Antimicrobial Detection Illuminated: Developing Bioluminescent Antibiotic Biosensors Based on Bacterial Gene Regulatory Elements

Ever since World War II, antibiotics have been medicine’s number one asset in fighting microbial infection, one of the leading causes of death worldwide. Misuse of antibiotics has, however, led to rapid spread of antibiotic resistance among bacteria and ensuing development of multiple resistant pathogens. Therefore, antibiotics are rapidly losing their antimicrobial value, which can be seen a failure of society to protect one of its valuable resources.The use of antibiotics in food production animals is strictly controlled by the European Union. Veterinary use is regulated to prevent spreading of resistance due to unwarranted use and to prevent antibiotic residues in food products. EU legislation establishes maximum residue limits (MRLs) of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin, and enforces countries to establish and execute a national monitoring plan of animal products to implement food control measures. Among samples selected for monitoring, suspect noncompliant samples are screened for and then subjected to confirmatory analysis to establish the identity and concentration of the contaminant. Screening methods for antibiotic residues are typically based on microbiological growth inhibition, whereas physico-chemical methods are used for confirmatory analysis.In this study, antibiotic whole-cell biosensor assays were examined as a novel screening method. Utilizing a tetracycline-specific bioluminescent whole-cell biosensor, a screening method for tetracycline residues in poultry meat was developed. Assay sensitization to meet the EU MRLs was achieved by improving tetracycline accumulation into the biosensor cells with a combination of membrane-permeabilizing agent polymyxin B and chelating agent EDTA. The result was a rapid, simple and cost-effective high-throughput screening method that could detect all four veterinary relevant tetracyclines and their 4-epimer metabolites in poultry meat with sensitivity below the MRLs. The study also provided proof of antimicrobial activity of tetracycline 4-epimer metabolites, a quality previously thought absent from 4-epidoxycycline.Nisin is a lantibiotic, a peptide antibiotic produced by lactococci. The industrial use of nisin as a food preservative (E234) and maximum allowed levels set by the EU warrant developing methods for nisin quantification in foods. In this study, a bioluminescent whole-cell biosensor for nisin was constructed and utilized in determining nisin concentrations in milk. The developed assay was rapid and simple to perform, and required no sample pretreatment except dilution. Sensitivity of the assay was in the sub-picogram per ml level, exceeding the performance of all previously published methods. The assay was also used in determining nisin-production efficiency by quantifying nisin in growth medium of a nisin-producing Lactococcus strain. Simultaneously, nisin producers could be distinguished from non-producers. This idea was expanded in a follow-up study, which utilized the nisin biosensor in screening for nisin producers in raw milk. Screening was based on simple overlay of raw milk cultures and identification of nisin producers by a bioluminescent zone surrounding the nisinogenic colony. The seven identified nisinogenic colonies were divided in three groups by genetic fingerprinting,and characterized as nisin variant Z producing Lactococcus lactis subsp. lactis. In addition, four nisin A producers were identified in a panel of 91 dairy lactococcal strains. Specificity studies showed that only nisin and not other bacteriocin peptides induced bioluminescence in the sensor strain. Also, all nisin-gene harboring colonies induced bioluminescence, with the exception of one lactococcal strain shown to carry a nonfunctional nisin gene.The development of novel inducible whole-cell biosensors for different groups of antimicrobials can be limited by the lack of regulatory elements specifically responsive for these substances. In this study, we characterized DNA and ligand binding of the macrolide antibiotic-responsive repressor protein, MphR(E). The protein was modified by rational