Familial thyroid cancer : identification of novel susceptibility genes

Thyroid cancer is the most common malignancy of the endocrine system. The majority of thyroid cancers derive from the follicular cells, being designated as non-medullary thyroid carcinomas (NMTC). NMTC also occurs in a familial form, entitled familial non-medullary thyroid carcinoma (FNMTC), representing 3-9% of all thyroid cancers. FNMTC is currently defined by the diagnosis of two or more first degree relatives with differentiated thyroid cancer of follicular cell origin. The family members frequently present benign lesions of the thyroid, such as multinodular goiter (MNG). Several FNMTC susceptibility genes have been reported, such as NKX2.2, FOXE1 and DICER1, but these are mutated only in a small fraction of families. Thus, the molecular basis of FNMTC is still mostly unknown, being regarded as a genetically heterogeneous disease. Recently, germline truncating mutations in DNA repair-related genes have been described in cases of thyroid cancer. In addition, activating mutations in BRAF and RAS oncogenes have been reported to be involved in familial thyroid tumour progression. In order to further clarify the molecular basis of FNMTC, the main goal of this project was to identify novel susceptibility gene(s) for this disease. To achieve this aim, three different approaches were used: the study of a very representative family of our cohort (six affected members with NMTC) through wholeexome sequencing (WES); the analysis of 94 genes associated with hereditary cancer predisposition in 48 probands from FNMTC families, through next-generation sequencing (NGS), using a commercial panel (Trusight Cancer Kit); and the analysis of the candidate genes telomerase reverse transcriptase (TERT) and eukaryotic translation initiation factor 1A X-linked (EIF1AX), selected based on previous evidence for their involvement in familial and/or sporadic thyroid cancer. The analysis of the FNMTC family with six-affected members through WES generated above 300,000 variants for each sample. Significant variants were selected through bioinformatics analysis, sets of filters, and validated using Sanger sequencing. In silico prediction, literature and database search of gene function and expression, were used to select potentially pathogenic variants, which was followed by analysis of their segregation with the disease in the family. The variant (c.701C>T, p.Thr234Met) in SPRY4 gene was prioritised for functional studies. To disclose the contribution of this variant to thyroid tumourigenesis, functional studies were performed using three cell models (NIH/3T3, PCCL3 and TPC-1). Overall, mutant SPRY4, compared to the wild-type, induced an increase in cell proliferation/viability, colony formation and in phosphorylation levels of proteins involved in MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways. These results are in accordance with the well-established role of these signalling mechanisms in thyroid tumour development. Overall, these data suggested, for the first time, a role for SPRY4 in familial thyroid cancer initiation. In the NGS analysis of 94 genes in the 48 probands from FNMTC families, a total of 20,160 variants were identified. In silico analysis of NGS data unveiled 47 likely pathogenic germline variants in genes involved in DNA repair (33 variants) and in other hereditary cancer predisposing genes (14 variants). From these variants, only 18 segregated with FNMTC in 13 families, of which 15 variants were in DNA repair genes (APC, ATM, CHEK2, ERCC2, BRCA2, ERCC4, FANCA, FANCD2, FANCF, BRIP1 and PALB2), two in DICER1, and one in RHBDF2. These results reinforced the relevance of DNA repair genes and DICER1 in FNMTC aetiology and extended the present knowledge, by suggesting CHEK2, ERCC4, FANCA, FANCD2, FANCF, PALB2, BRIP1 and RHBDF2 as susceptibility genes for this disease. The main mechanisms involved in DNA repair, which may be altered according to this study, include the repair of double-strand breaks by homologous recombination (CHEK2, ATM, BRIP1, BRCA2, FANCD2 and PALB2 genes) and by DNA interstrand crosslink repair (FANCA and FANCF genes); the other mechanisms include repair of single-strand breaks by nucleotide excision repair (ERCC4 and ERCC2 genes) and by base excision repair (APC gene). In the approach that involved the direct study of candidate genes in FNMTC, using Sanger sequencing, no potentially pathogenic germline variants were identified in the TERT promoter in the 75 FNMTC families’ probands. However, in 54 familial thyroid tumours studied, we identified mutations in TERT promoter (9%), BRAF (41%), and RAS (7%), but no mutations were identified in EIF1AX. TERT-positive samples were also positive for BRAF, and this co-occurrence was statistically significant (p=0.008). In addition, TERT mutations in concomitance with BRAF mutations, had a significant correlation with more advanced tumour stages (T4) (p=0.020). This study showed that TERT promoter mutations are not frequently involved in FNMTC aetiology, but rather implicated in tumour progression and aggressiveness, when coexisting with BRAF mutations. Overall, we have identified novel susceptibility