wurden in dieser Arbeit, aus einem Kollektiv von 103 Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, von denen 44 einen ausreichenden Vitamin-DSerumspiegel (> 15 ng/ml) und 59 einen Vitamin-D-Mangel aufwiesen (< 10 ng/ml), immunhistochemische Färbungen entsprechender Tumorgewebeproben angefertigt mit dem Ziel, verschiedene Immunzellpopulationen im Tumor sowie im peritumoralen Stroma zu charakterisieren. Hierbei wurden zur Detektion von Lymphozyten CD4-Antikörper (THelferzellen) und CD8-Antikörper (zytotoxische T-Zellen) verwendet. Um Makrophagen nachzuweisen, wurde ein CD11c-Antikörper eingesetzt, der vornehmlich M1-Makrophagen darstellt, ein CD163-Antikörper, der die M2-Makrophagenpopulation abbildet und ein CD68- Antikörper, der als Panmakrophagenmarker dient. In der Auswertung der immunhistochemischen Färbungen mit einem immunreaktiven Score zeigte sich, dass bei ausreichender Vitamin-D-Versorgung die intra- und peritumorale Infiltration mit Lymphozyten- und M1-Makrophagen (exemplarisch dargestellt durch die Antikörper CD4, CD8, CD11c und CD68) deutlich gesteigert ist. Insbesondere die intratumorale Infiltration durch die genannten Immunzellpopulationen wird durch eine suffiziente Versorgung mit Vitamin D signifikant stimuliert. Im Gegensatz dazu zeigte sich für die mit dem CD163-Antikörper detektierten M2- Makrophagen eine gesteigerte peritumorale Infiltration bei Vitamin-D-Mangel. Da M2- Makrophagen eine überwiegend immunsupprimierende Wirkung haben, deuten diese Ergebnisse übereinstimmend mit den dargestellten Ergebnissen der T-Helferzellen, zytotoxischen T-Zellen und M1-Makrophagen auf eine Stimulation der antitumoralen Aktivität des Immunsystems durch Vitamin D bei Kopf-Hals-Tumorpatienten hin. In der Überlebensanalyse zeigte sich, dass darüber hinaus eine ausreichende Vitamin-D-Versorgung bei diesen Patienten auch zu einem signifikant verbesserten Gesamtüberleben führte. Das mediane Überleben lag dabei bei Patienten mit einem Vitamin-D-Mangel bei 21 Monaten, während Patienten mit einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung im Schnitt 10 Monate länger lebten mit einem medianen Gesamtüberleben von 31 Monaten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit anhand von semiquantitativen histologischen Untersuchungen gezeigt werden, dass eine ausreichende Vitamin-DVersorgung für Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich von hoher Relevanz ist. Sie ist nicht nur mit einer gesteigerten Immunzellinfiltration im Tumor sowie im peritumoralen Stroma assoziiert, sondern korrelierte in der vorgelegten Arbeit auch mit einer signifikant verbesserten Prognose. Daher sind weitere, in dieser Arbeit nicht vorgenommene molekulare Untersuchungen nötig, um die Vitamin-D-Wirkungen zu entschlüsseln. Es finden sich aber dennoch Anhaltspunkte in dieser Arbeit, dass auch in der klinischen Praxis der Vitamin-D-Versorgung von Kopf-Hals-Tumorpatienten mehr Beachtung geschenkt werden sollte, da sich hier die Möglichkeit bietet, durch eine kostengünstige und sichere Therapie positive Effekte für die Patienten zu erreichen.Head and neck squamous cell carcinoma is a tumor entity with a 5-year survival rate of 50 %, a very poor prognosis that has not substantially improved in the last decades, as only few novel treatment approaches have emerged. Key reasons for this are the very late-stage diagnosis of the majority of cases as well as the significant challenge that the treatment of these cancers represents for both physicians and patients. There is therefore a need for research towards methods that can offer patients new treatment options. A promising candidate for this is vitamin D and its numerous effects on the human organism. Several studies have shown that patients with head and neck squamous carcinomas often display a significant vitamin D deficiency. Considering the evidence gathered in recent years that vitamin D has a crucial modulatory effect on the immune system, the question arises to what extent vitamin D may influence the immune response in head and neck cancer patients, both in general and specifically in regards to antitumor immunity. To address this, an immunohistochemical analysis was performed on tumor tissue samples isolated from a cohort of 103 head and