design of mutations to improve DNA affinity and dimerization. DNA and ligand binding as well as macrolide-induced dissociation from DNA were studied by fluorescence anisotropy and mass spectrometry. Mutants with improved DNA affinity and retained ligand binding and dissociation characteristics were identified. One mutant surprisingly formed a covalent dimer through disulfide bridge formation. This was shown to improve DNA affinity, but ligand binding and induction was impaired. Ligand binding spectrum of MphR(E) was shown to cover macrolides with a 14-membered lactone ring structure, but macrolides with a 16-membered ring or lincosamides showed no binding. MphR(E) and its mutants showed interesting novel characteristics that could benefit biosensor design.In conclusion, this study shows the applicability of whole-cell biosensors in developing simple, robust and cost-effective screening methods for antimicrobials in food products. These methods show high sensitivity and specificity towards the target analyte, and can be used in semi-quantitative to quantative analysis. In addition to residue monitoring, whole-cell biosensors can be used for producer identification. The identified nisin producers can find use as protective starter cultures in fermented food production. The modified repressor MphR(E) shows promise as an improved regulator of reporter gene production in whole-cell biosensor applications, and is an example of purposeful effort to develop regulatory elements for novel biosensor designs.Antibiootit ovat olleet tärkein bakteeri-infektioiden hoitokeino aina toisesta maailmansodasta lähtien. Bakteeri-infektiot ovat maailmanlaajuisten kuolemansyytilastojen kärkisijoilla. Antibioottien huolimaton käyttö on kuitenkin johtanut antibioottiresistenssin nopeaan leviämiseen bakteerien keskuudessa sekä useille antibiooteille resistenttien patogeenien kehittymiseen. Tämän vuoksi antibiootit menettävät nopeasti antimikrobiaalista voimakkuuttaan, mitä voidaan pitää yhteiskunnan kyvyttömyytenä suojella arvokasta pääomaansa. Euroopan Unioni valvoo antibioottien käyttöä eläimissä, joita hyödynnetään elintarvikkeiden tuotannossa. Eläinlääketieteellistä käyttöä säädellään resistenssin leviämisen ja ruoassa esiintyvien antibioottijäämien estämiseksi. EU:n lainsäädäntö osoittaa enimmäisjäämärajat eläinlääkinnällisille aineille eläinperäisissä elintarvikkeissa ja velvoittaa jäsenvaltiot laatimaan ja toteuttamaan eläimistä saatavien elintarvikkeiden kansallisen vierasainevalvontaohjelman. Valvontaan valittujen näytteiden joukosta seulotaan näytteet, joiden epäillään sisältävän jäämiä, joiden luonne ja pitoisuus varmistetaan lisäanalyysillä. Seulonnassa käytetään tavallisesti mikrobiologiseen kasvuinhibitioon perustuvia menetelmiä, ja varmistukseen fysikaalis-kemiallisia analyysejä. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin kokosolubioantureilla tehtävien antibioottimääritysten soveltuvuutta antibioottijäämien seulontamenetelmäksi. Tetrasykliinispesifistä bioluminoivaa kokosolubiosensoria käyttäen kehitettiin seulontamenetelmä tetrasykliinijäämien tunnistamiseksi kananlihasta. Määritys saatiin herkistettyä EU:n enimmäisjäämärajojen tasolle helpottamalla tetrasykliinien pääsyä bioanturisoluun solukalvon läpäisykykyä lisäävällä polymyksiini B:llä sekä kahdenarvoisia kationeja kelatoivalla EDTA:lla. Tuloksena oli nopea, yksinkertainen ja kustannustehokas seulontamenetelmä, jolla oli korkea suoritusteho. Menetelmä kykeni havaitsemaan kaikki neljä eläinlääketieteessä käytettävää tetrasykliiniä sekä niiden 4-epimeeri aineenvaihduntatuotteet kananlihassa enimmäisjäämärajat alittavissa pitoisuuksissa. Tutkimus myös tuotti todisteita tetrasykliinien 4-epimeerien antimikrobiaalisesta aktiivisuudesta, joka aiemmin arveltiin puuttuvan 4-epidoksisykliiniltä. Nisiini on laktokokkien tuottama lantibiootti eli peptidiantibiootti. Nisiinin käyttö elintarviketeollisuudessa säilöntäaineena (E234) sekä EU:n nisiinille asettama sallittu enimmäismäärä elintarvikkeissa luovat tarpeen nisiinin määritysmenetelmille. Tässä tutkimuksessa rakennettiin bioluminoiva nisiinispesifinen kokosolubioanturi, jota käytettiin määrittämään nisiinipitoisuuksia maidossa. Kehitetty määritys oli nopea ja yksinkertainen, eikä