Electric pulses can influence galvanotaxis of Dictyostelium discoideum

Galvanotaxis, or electrotaxis, plays an essential role in wound healing, embryogenesis, and nerve regeneration. Up until now great efforts have been made to identify the underlying mechanism related to galvanotaxis in various cells under direct current electric field (DCEF) in laboratory studies. However, abundant clinical research shows that non-DCEFs including monopolar or bipolar electric field may also contribute to wound healing and regeneration, although the mechanism remains elusive. Here, we designed a novel electric stimulator and applied DCEF, pulsed DCEF (pDCEF), and bipolar pulse electric field (bpEF) to the cells of Dictyostelium discoideum. The cells had better directional performance under asymmetric 90% duty cycle pDCEF and 80% duty cycle bpEF compared to DCEF, with 10 Hz frequency electric fields eliciting a better cell response than 5 Hz. Interestingly, electrically neutral 50% duty cycle bpEF triggered the highest migration speed, albeit in random directions. The results suggest that electric pulses are vital to galvanotaxis and non-DCEF is promising in both basic and clinical researches

Functional Analysis of Spontaneous Cell Movement under Different Physiological Conditions

Cells can show not only spontaneous movement but also tactic responses to environmental signals. Since the former can be regarded as the basis to realize the latter, playing essential roles in various cellular functions, it is important to investigate spontaneous movement quantitatively at different physiological conditions in relation to cellular physiological functions. For that purpose, we observed a series of spontaneous movements by Dictyostelium cells at different developmental periods by using a single cell tracking system. Using statistical analysis of these traced data, we found that cells showed complex dynamics with anomalous diffusion and that their velocity distribution had power-law tails in all conditions. Furthermore, as development proceeded, average velocity and persistency of the movement increased and as too did the exponential behavior in the velocity distribution. Based on these results, we succeeded in applying a generalized Langevin model to the experimental data. With this model, we discuss the relation of spontaneous cell movement to cellular physiological function and its relevance to behavioral strategies for cell survival.Comment: Accepted to PLoS ON

Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields

BACKGROUND: The existence of neural stem and progenitor cells (together termed neural precursor cells) in the adult mammalian brain has sparked great interest in utilizing these cells for regenerative medicine strategies. Endogenous neural precursors within the adult forebrain subependyma can be activated following injury, resulting in their proliferation and migration toward lesion sites where they differentiate into neural cells. The administration of growth factors and immunomodulatory agents following injury augments this activation and has been shown to result in behavioural functional recovery following stroke. METHODS AND FINDINGS: With the goal of enhancing neural precursor migration to facilitate the repair process we report that externally applied direct current electric fields induce rapid and directed cathodal migration of pure populations of undifferentiated adult subependyma-derived neural precursors. Using time-lapse imaging microscopy in vitro we performed an extensive single-cell kinematic analysis demonstrating that this galvanotactic phenomenon is a feature of undifferentiated precursors, and not differentiated phenotypes. Moreover, we have shown that the migratory response of the neural precursors is a direct effect of the electric field and not due to chemotactic gradients. We also identified that epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling plays a role in the galvanotactic response as blocking EGFR significantly attenuates the migratory behaviour. CONCLUSIONS: These findings suggest direct current electric fields may be implemented in endogenous repair paradigms to promote migration and tissue repair following neurotrauma

Gene Expression of Human Lung Cancer Cell Line CL1-5 in Response to a Direct Current Electric Field

Background: Electrotaxis is the movement of adherent living cells in response to a direct current (dc) electric field (EF) of physiological strength. Highly metastatic human lung cancer cells, CL1-5, exhibit directional migration and orientation under dcEFs. To understand the transcriptional response of CL1-5 cells to a dcEF, microarray analysis was performed in this study. Methodology/Principal Findings: A large electric-field chip (LEFC) was designed, fabricated, and used in this study. CL1-5 cells were treated with the EF strength of 0mV/mm (the control group) and 300mV/mm (the EF-treated group) for two hours. Signaling pathways involving the genes that expressed differently between the two groups were revealed. It was shown that the EF-regulated genes highly correlated to adherens junction, telomerase RNA component gene regulation, and tight junction. Some up-regulated genes such as ACVR1B and CTTN, and some down-regulated genes such as PTEN, are known to be positively and negatively correlated to cell migration, respectively. The protein-protein interactions of adherens junction-associated EF-regulated genes suggested that platelet-derived growth factor (PDGF) receptors and ephrin receptors may participate in sensing extracellular electrical stimuli. We further observed a high percentage of significantly regulated genes which encode cell membrane proteins, suggesting that dcEF may directly influence the activity of cell membrane proteins in signal transduction. Conclusions/Significance: In this study, some of the EF-regulated genes have been reported to be essential whereas others are novel for electrotaxis. Our result confirms that the regulation of gene expression is involved in the mechanism of electrotactic response