neck squamous cell carcinoma patients, of which 44 had adequate serum levels of vitamin D (> 15 ng/ml) while 59 exhibited a vitamin D deficiency (< 10 ng/ml), in order to characterize the different immune cell populations present in the tumor as well as the peritumoral stroma. Lymphocytes were detected using a CD4 antibody (for T-helper cells) and a CD8 antibody (for cytotoxic T cells). Macrophages were identified with a CD11c antibody primarily labeling M1 macrophages, a CD163 antibody targeting the M2 macrophage population and a CD68 antibody serving as a pan-macrophage marker. The evaluation of the immunohistochemical stainings with an immunoreactive score showed that an adequate vitamin D status was associated with a significant increase in the intra- and peritumoral infiltration of lymphocytes and M1 macrophages (as revealed by the CD4, CD8, CD11c and CD68 antibodies). Particularly the intratumoral infiltration of these immune cell populations was significantly stimulated by sufficient vitamin D levels. In contrast, vitamin D deficiency correlated with an increased peritumoral infiltration of the M2 macrophage population detected with the CD163 antibody. Considering that M2 macrophages are predominantly immunosuppressive, this observation and the results obtained for T-helper cells, cytotoxic T cells and M1 macrophages concord to suggest that vitamin D stimulates the antitumor activity of the immune system in head and neck cancer patients. Furthermore, the survival analysis showed that an adequate vitamin D status was also linked to significantly better overall survival in these patients. Median survival was 21 months for patients with a vitamin D deficiency, whereas patients with sufficient vitamin D levels lived 10 months longer on average, with a median overall survival of 31 months. In summary, semiquantitative histological studies have shown that an adequate vitamin D status is of high relevance for patients with head and neck squamous cell carcinoma. It is not only associated with increased immune cell infiltration in the tumor and in the peritumoral stroma, but also correlated in the presented work with a significantly improved prognosis. Therefore, further molecular studies, that were not done in this work are needed to decipher the vitamin D effects. However, there are still indications in this work that more importance should be given to the vitamin D levels of head and neck cancer patients in the clinic, as this offers an opportunity to achieve positive outcomes in patients through a safe and costeffective therapy

Einfluss von Vitamin D auf die lytische Signatur tumorinfiltrierender Leukozyten bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich

Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches zählen als sechst häufigste Tumorentität weltweit mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 55 % zu den Tumorerkrankungen mit sehr schlechten Prognoseaussichten. Auch in den vergangenen Jahren konnte diese eingeschränkte Überlebensrate trotz der Entwicklung neuer Therapieansätze bisher nicht wesentlich verbessert werden. Ursächlich hierfür ist zum einen die in den meisten Fällen erst sehr späte Diagnosestellung, welche die Wahl der Therapiekonzepte begrenzen und die Bestimmung des Tumorursprungs erschweren kann. Zum anderen besitzen Kopf-Hals-Tumoren immunsuppressive Eigenschaften, die unter anderem zu einer limitierten Wirkung zielgerichteter medikamentöser Therapien beitragen können. Aus diesem Grund ist es notwendig neue Methoden zu entwickeln, die eine Früherkennung der Tumore verbessern und den Patienten neue und effektivere Therapieoptionen ermöglichen. Einen möglichen Ansatz stellt dabei das Vitamin-D dar, welches mit einer immunstimulierenden sowie antitumoralen Wirkung assoziiert zu sein scheint. Verschiedene Studien konnten belegen, dass Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich gegenüber gesunden Personen unter einem deutlichen Vitamin-D-Mangel leiden, der zudem mit einer schlechteren Prognose einhergeht. In diesem Zusammenhang wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit Vitamin-D bei Kopf-Hals-Tumorpatienten die zielgerichtete antitumorale Immunabwehr beeinflussen kann. Dazu wurden Tumorgewebeproben von 114 