vaatinut laimennusta monimutkaisempaa näytteen esikäsittelyä. Määrityksen herkkyys oli alle pg/ml mittaluokassa, ja se oli herkin koskaan julkaistu nisiinimääritys. Määritystä käytettiin myös nisiinintuotannon tehokkuuden arvioinnissa mittaamalla nisiinipitoisuus sitä tuottavan Lactococcus lactis -kannan kasvumediumista. Samanaikaisesti nisiinintuottaja voitiin erottaa nisiiniä tuottamattomista kannoista. Tätä ajatusta tarkasteltiin laajemmin jatkotutkimuksessa,jossa nisiinibioanturia käytettiin seulomaan nisiinintuottajakantoja raakamaidosta. Yksinkertainen seulontamenetelmä perustui raakamaitobakteerien viljelmien peittämiseen ohuella bioanturikerroksella, jolloin nisiinintuottajapesäkkeiden ympärille muodostui biolumine-senssivyöhyke. Seitsemän tunnistettua nisiinintuottajapesäkettä jakautuivat geneettisen sormen-jäljen perusteella kolmeen ryhmään, ja ne olivat kaikki Lactococcus lactis subsp. lactis -alalajiin kuuluvia nisiini Z -variantin tuottajia. Lisäksi 91 laktokokkikannan paneelista tunnistettin kolme nisiini A -variantin tuottajaa. Spesifisyystutkimukset osoittivat, että vain nisiini indusoi bioluminesenssin bioanturibakteerissa eivätkä muut bakteriosiinipeptidit. Lisäksi kaikki nisiinigeeniä kantavat pesäkkeet indusoivat bioluminesenssin. Poikkeuksena oli yksi laktokokkikanta, jonka todettiin kantavan toimimatonta nisiinigeeniä. Tietyille antibioottiryhmille spesifisen vasteen antavien säätelyelementtien puute saattaa vaikeuttaa kokosolubioanturien kehittämistä. Tässä tutkimuksessa karakterisoitiin makrolidispesifisen repressoriproteiini MphR(E):n DNA- ja ligandinsitomisominaisuuksia. Proteiinia muokattiin rationaalisen mutaatiosuunnittelun keinoin tarkoituksena tuottaa DNA- ja dimerisoitumisominaisuuksiltaan parempia mutantteja. DNA- ja ligandisitoutumista sekä makrolidiligandien indusoimaa dissosiaatiota DNA:sta tutkittiin fluoresenssianisotropialla ja massaspektrometrialla. Tutkimuksessa löydettiin mutantteja, joilla oli villityypin proteiinia parempi DNA-affiniteetti sekä ennallaan säilynyt kyky sitoa ligandeja ja indusoitua sitomisen vaikutuksesta. Yksi mutanteista muodosti rikkisillan avulla kovalenttisen dimeerin vastoin odotuksia. Kovalentti dimerisaatio paransi DNA-affiniteettia, mutta haittasi ligandin sitomista sekä induktiota. MphR(E):n ligandikirjo kattoi 14-jäsenisen laktonirenkaan makrolidit, mutta ei 16-jäsenisen renkaan makrolideja eikä linkosamideja. MphR(E) ja sen mutantit osoittivat mielenkiintoisia uusia ominaisuuksia, jotka voivat hyödyttää bioantureiden suunnittelua. Johtopäätöksenä voidaan sanoa, että tämä tutkimus osoittaa kokosolubioanturien soveltuvan yksinkertaisten, luotettavien ja kustannustehokkaiden seulontamenetelmien kehittämiseen antibioottijäämien osoittamiseen elintarvikkeista. Nämä menetelmät osoittavat suurta herkkyyttä ja spesifisyyttä analyyttimolekyyliä kohtaan, ja niitä voidaan käyttää semikvantitatiiviseen sekä kvantitatiiviseen analysiin. Jäämien havainnoinnin lisäksi bioantureita voidaan käyttää antimikrobiaalisten aineiden tuottajien tunnistamiseen. MphR(E)-mutantit ovat lupaavia paranneltua säätelykykyä osoittavia reportterigeenin tuoton repressoreita käytettäväksi bioanturisovelluksissa. Ne ovat myös esimerkki rationaalisesta säätelyelementtien parantelusta uusien bioanturisovellusten kehittämiseksi

Découverte et optimisation d’inhibiteurs pour des enzymes DfrBs impliquées dans la résistance bactérienne

Le triméthoprime (TMP) est un antibiotique utilisé en clinique ainsi que de façon préventive dans l’élevage de bétail et l’aquaculture, causant une pression sélective auprès des bactéries. La cible de cet antibiotique est l’enzyme dihydrofolate réductase (Dfr) bactérienne chromosomique qui est essentielle dans la voie de biosynthèse du folate et donc, à la prolifération cellulaire. Plusieurs types de résistances au TMP furent répertoriés, dont le transfert d’un plasmide de résistance entre bactéries pathogènes. En fait, dans le milieu hospitalier, ce plasmide est le plus dangereux, puisque ce milieu est propice à une plus forte sélection provoquant la prolifération des bactéries résistantes au TMP. Des bactéries pathogènes résistantes au TMP possédant les gènes de Dfr de type B (dfrB) ont été identifiées dans l’aquaculture