細胞性粘菌の走気性の現象と機構に関する研究

Tohoku University船本健一課

Actuation and control of microfabricated structures using flagellated bacteria

In this work methods of actuation and control of microfabricated structures are investigated using bacteria as configurable, scalable actuators. Bacteria offer many benefits as microfluidic actuators. They draw chemical energy directly from their environment, they can be operated in a wide range of temperature and pH, and literally billions of bacteria may be cultured within hours. Additionally, the well-documented responses of individual motile bacterial cells may be expected to scale up to arrays of cells. On this population scale, the cellular responses can be employed en masse creating controlled forces that actuate inorganic microfabricated elements. For these investigations the bacterium Serratia marcescens has been chosen. S. marcescens has properties that are particularly appropriate for engineering applications. When cultured on soft agar, the bacteria demonstrate a form of surface motility known as swarming. These investigations start with an experimental analysis of the swarming cell motility using a non-labeled cell tracking technique. The results of these studies reveal that the most energetic bacteria populate the progressing edge of the swarm. A technique of biocompatible microfabrication and chemical release of bacteria-driven microstructures is also presented. This method is used to pattern structure surfaces with the rigorous swarming cells by direct blotting. The self-coordinated motion of the cells is investigated for use as arrays of actuators. Control mechanisms are investigated to adjust rotational and translational motion using optical and electrical stimuli, respectively. The fundamentals of the electrokinetics are also investigated and integrated into a system demonstrating controlled manipulation of target objects and phenotypic chemical sensing.Ph.D., Mechanical Engineering -- Drexel University, 200

Structure, Dynamics, and Regulation of Collective Cell Migration

Collective migration is the process by which cells organize individual motions to productively migrate as a group and plays a fundamental role in organism development, tissue regeneration, and cancer invasion. In development, coordinated migration facilitates the formation of complex organ structures and is required for proper dissemination of neural crest cells throughout an organism. After injury, this process allows breaches in epithelial layers to be repaired while maintaining tissue integrity, and in cancer, collective behavior enhances invasion of tumor cells into the surrounding tissue. Chapter 1 provides an introduction for the role of collective migration across an organism’s lifespan, the mechanisms used by cells to generate motile force, and the emergence of collective behavior. Chapter 2 dissects the intertwined roles of three fundamental parameters often altered in collective migration processes: cell density, cell adhesion, and cell-cell contractility through the Rho-ROCK-Myosin II signaling axis. Through quantitative analysis of large-scale time-lapse imaging and mathematical modeling, I identify force-sensitive contractility and cell packing as mediators of two distinct classes of collective migration. From these results, I formulate a phase-diagram of collective cell migration and test predictions in an in-vivo epithelium using genetic manipulations to drive collective motion between predicted migratory phases. In Chapter 3, the effect of phenotypic heterogeneity on the organization of cells is examined, providing insight into the effects of early cancer progression on epithelial dynamics. I find that mutant cells within an otherwise wild-type tissue impact organization through local and field-effects, disrupting normal dynamics and leading to cell-type segregation. Chapter 4 provides a theoretical framework for quantitatively understanding and predicting the dynamics of protein interactions underlying biological processes including collective migration. Traditional chemical kinetics approaches break down in situations where components are slow diffusing or in countable numbers, requiring the formulation of new models that take into account this level of complexity. Here I develop an event-driven algorithm that bridges well-mixed and unmixed systems and use it to predict the effect of apparent changes in enzymatic efficiency due to alterations in mobility that may be caused by protein complex formation. Overall the work in this dissertation advances our understanding of the structure and dynamics of collective migration and the parameters governing this process by combining quantitative statistical analysis, mathematical modeling, and in-vivo live imaging

Efecto de nanotubos de carbono de pared múltiple sobre las señales bioeléctricas de neuronas de Helix aspersa