Kopf-Hals-Karzinom-Patienten immunhistochemisch gefärbt, um das Expressionsverhalten der lytischen Effektormoleküle Granulysin, Granzym A, Granzym B, Granzym K und Perforin als Surrogatmarker für die antitumorale Aktivität zytotoxischer Immunzellpopulationen zu untersuchen. Das Patientenkollektiv gliederte sich dabei abhängig vom Vitamin-D-Serumspiegel in 53 Patienten mit einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung sowie 61 Patienten mit einem Vitamin-D-Mangel. Die ausreichende Vitamin-D-Versorgung wurde im Vorfeld als 25-OH-Vitamin-D-Serumkonzentration über 15 ng/ml und der Vitamin-D-Mangel als 25-OH Vitamin-D-Serumspiegel unter 10 ng/ml definiert. Die semiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbungen erfolgte anschließend mithilfe eines immunreaktiven Scores. Die immunhistochemischen Analysen konnten eine positive Korrelation zwischen einem ausreichend hohen Vitamin-D-Serumspiegel und einer gesteigerten Expression der meisten lytischen Effektormoleküle bei Kopf-Hals-Tumorpatienten nachweisen. Insbesondere in den intratumoral lokalisierten Leukozyten war eine durch die suffiziente Vitamin-D-Versorgung gesteigerte Expression von Granzym B (p = 0,0026), Granzym K (p = 0,0240) und Perforin (p = 0,0030) zu beobachten. Bei der Betrachtung der intratumoral- und peritumoral-leukozytären Expression von Granzym A war dagegen keine Korrelation mit dem Vitamin-D-Serumspiegel festzustellen. Eine ausreichende Versorgung mit Vitamin-D führte zu einer vermehrten tumoralen Expression von Perforin (p = 0,0023), Granulysin (p = 0,0109) und tendenziell auch von Granzym K (p = 0,1142), was die aktivitätssteigernde Wirkung des Vitamin-D auf die gezielte antitumorale Immunreaktion unterstreicht. Weiterhin war zu beobachten, dass eine gesteigerte tumorale Perforin-Expression mit einem signifikant verbesserten Gesamtüberleben von Kopf-Hals-Tumorpatienten assoziiert zu sein scheint (p = 0,0321). Eine ausreichende Vitamin-D-Versorgung führte im untersuchten Patientenkollektiv zudem im Vergleich zu den Patienten mit einem Vitamin-D-Mangel zu einem signifikant verlängerten Gesamtüberleben von durchschnittlich 10 Monaten (p = 0,0188). Dies könnte zum einen durch die gesteigerte tumorale Leukozyteninfiltration bei Patienten mit suffizientem Vitamin-D-Spiegel und zum anderen durch den in dieser Arbeit analysierten Einfluss des Vitamin-D auf die zytolytische Aktivität der Leukozyten bedingt sein. Zusammenfassend verdeutlichen die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten, dass eine ausreichende Vitamin-D-Versorgung für Kopf-Hals-Tumorpatienten von hoher therapeutischer sowie prognostischer Relevanz sein kann. Die Ergebnisse demonstrieren, dass Vitamin-D die Expression der lytischen Enzyme in der Tumorumgebung der Kopf-Hals-Tumore beeinflussen und somit die zytolytische Aktivität der tumorinfiltrierenden Leukozyten regulieren kann, wodurch eine effektivere antitumorale Immunreaktion generiert werden könnte. Weiterhin sind zusätzliche molekulargenetische Untersuchungen notwendig, welche das immunstimulierende Potenzial des Vitamin-D auch in Abhängigkeit von anderen immunmodulatorischen Einflüssen analysieren, um die genauen Wirkungsweisen des Vitamin-D zu entschlüsseln. Schließlich könnte die kostengünstige Substitution von Vitamin-D im Rahmen einer multimodalen Therapiestrategie die Effektivität immunonkologischer Therapieansätze sowie die prognostischen Aussichten von Kopf-Hals-Tumorpatienten optimieren.Squamous cell carcinoma of the head and neck is the sixth most common tumor entity worldwide, with a 5-year survival rate of about 55 %, making it one of the tumor diseases with a very poor prognosis. Despite the development of new therapeutic approaches, this limited survival rate has not been improved significantly in recent years. The reason for this is, on the one hand, a very late diagnosis in most cases, which can limit the choice of therapy concepts and make it difficult to determine the origin of the tumor. On the other hand, head and neck tumors have immunosuppressive properties, which may, among other effects, contribute to a limited effect of targeted drug therapies. For this reason, it is necessary to develop new methods which improve early detection of tumors and provide patients