des poissons, l’élevage de bétail ainsi que dans les eaux usées. Les gènes des dfrBs sont normalement répertoriés indirectement par l’identification des éléments des intégrons. Ceci fait en sorte que la prévalence des gènes des dfrBs est sous-estimée. Il est impératif de déterminer la prévalence de ces gènes. Nous avons démontré le potentiel d’accomplir ceci par une recherche directe de ces gènes dans des échantillons cliniques Nord-Américains de Escherichia coli (E. coli) résistants au TMP. À ce jour, aucun antibiotique n’est répertorié pour vaincre la résistance causée par les DfrBs. En fait, peu de travaux sont effectués sur cette famille émergente. Nous savons que les DfrBs ne possèdent aucune similarité de séquence ni de structure avec les Dfr chromosomiques procaryotes et eucaryotes. Il est d’une grande importance de développer des inhibiteurs sélectifs envers ces enzymes pouvant potentiellement servir d’antibiotiques. Éventuellement, une bithérapie avec le TMP et ce nouvel antibiotique augmentera l’efficacité antibactérienne du TMP. Pour y arriver, nous avons déployé plusieurs moyens dont la continuité de la conception d’inhibiteurs basée sur les fragments (FBLD) qui fût rapportée précédemment, la conception d’inhibiteurs visant deux cibles thérapeutiques basée sur la structure des substrats ainsi que le criblage à haut débit d’une librairie d’extraits d’invertébrés marins. Puisque la DfrB1 est la plus étudiée de la famille des DfrBs, nous l’utilisons comme modèle pour ces approches dans la découverte et l’optimisation des inhibiteurs. Lors de l’optimisation des inhibiteurs issus du FBLD, nous avons obtenu des indices provenant du mode de liaison de ces inhibiteurs à la cible enzymatique et de la caractérisation biophysique de cette liaison afin de diriger les efforts de synthèse de ceux-ci. Ainsi, les connaissances des domaines de l’enzymologie et de la pharmacologie nous permettent de comprendre le mode de liaison de ces inhibiteurs. Les DfrBs possèdent une similitude de séquence protéique de 77% - 100%. À notre connaissance, aucune caractérisation cinétique des autres membres des DfrBs n’a été effectuée. En fait, pour la plupart des membres, aucune confirmation n’a été obtenue concernant la corrélation de la résistance au TMP. Nous confirmons leur activité dihydrofolate réductase ainsi que leur faible sensibilité au TMP. Avec ces résultats encourageants, nous proposons un mode d’inhibition similaire entre elles. Ainsi, les inhibiteurs de la DfrB1 testés démontrent aussi une inhibition pour les DfrBs et ce, avec la même amplitude. Nos avancées indiquent qu’il serait possible de détenir une tête de série inhibant tous les membres de cette famille.Trimethoprim (TMP) is a widely used antibiotic, both clinically as well as preventively in livestock farming and aquaculture. This broad usage causes selective pressure on bacteria. The target of this antibiotic is the chromosomal bacterial dihydrofolate reductase enzyme (Dfr), which is essential in the folate biosynthesis pathway and, therefore, in cell proliferation. Several types of resistance to TMP have been identified, including the transfer of an antibiotic-resistant plasmid between pathogenic bacteria. In clinical environments, this plasmid is of great concern, since this environment is conducive to a greater selective pressure causing the proliferation of TMP-resistant bacteria. TMP-resistant pathogenic bacteria with the plasmids carrying Dfr type B genes (dfrB) have been identified in aquaculture, livestock and wastewater. The dfrBs genes are normally tracked indirectly by the identification of integron elements underestimating the prevalence of dfrBs genes. Because it is imperative to determine the prevalence of these genes, we have demonstrated the possibility to determine their prevalence by the direct search of these genes in a North American library of TMP-resistant clinical samples. To date, no antibiotics are known to overcome the resistance caused by DfrBs. In fact, there is limited data on this emerging family. We know that DfrBs are evolutionarily and structurally unrelated to prokaryotic and eukaryotic chromosomal Dfrs. It is of great importance to develop selective inhibitors for these enzymes that could