Antecedentes y justificación. Los nanotubos de carbono (NTC) son materiales desarrollados por la nanotecnología. Los NTC tienen la característica de poder adquirir y transmitir señales bioeléctricas debido a sus dimensiones nanométricas, a su alta capacidad de conducción eléctrica y a su capacidad de adherirse a las membranas celulares. Se han usado distintos nanotubos de carbono de pared simple (NTCPS) y nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM) como andamios o “scafolds” para cultivo de células nerviosas y se han reportado resultados controversiales en cuanto a su toxicidad, biocompatibilidad celular y crecimiento neuronal. No está claro si los NTC tienen un efecto bloqueante sobre los canales iónicos que subyacen a las señales bioeléctricas neuronales, tales como potenciales de acción y potenciales sinápticos. En particular no se ha demostrado ni evaluado la posible toxicidad de los NTCPM sobre los canales iónicos dependientes de voltaje (canales de calcio y canales de potasio) ni sobre los canales iónicos dependientes de agonista (canales acoplados al receptor de L-glutamato, acetilcolina y dopamina). Más aún, no se ha demostrado si los NTCPM pueden conectar eléctricamente a dos o más neuronas entre sí. i-2) Objetivos. a). Estudiar las propiedades ultraestructurales de los NTCPM dispersos en soluciones acuosas y depositados sobre distintos materiales incluyendo los depositados sobre las neuronas del ganglio del caracol de jardín Helix aspersa. b). Estudiar las propiedades eléctricas de los NTCPM depositados sobre distintos materiales. c). Estudiar los posibles efectos citotóxicos de los NTCPM sobre las señales eléctricas de las neuronas del caracol de jardin Helix aspersa . Específicamente, estudiar si los NTCPM bloquean o modifican la permeabilidad de canales iónicos dependientes del voltaje (canal de calcio y canal de potasio que dependen del calcio) y su efecto sobre canales iónicos dependientes de agonista químico o neurotransmisores (acetilcolina, dopamina y L-glutamato), que subyacen a los potenciales de acción y a los potenciales sinápticos de las neuronas de Helix aspersa . 6 i-3) Material y métodos. Nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM) usados en este proyecto. Los NTCPM fueron sintetizados por el método de pirólisis de aspersión y fueron funcionalizados con soluciones ácidas de ácido nítrico - ácido sulfúrico; fueron dispersados en soluciones acuosas: agua desionizada y solución Ringer de caracol, usando polivinilpirrolidona (PVP) como agente dispersante. Los NTCPM ya dispersados en PVP fueron sometidos a ultrasonido y con ello se aseguró la homogeneidad de la dispersión. Propiedades ultraestructurales de NTCPM. Los NTCPM dispersados en soluciones acuosas fueron colocados sobre distintos materiales: papel bond, vidrio, filtros de PVDF y láminas de cobre. También los NTCPM se depositaron sobre las neuronas de Helix aspersa . Sus propiedades morfológicas y ultraestructurales se caracterizaron mediante el uso de diversos estudios: microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido, microscopía electrónica de transmisión, microscopía confocal y microscopía de fuerza atómica. Preparación biológica. Las neuronas identificadas del invertebrado caracol de jardín H e lix a s p e r s a fueron utilizadas como modelo biológico en este trabajo de tesis. Estas neuronas presentan propiedades bioeléctricas y canales iónicos similares a los que existen en neuronas de mamífero, por lo que estas neuronas de invertebrado han sido utilizadas como modelos biológicos en múltiples estudios en el campo de la investigación básica en neurociencias. Las neuronas del caracol Helix aspersa son fácilmente identificables, tanto morfológica como electrofisiológicamente; presentan actividad eléctrica espontánea y su membrana celular posee canales iónicos de K+ y Ca2+, así como canales iónicos acoplados a receptores membranales como dopamina, L-glutamato y acetilcolina. Experimentos electrofisiológicos de registro intracelular. En el desarrollo experimental de este proyecto se utilizaron técnicas electrofisiológicas convencionales de registro intracelular con microelectrodos en el modo de fijación de corriente. En estos experimentos se monitorearon señales bioeléctricas neuronales tales como: i). Potencial de membrana, ii). Actividad eléctrica espontánea, iii). Hiperpolarización postetánica, iv). Potencial de acción cálcico, v). Despolarización membranal activada por glutamato y carbacol y vi). Hiperpolarización membranal activada por dopamina. i-4) Resultados experimentales. a). Se estudiaron distintos compuestos para lograr una dispersión adecuada de los NTCPM en soluciones acuosas. Entre los diferentes compuestos ensayados se encontró que dimetilformamida es un buen dispersante, pero es tóxico para las células. Pluronic