with new and more effective treatment options. One possible approach is vitamin D, which seems to be associated with an immunostimulatory as well as antitumor effect. Various studies have shown that patients with squamous cell carcinoma of the head and neck suffer from a significant vitamin D deficiency compared with healthy people, which is moreover associated with a poorer prognosis. In this context, the present study investigated the extent to which vitamin D may influence the targeted antitumor immune response in head and neck tumor patients. For this purpose, tumor tissue samples from 114 head and neck cancer patients were stained immunohistochemically in order to investigate the expression behavior of the lytic effector molecules granulysin, granzyme A, granzyme B, granzyme K and perforin as surrogate markers for the antitumor activity of cytotoxic immune cell populations. The patient collective was divided into 53 patients with sufficient vitamin D supply and 61 patients with vitamin D deficiency, depending on the serum vitamin-D level. Adequate vitamin D supply was defined in advance as 25-OH vitamin D serum concentration above 15 ng/ml and vitamin D deficiency as 25-OH vitamin D serum level below 10 ng/ml. Semiquantitative evaluation of immunohistochemical staining was performed subsequently using an immunoreactive score. The immunohistochemical analyses demonstrated a positive correlation between a sufficiently high vitamin D serum level and an increased expression of most lytic effector molecules in head and neck tumor patients. In particular, in the intratumorally localized leukocytes, an increased expression of granzyme B (p = 0.0026), granzyme K (p = 0.0240) and perforin (p = 0.0030) was observed due to the sufficient vitamin D supply. In contrast, when intratumoral and peritumoral leukocyte expression of granzyme A was examined, there was no correlation with serum vitamin D levels. An adequate supply of vitamin D resulted in increased tumoral expression of perforin (p = 0.0023), granulysin (p = 0.0109), and tended to increase granzyme K (p = 0.1142), which underscores the activity-enhancing effect of vitamin D on the targeted antitumor immune response. Furthermore, it was observed that increased tumoral perforin expression seems to be associated with significantly improved overall survival of head and neck tumor patients (p = 0.0321). Adequate vitamin D supply also resulted in a significantly prolonged overall survival of 10 months on average in the studied patient population compared with vitamin D deficient patients (p = 0.0188). This may be due to the increased tumoral leukocyte infiltration in patients with sufficient vitamin-D levels on the one hand and to the influence of vitamin D on the cytolytic activity of leukocytes analyzed in this thesis on the other hand. In conclusion, the data collected in the present study illustrate that adequate vitamin D supply may be of high therapeutic as well as prognostic relevance for head and neck tumor patients. The results demonstrate that vitamin D may influence the expression of lytic enzymes in the tumor environment of head and neck tumors and thus regulate the cytolytic activity of tumor-infiltrating leukocytes. This may generate a more effective antitumor immune response. Furthermore, additional molecular genetic studies are needed to analyze the immunostimulatory potential of vitamin D also in relation to other immunomodulatory influences so as to decipher the exact modes of action of vitamin D. Finally, cost-effective substitution of vitamin D as part of a multimodal therapeutic strategy could optimize the effectiveness of immuno-oncological therapeutic approaches as well as the prognostic outlook of head and neck tumor patients

Untersuchungen zur Zytokinexpression von Patienten mit fortgeschrittenen gynäkologischen Tumoren und Tumoren im Kopf-Hals-Bereich