subsequently serve as potential novel antibiotics. Eventually, dual therapy with TMP and this new antibiotic could increase the antibacterial effectiveness of TMP. In order to develop such molecules, we have deployed several approaches including a follow-up of previously reported fragment-based lead design (FBLD), the design of substrate analogs as inhibitors targeting two therapeutic enzymes, as well as high-throughput screening of a library of marine invertebrate extracts. Since DfrB1 is the best studied among the DfrB family, it was used as a model for these approaches. In the optimization of inhibitors from FBLD, we studied the inhibitor’s mode of binding to direct synthetic efforts for the next generation of potential inhibitors. Thus, knowledge in the fields of enzymology and pharmacology enhances our understanding of the mode of binding of these inhibitors. Members of the DfrB family share 77% to 100% protein sequence similarity. To our knowledge, no kinetic studies of DfrB members other than DfrB1 have been performed. For most members, the correlation of TMP resistance and their source have not been confirmed. We confirm their dihydrofolate reductase activity as well as their resistance to TMP. With these encouraging results, we propose a similar mode of inhibition for all DfrBs. We demonstrate that inhibitors of DfrB1 also inhibit other DfrBs. Our advances indicate that it would be possible to have a lead compound that inhibits all members of this family

Developing a lactate-inducible transgene expression system for use in Chinese hamster ovary cells

The accumulation of lactate during cultivation of mammalian cells for biopharmaceutical production is a longstanding issue affecting glycosylation quality and productivity. Many approaches exist to mitigate its impact, either through the replacement of glucose with slowly metabolised sugars, dynamic feeding strategies, or host cell engineering. The manipulation of genes in this latter approach is constitutive and may suboptimally respond to cellular needs. The LldR proteins from Corynebacterium glutamicum and Pseudomonas aeruginosa have been used in this project to create a lactate-inducible transgene expression system, which can be used subsequently to dynamically drive expression of proteins previously targeted to mitigate the accumulation of lactate. Expression and purification of these LldR proteins, fused to transcriptional effector domains in various orientations and with fusion linkers in certain cases, allowed in vitro characterisation and optimisation of the constituent parts of the inducible system. This provided crucial information in some cases about the need to use a flexible linker between LldR and a VP64 transactivation domain. In vivo experimentation of these optimised systems showed significant levels of induction in response to 20 mM lactate, with a 3.46-fold decrease in expression seen for one construct. Some preliminary work was also carried out with Cas9-VPR, which was shown to be able to upregulate transiently transfected genes up to 1.6-fold. In the future, this will be a useful tool for upregulating multiple previously identified targets, as well as helping to find new beneficial targets. The general approach outlined here for the development of this lactate-inducible transgene expression system will be appropriate for any other such project where the ligand of interest is a central metabolite. Inherently weaker induction might be a feature of such a system, given the presence of the inducer at low and relatively benign or neutral concentrations throughout a period of interest; testing an unoptimised system in mammalian cells may return little or no detectable induction signal and therefore it will not be straightforward to optimise such a system solely through the use of in vivo experimentation. In vitro characterisation of the inducible system components, as performed here, can provide essential feedback regarding the impact of effector domain fusion and operator design on the DNA-binding affinity of the biosensor prior to in vivo testing. The work in this thesis will allow the future exploration of dynamically regulated host cell engineering designed to combat the lactate accumulation phenotype.Open Acces