F-127 no era tóxico para las células, pero no se dispersaban eficientemente los NTCPM. La Polivinilpirrolidona (PVP) fue el mejor dispersante encontrado para NTCPM y no tiene ningún efecto tóxico en las neuronas y células estudiadas. Se demostró que la manipulación mecánica por sonicación de NTCPM, así como el uso de dispersantes biocompatibles, mejoran la dispersión de NTCPM en soluciones acuosas. b). Mediante el uso de estudios de microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido, microscopía electrónica de transmisión, microscopía confocal y microscopía de fuerza atómica, se caracterizaron las propiedades ultraestructurales de los NTCPM depositados en distintos materiales: papel bond, vidrio, filtros de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y laminas de cobre; así como los aplicados sobre las neuronas de Helix aspersa . c). En este trabajo de tesis se encontró que los electrodos hechos con NTCPM y depositados sobre papel bond y filtros de PVDF tienen una menor resistencia; por consiguiente una mejor conductividad en comparación con otros materiales electroconductores, tales como la plata y la pintura de grafeno. Se realizaron estudios de microscopía de fuerza atómica (AFM) y estudios de microscopía electrónica de barrido (SEM) con el fin de caracterizar las propiedades ultraestructurales y de distribución de NTCPM en filtros de PVDF. Se observó que los electrodos hechos con NTCPM colocados sobre filtros de PVDF tienen una distribución topográfica caótica y éstos no están alineados; sin embargo, los NTCPM depositados sobre los filtros de PVDF mostraron una resistencia eléctrica lineal sin rectificación. Además se demostró que los electrodos de NTCPM pueden utilizarse para el registro y detección de señales bioeléctricas, ya que dichos electrodos fueron capaces de registrar señales electrocardiográficas en humanos con resolución y eficiencia similar a los registrados con electrodos convencionales de plata. d). En otra serie de experimentos se obtuvieron resultados que demuestran que los NTCPM son sensibles a la irradiación del láser y que este estímulo reduce sistemáticamente su resistencia eléctrica intrínseca. La resistencia eléctrica de los NTCPM se midió en condiciones de control y cuando se les aplicó un haz de láser 8 continuo cercano al infrarrojo (nIR-láser) a una longitud de onda de 650 nm. Se encontró que los NTCPM mostraron un valor constante de la resistencia eléctrica y dicho valor de resistencia fue dependiente de la cantidad de nanotubos aplicada sobre los filtros de PVDF. La resistencia media de los NTCPM sobre filtros de PVDF fue como sigue (en ohms): 23, 307 y 2275 en diluciones 1, 1:10 y 1:100 de la solución madre de NTCPM (5 mg/mL) respectivamente. Se demostró que nIR-láser disminuyó la resistencia eléctrica en forma transitoria, ya que al suspender la irradiación láser dicho valor de resistencia se recuperó a valores normales. Además se observó un pequeño aumento de la temperatura (1.2 a 3.2 °C) durante la irradiación con láser. Los resultados aquí presentados apoyan la hipótesis de que la irradiación láser modula, con una alta sensibilidad, las propiedades eléctricas y térmicas intrínsecas de los NTCPM. e). Existen reportes controversiales respecto a la toxicidad de los NTC en las células neuronales y su posible efecto de bloqueo de permeabilidad de canales iónicos presentes en neuronas y otras células excitables. En este trabajo de tesis se evaluó el posible efecto bloqueante de NTCPM sobre las permeabilidades iónicas dependientes de voltaje de las neuronas de Helix aspersa . Se realizaron estudios de microscopía óptica, electrónica de barrido y microscopía confocal para demostrar que los NTCPM aplicados sobre las neuronas están dispersados adecuadamente; pueden adherirse a las membranas neuronales y eventualmente podrían bloquear las permeabilidades de canales iónicos localizados en la membrana celular. En experimentos iniciales, los NTCPM fueron marcados con isotiaocianato de fluoresceína (FITC) y con técnicas de microscopía confocal, y se estudió la posible interacción de estos nanotubos fluorescentes con la membrana celular de neuronas del caracol Helix aspersa . En otra serie de experimentos se analizaron neuronas íntegras y cortes histológicos de neuronas del ganglio de Helix aspersa con técnicas de microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido, así como microscopía confocal, en donde las neuronas fueron tratadas con NTCPM sin marcaje con fluoresceína. Se pudo demostrar que los NTCPM se adhieren a la membrana celular, atraviesan dicha membrana y tienden a acumularse al interior del citoplasma y sobre el núcleo. f). Habiendo demostrado que los NTCPM se adhieren a la membrana celular y pueden atravesar dicha membrana, se realizaron experimentos de registro intracelular