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von verschiedenen Zytokinen (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1β, VEGF) und die Korrelation zu Entzündungs- und Anämieparametern (CRP, Leukozyten, Hämoglobin) bei Patienten mit fortgeschrittenen gynäkologischen- und Kopf-Hals-Tumoren untersucht. Es wurden Serumproben zu Beginn, während und am Ende der Radio- bzw. Radiochemotherapie entnommen. Die Zytokinbestimmung erfolgte mittels kommerzieller Immuno-Assays. Insgesamt wurden 52 Patienten untersucht, 30 Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren und 22 Patienten mit gynäkologischen Tumoren. Eine wesentliche Rolle spielte die Untersuchung von Zytokininteraktionen und möglichen Zusammenhängen zwischen der Zytokinexpressionshöhe und der Prognose. Es konnte aufgezeigt werden, dass enge Interaktionen sowohl zwischen den Zytokinen als auch zwischen Entzündungs- und Anämieparametern und proinflammatorischen Zytokinen bestehen. Eine Schlüsselrolle spielte das CRP. Patienten mit signifikant erhöhten CRP-Serumkonzentrationen wiesen häufig deutlich erhöhte Zytokinkonzentrationen auf und hatten eine schlechtere Prognose. Ebenso hatten hypoxische Verhältnisse im Wirtsorganismus häufig deutlich erhöhte Serumkonzentrationen mehrerer Zytokine zur Folge (VEGF, TNF-α, IL-6, MMP-9), d. h., die Expression verschiedener Zytokine kann möglicherweise durch Hypoxie induziert werden. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen die Notwendigkeit einer multimodalen Tumortherapie und sprechen für einen möglicherweise sinnvollen Einsatz von Zytokininhibitoren (z.B.VEGF, MMP-Inhibitoren) auch in der primären Tumortherapie.In the following study we analysed the expression of various cytokines (like TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1β, VEGF) and the correlation between the cytokines and parameters of anemia and inflammation (CRP, Leukocytes, Haemoglobin) in patients with gynaecological and head and neck cancer. We collected samples of serum at the beginning, during and at the end of radio-or radiochemotherapy. For determination of the cytokine levels we used commercial immuno- assays. Overall 52 patients were examined, 30 of these patients with head and neck cancer, 22 with a gynaecological tumor. An important aim of the study was the investigation of cytokine interactions and the evaluation of the cytokine expression and the prognosis. We showed strong coherences between the cytokines and between parameters of anemia (or inflammation) and proinflammatory cytokines. A key role played in our study the CRP. Patients with significant increased serum levels of the CRP had often high concentrations of the investigated cytokines and a poor prognosis. Furthermore hypoxic conditions in the host organism correlated with increased levels of various cytokines (like VEGF, TNF-α, IL-6, MMP-9). Possibly the expression of different cytokines can be induced by hypoxia. Our results show the necessity of a multimodal tumor therapy. Possibly the use of cytokine inhibitors in the first-line-therapy of malignant tumors is efficient.von Frank Peter Sieke

Supprimierter Immunstatus durch strukturelle und funktionelle immunologische Defizite bei Patienten mit Karzinomen aus dem Kopf- und Halsbereich

Epidemiologische Daten und Tiermodelle geben Hinweise auf eine verschlechterte Immunabwehr bei Karzinomen des Kopf- und Halsbereiches, wobei die genauen Wirkmechanismen bisher nicht aufgeschlüsselt werden konnten. In Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Karzinome im Kopf- und Halsbereich mit erhöhten Konzentrationen an Prostaglandinen im Serum einhergehen, ein anderer Autor wies eine verminderte Expression des Chemokinrezeptors CCR5 auf Monozyten nach Behandlung mit Prostaglandin nach. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig aufgezeigt werden, dass es im Rahmen einer Karzinomerkrankung im Hals- und Kopfbereich zu strukturellen und funktionellen Defiziten der Monozytenfunktion kommt. Hierbei finden sich erniedrigte Expressionsraten an CCR5, CCR2 und des Adhäsionsmoleküls CD11b des β-Integrins Mac-1 sowie eine verminderte Adhäsionsfähigkeit der Monozyten an das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass nach Inkubation der Monozyten in Serum gesunder Spender die verminderte Immunfunktion wieder verbessert wird. Parallel dazu zeigte sich, dass die oben beschriebenen Immundefekte auf Monozyten gesunder Spender durch Inkubation in Serum von Tumorpatienten künstlich herbeigeführt werden können. Dies legt den Schluss nahe, dass im Rahmen einer Karzinomerkrankung Metaboliten im Serum gelöst sind, die eine immunologische Tumorabwehr erschweren. Diese Erkenntnisse sind ein weiterer Schritt zum Verständnis der Tumorimmunologie und könnten dazu hilfreich sein, immunologische Therapieverfahren voranzubringen

T-Zellerschöpfung und Stroma Seneszenz : Einfluss der Tumormikroumgebung auf die Tumorzellbiologie und den klinischen Verlauf von Kopf-Hals-Karzinomen

Die Tumormikroumgebung von Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region stellt sich als komplexes System dar und birgt noch immer offene Fragen bezüglich der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen zellulären und molekularen Strukturen und deren Einflüsse auf die Karzinogenese und den klinischen Verlauf. Mit der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf fünf Biomarker der T-Zellerschöpfung (PD1, TIM 3, LAG-3) und Stroma Seneszenz (IL-8, MMP3) gelenkt, um neue Erkenntnisse über die Tumorbiologie in der Tumormikroumgebung zu erhalten und deren Einfluss auf den klinischen Verlauf der Tumorerkrankung zu untersuchen. Zusätzlich wurde ein potenzieller Zusammenhang zwischen der Expression der genannten Biomarker und einer tumorfördernden Schleimhautinfektion durch humane Papillomviren sowie der Vitamin D-Versorgung der Patienten ermittelt. Dazu wurde immunhistochemisch an Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Gewebeproben eines Kollektivs von 116 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region, die Expression dieser Biomarker untersucht, semiquantitativ ausgewertet und mit klinisch- pathologischen Daten der Patienten korreliert. Es zeigte sich für die Biomarker der T- Zellerschöpfung (PD1, TIM 3, LAG-3) eine signifikante Korrelation einer gesteigerten Expression auf peritumoralen Immunzellen mit einem verlängerten Gesamtüberleben der Patienten. Gleiches zeigte sich für die T-Zellerschöpfungsmarker PD1 und TIM 3 auch auf intratumoralen Immunzellen. Die Biomarker der Stroma Seneszenz (IL-8, MMP3) zeigten keine Korrelation zwischen der Expression und dem Gesamtüberleben. Bei HPV+-Tumoren kam es intra- und peritumoral zu einer signifikant gesteigerten Infiltration durch PD1+- Immunzellen und TIM 3+-Immunzellen, während bei HPV--Tumoren eine gesteigerte intratumorale Infiltration durch MMP3+-Immunzellen beobachtet wurde. Die Analysen von Vitamin D als Einflussgröße auf die Biomarker-Expression zeigten statistisch keine signifikanten Ergebnisse, sondern lediglich tendenzielle Beobachtungen hinsichtlich einer gesteigerten Infiltration durch PD1+- und TIM 3+-Immunzellen bei höheren Vitamin D- Serumwerten der Patienten. Die Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnten somit zeigen, dass die Zusammensetzung und Aktivität des immunologischen Tumormikromilieus über die reine Tumorzellbiologie hinausgehend einen wesentlichen Einfluss auf die Prognose von Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom der Kopf-Hals-Region haben. Neben den bereits zugelassenen PD1-Antikörpern sind somit weitere Immuncheckpoints und Immunzellpopulationen vielversprechende Zielstrukturen zukünftiger immunonkologischer Therapieansätze mit dem Ziel die Stroma Seneszenz und T-Zellerschöpfung zu überwinden. Zusätzlich konnte vor allem für die Marker der T-Zellerschöpfung (PD1, TIM 3, LAG-3) ein Potenzial als mögliche prognostische Marker für Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom der Kopf-Hals-Region aufgezeigt werden. Die prognostische Aussagekraft dieser Biomarker kann in Verbindung mit weiterführenden Studien potenziell noch gesteigert werden, sodass eine für den Patienten spürbare Verbesserung des klinischen Therapiemanagements durch eine optimierte Prognoseeinschätzung und mögliche neue immunonkologische Therapieansätze erreicht werden könnte.The tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinomas presents itself as a complex system and still holds unanswered questions regarding the interactions between different cellular and molecular structures and their influences on carcinogenesis and clinical progression. In this study, we focused on five biomarkers of T-cell exhaustion (PD1, TIM 3, LAG-3) and stromal senescence (IL-8, MMP3) to gain new insights of the tumor biology in the tumor microenvironment and to investigate their influence on the clinical course of tumor disease. In