en la configuración de fijación de corriente con el propósito de evaluar el posible efecto de NTCPM sobre: i). La amplitud y la duración del potencial de acción normal, ii). La hiperpolarización postetánica y iii). La duración del potencial de acción de calcio (PA-Ca 2+) en las neuronas de Helix aspersa . En estos experimentos se encontró que los NTCPM no bloquearon ni modificaron la amplitud ni la mofología de los potenciales de acción normales y potenciales de acción cálcicos; tampoco modificaron la hiperpolarización postetánica. Por lo anterior se puede inferir que los NTCPM no bloquean los canales de sodio, ni de potasio, ni de calcio dependientes de voltaje presentes en la membrana neuronal de las neuronas de Helix aspersa . g). En otra serie de experimentos se estudiaron los posibles efectos tóxicos de los NTCPM sobre la permeabilidad iónica de los canales ionicos activados por agonistas y neurotransmisores. La técnica convencional de registro intracelular en el modo de fijación de corriente fue la utilizada para evaluar las propiedades electrofisiológicas de los canales ionicos activados por dopamina, L- glutamato y carbacol en la neurona 1F. En estos experimentos electrofisiológicos se caracterizaron la presencia de estos receptores membranales en las neuronas de Helix aspersa , así como sus propiedades farmacológicas. Se encontró que el receptor colinérgico en neurona 1F es de tipo muscarínico M1-M3, ya que la despolarización membranal activada por carbacol es inhibida por atropina y pirenzepina y es incrementada con oxotremorina. En el caso de la hiperpolarización activada por dopamina se encontró que dicha hiperpolarización es regulada por receptores dopaminérgicos tipo D2, ya que los fármacos metoclopramida y ergometrina (antagonistas específicos de los receptores dopaminérgicos D2) bloquean la respuesta de la dopamina. En el caso de la respuesta glutamatérgica se encontró que la despolarización activada por glutamato es moderadamente sensible a bloqueadores tipo ampa-kainato. Se encontró que esta respuesta muscarínica, glutamatérgica y dopaminérgica de la neurona 1F no es bloqueada por los NTCPM a concentraciones de hasta 0.5 mg/mL. De esta serie de experimentos se concluye que los NTCPM no bloquean los canales iónicos dependientes de agonistas. 10 h). Se evaluaron los efectos de NTCPM en otras preparaciones biológicas (células de protistas y de mamíferos) con el propósito de corroborar la no toxicidad y la biocompatibilidad de los NTCPM usados en este trabajo de tesis. Se encontró que los NTCPM son incorporados al interior del citoplasma del Paramecium; no por simple difusión, sino por un proceso membranal de endocitosis. Estos nanotubos no modificaron la sobrevida ni el nado normal del Paramecium; sin embargo, a altas concentraciones de NTCPM, de más de 200 µg/mL, se modificó la conducta de galvanotaxis del ciliado. En otra serie de experimentos se estudió el posible efecto citotóxico de NTCPM en neuronas del hipocampo de mamífero. En dichos experimentos, se encontró que las neuronas de hipocampo de rata cultivadas y depositadas sobre un andamio o “scaffold” hecho con los NTCPM presentaron propiedades electrofisiológicas similares a las neuronas cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio sin NTCPM. Se observó que la transmisión sináptica entre pares de neuronas no fue inhibida; más aún, dicha actividad sináptica se vio incrementada. i-5) Conclusiones y perspectivas. En los experimentos realizados para este trabajo de tesis, se logró una dispersión eficiente de NTCPM en soluciones acuosas. Los NTCPM tienen las siguientes características: i). Presentan una baja resistencia eléctrica y consecuentemente una alta conductividad, ii). No tienen un efecto deletéreo o tóxico sobre las propiedades eléctricas de las neuronas de caracol, iii). No bloquean los canales iónicos dependientes de voltaje, y iv). No bloquean los canales iónicos dependientes de agonista. Se demostró que los NTCPM se pueden usar como electrodos de registro para sensar y registrar señales bioeléctricas, tales como el electrocardiograma en humanos. Además se demostró que la resistencia intrínseca de los NTCPM se disminuye al exponer dichos NTCPM a la irradiación láser cercano al infrarrojo. Sin embargo, queda aún pendiente el demostrar que los NTCPM incorporados a electrodos de registro puedan registrar la actividad eléctrica neuronal. También será necesario estudiar si los NTCPM pueden conectar eléctricamente a dos o más neuronas entre sí. Considerando la alta sensibilidad de los NTCPM al láser, estos materiales podrán ser usados en futuros experimentos como alternativa terapéutica para el cáncer, al aplicarse dichos NTCPM en procesos tumorales para lograr ablación tumoral usando el método de hipertermia inducida por láser en tumores cancerosos