addition, a potential correlation between the expression of these biomarkers and tumor-promoting mucosal infection by the human papillomavirus and vitamin D status of patients was determined. For this purpose, the expression of these biomarkers was investigated by immunohistochemistry on formalin fixed paraffin embedded tissue samples of a collective of 116 patients with squamous cell carcinomas of the head and neck region, evaluated semi quantitatively, and correlated with clinical data of the patients. There was a significant correlation of increased expression on peritumoral immune cells with prolonged overall survival for the biomarkers of T-cell exhaustion (PD1, TIM 3, LAG-3). The same was shown for the T-cell exhaustion markers PD1 and TIM 3 also on intratumoral immune cells. Biomarkers of stromal senescence (IL-8, MMP3) showed no correlation between expression and overall survival. In HPV+ tumors, there was significantly increased intratumoral and peritumoral infiltration by PD1+ immune cells and TIM 3+ immune cells, whereas increased intratumoral infiltration by MMP3+ immune cells was observed in HPV- tumors. The analyses of vitamin D as an influencing variable on biomarker expression did not show statistically significant results, but only tendential observations regarding an increased infiltration by PD1+ and TIM 3+ immune cells at higher vitamin D serum levels of the patients. Thus, the studies in this work were able to show that the composition and activity of the immunological tumor microenvironment have a significant impact on the prognosis of patients with squamous cell carcinomas of the head and neck region beyond the mere tumor cell biology. In addition to the already approved PD1 antibodies, other immune checkpoints and immune cell populations are promising targets of future immuno-oncological therapeutic approaches aiming to overcome stromal senescence and T-cell exhaustion. Especially for the markers of T-cell exhaustion (PD1, TIM 3, LAG-3) a potential as possible prognostic markers for patients with squamous cell carcinoma of the head and neck region could be demonstrated. The prognostic value of these biomarkers can potentially be increased in conjunction with further studies, so that ultimately a noticeable improvement in clinical therapy management for the patient could be achieved through optimized prognosis assessment and possible new immuno-oncological therapy approaches

In-vivo- und In-vitro-Untersuchungen zum Einfluß einer Enzym- bzw. Vitamin-A-Therapie auf das periphere Immunsystem bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom im Kopf-, Halsbereich

Die doppelblinde Pilotstudie ''Wirksamkeit und Verträglichkeit einer Enzym­ oder Vitamin­ A­Therapie bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom im Kopf­/Halsbereich" wurde in Zusammenarbeit mit der HNO­Klinik in dem Zeitraum von Oktober 1994 bis Juni 1996 mit 25 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen und 15 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt. Den Patienten wurde neben der konventionellen Therapie entweder Vitamin­A (Retinolpalmitat, 150,000 IE/d), die Enzympräparation (proteolytische Gesamtaktivität 20,880 F.I.P.­E/d) oder Placebo zugeteilt. In regelmäßigen Abständen wurde das Allgemeinbefinden/ Nebenwirkungen protokolliert, Blutbild und Leberwerte bestimmt, die peripheren Lymphozyten phänotypisiert und die NK­ LAK, bzw. LAK­Zell­Aktivität gemessen. Zur Auswertung gelangten 16 Patienten. Statistisch signifikant war eine Erhöhung der CD2 und CD3­Werte der Enzym­Gruppe (41 Messungen) gegenüber den Patienten der Gruppen Vitamin­A (18 Messungen), Placebo (12 Messungen) und den Ausgangswerten der Patienten (25 Messungen). Auch im Verlauf konnte die Erhöhung der CD3­Werte bei der Enzymgruppe gegenüber den anderen Patientengruppen bestätigt werden. Der Anteil der T­Zellen im peripheren Blut lag im Bereich der gesunden Kontrollen. Um die Wirkungen der Prüfmedikationen auf Leukozyten (PBL, PMNL, Monozyten) in vitro zu untersuchen, wurde ein Panel durchflußzytometrischer Tests entwickelt, bzw. etabliert, die die Messung der Funktionen NK­Zellaktivität, LAK­Aktivität, ADCC, Phagozytose und Sauerstoffradikalbildung ermöglichten bzw. vereinfachten. Die untersuchte Enzympräparation enthielt Papain, Trypsin und Chymotrypsin im Verhältnis 2,5:1:1. In vitro­Versuche ergaben eine dosisabhängige Stimulierung der NK­, NK­LAK, CTL­ bzw. LAK­Aktivität und der ADCC durch NK­Zellen durch die Enzympräparation. Es war möglich, die Lymphozyten mehrfach zu stimulieren, eine Enzymdauergabe, bzw. hohe Enzymdosen führten zu einem Aktivitätsrückgang. Die Enzymmischung verbesserte die Phagozytose und den oxidativen Burst bei PMNL und erhöhte die CD18­ und CD54­ bzw. erniedrigte die CD16­Expression auf PMNL. Mit all­trans­Retinsäure bzw. Retinol konnten die Lymphozytenaktivitäten in vitro mit den gewählten Versuchsbedingungen kaum beeinflußt werden, Änderungen konnten meist 48h bis 72h nach Zugabe beobachtet werden, die jedoch nicht signifikant waren. Beobachtungen zu Vitamin­A­Wirkungen auf PMNL waren nicht möglich, da diese nur maximal 24h kultiviert werden konnten

Expression der Matrix-Metalloproteinasen MMP-2, -7, -9 und -13 und ihrer Inhibitoren TIMP-1, -2 und -3 in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes

Plattenepithelkarzinome des oberen Aerodigestivtraktes stehen in Europa an sechster Stelle in der Häufigkeit ihres Auftretens und weisen in fortgeschrittenen Stadien trotz moderner Behandlungsmethoden eine relativ geringe 5-Jahres-Überlebensrate auf. Diese ist vor allem auf die hohe, in der Regel lymphogene Metastasierungsfrequenz zurückzuführen. Um bereits präoperativ das Risiko einer möglichen Metastasierung und die Aggressivität des Tumorwachstums einzuschätzen, zielen die Bemühungen verschiedener Arbeitsgruppen auf die Etablierung molekularer Marker. Besonderes Interesse gilt hierbei seit einigen Jahren der Gruppe der Matrix-Metalloproteinasen. Matrix-Metalloproteinasen bezeichnen eine Familie substratspezifischer Endopeptidasen, denen ein Zinkionen-Komplex im aktiven Zentrum gemeinsam ist. Alle Mitglieder der Familie können, neben anderen biologischen Funktionen, Bestandteile der Extrazellularmatrix abbauen. Die Regulation dieser Enzyme verläuft auf verschiedenen Ebenen, unter anderem durch spezifische Inhibitoren der aktiven Enzyme, TIMPs. Aufgrund ihrer Fähigkeiten kommen Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren eine tragende Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen zu, so auch in der Ausbreitung und Metastasierung maligner Tumoren. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Überwindung von Basalmembranen zur Metastasierung. Die MMPs -2 und -9 sind in der Lage, neben anderen Substraten das in Basalmembranen auftretende Kollagen IV abzubauen. Diese Fähigkeit besitzen die übrigen MMPs nicht. Auf diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Dissertation die RNA-Expression von MMP–2, -7, -9 und –13, sowie von TIMP–1, -2 und –3 in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes sowie in Plattenepithelkarzinom-Zelllinien untersucht. RNA aus 30 Gewebeproben und sieben Zelllinien wurde extrahiert, mit Hilfe von RT-PCR und Gel-Elektrophorese dargestellt, die Ergebnisse semiquantivativ erfasst und statistisch ausgewertet. MMP- und TIMP-RNA war sowohl in den Gewebeproben als auch in den Zelllinien nachweisbar. Von den MMPs war MMP–13 am häufigsten und stärksten nachweisbar, MMP-2 am schwächsten. Die drei TIMPs konnten in allen Fällen nachgewiesen werden. Statistisch signifikante Korrelationen fanden sich zwischen MMP-13 und dem Lymphknotenstatus, MMP-13 und TIMP-2, sowie MMP-9 und dem Fernmetatsasenstatus. Des weiteren ergaben sich Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen stärkeren MMP-2 und –9 RNA-Signalen und einem fortgeschrittenen Tumorstadium. Der Nachweis der betrachteten RNA in den Zelllinien war dem der Gewebeproben ähnlich; allerdings waren die Signale für die jeweilige RNA insgesamt schwächer. Korrelationen von MMP-Signalen mit Primärtumor-Lokalisationen ließen sich nicht aufweisen, ebenso wenig kongruente Muster innerhalb der MMP-Signale. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zusammenfassend lässt sich eine Rolle der untersuchten MMPs und TIMPs für das Invasions- und Metastasierungsverhalten von Karzinomen der oberen Luft- und Speisewege annehmen. Ihr prognostisches Potential ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt jedoch noch nicht abschließend geklärt