genes that are likely to participate in FNMTC tumourigenesis: SPRY4 seems to explain thyroid cancer aetiology in the FNMTC family studied and DNA repair genes may also be involved in FNMTC initiation. The oncogenic role of RAS and BRAF mutations in familial thyroid tumour progression was confirmed, and coexistent mutations in TERT promoter and BRAF were, for the first time, implicated in the progression and aggressiveness of FNMTC. This study improved the present knowledge of the genetic basis of FNMTC and further supported that this is a genetically heterogeneous disease. The identification of these genes involved in the initiation and progression of FNMTC, if supported by future studies in other cohorts, may allow families with this disease to undergo early diagnosis, and improve the clinical management of these patients.O carcinoma da tiróide é a neoplasia mais comum do sistema endócrino. A maioria dos carcinomas da tiróide deriva das células foliculares, sendo designados carcinomas nãomedulares da tiróide (NMTC). Os NMTC podem apresentar-se como forma familiar, que é denominada FNMTC (carcinoma não-medular da tiróide familiar), representando 3 a 9% de todos os carcinomas da tiróide. O FNMTC é definido pelo diagnóstico de dois ou mais familiares em primeiro grau com carcinoma da tiróide de origem folicular. Frequentemente os familiares apresentam lesões benignas da tiróide, como o bócio multinodular (MNG). Embora tenham sido mapeados e identificados alguns genes de susceptibilidade para o FNMTC (e.g. NKX2.2, FOXE1 e DICER1), estes encontram-se alterados apenas numa reduzida fracção das famílias. Desta forma, a base molecular do FNMTC permanece essencialmente desconhecida, sendo considerada uma doença geneticamente heterogénea. Recentemente, foram descritas mutações germinais truncantes em genes de reparação do DNA em casos com cancro da tiróide. A progressão dos tumores da tiróide de origem familiar envolve a ocorrência de mutações somáticas activadoras nos genes BRAF e RAS. De modo a clarificar a base molecular do FNMTC, o objectivo principal deste projecto foi identificar novo(s) gene(s) de susceptibilidade para esta doença. De modo a alcançar este objectivo foram utilizadas três abordagens diferentes: a análise por sequenciação global do exoma (WES) de uma das famílias mais representativas da série em estudo (seis membros afectados com NMTC); a análise de 94 genes que predispõem para cancro hereditário, em 48 probandos de famílias com FNMTC, através de sequenciação de nova geração (NGS), utilizando um painel comercial (Trusight Cancer Kit); por último, foram analisados dois genes candidatos, TERT e EIF1AX, seleccionados com base em evidências prévias do seu envolvimento no cancro familiar e/ou esporádico da tiróide. A análise através de WES de seis membros afectados da família com FNMTC, gerou mais de 300.000 variantes por cada amostra. As variantes mais relevantes foram seleccionadas através de análise bioinformática, uso de filtros específicos e validadas através da sequenciação de Sanger. Recorreu-se à predição in silico, pesquisa na literatura e em bases de dados sobre a função e expressão génica para seleccionar as variantes potencialmente patogénicas, e em seguida realizaram-se estudos da segregação das variantes com a doença na família. A variante (c.701C>T, p.Thr234Met) no gene SPRY4 foi priorizada para estudos funcionais. Efectuaram-se estudos funcionais em três modelos celulares (NIH/3T3, PCCL3 e TPC-1) para avaliar a possível contribuição desta variante para a tumorigénese na tiróide. Observou-se que a variante induzia um aumento na proliferação/viabilidade celular, na formação de colónias e nos níveis de fosforilação de proteínas envolvidas nas vias MAPK/ERK e PI3K/AKT. Estes dados estão de acordo com o papel bem estabelecido para estes mecanismos de sinalização no desenvolvimento dos tumores da tiróide. Concluindo, estes resultados sugeriram, pela primeira vez, um papel para o gene SPRY4 na iniciação tumoral do cancro da tiróide familiar. Na análise dos 94 genes através de NGS nos 48 probandos das famílias com FNMTC, identificou-se um total de 20.160 variantes. Os dados da análise in silico do NGS revelaram 47 variantes germinais potencialmente patogénicas, em genes envolvidos na reparação do DNA (33 variantes) e noutros genes relacionados com a predisposição para o cancro hereditário (14 variantes). Destas variantes apenas 18 segregaram com a doença em 13 famílias, das quais 15 variantes ocorriam em genes de reparação do DNA (APC, ATM, CHEK2, ERCC2, BRCA2, ERCC4, FANCA, FANCD2, FANCF, BRIP1 and PALB2), duas no gene DICER1 e uma no gene RHBDF2. Estes resultados reforçaram a relevância dos genes de reparação do DNA e do gene DICER1 na etiologia do FNMTC, contribuindo para o conhecimento actual através da identificação de genes, tais como o CHEK2, ERCC4, FANCA, FANCD2, FANCF, PALB2, BRIP1 e RHBDF2, como estando possivelmente envolvidos na susceptibilidade para esta doença. Os principais mecanismos envolvidos na reparação do DNA, que foram identificados como estando alterados neste estudo, incluem a reparação da quebra da dupla cadeia de DNA através de recombinação homóloga (genes CHEK2, ATM, BRIP1, BRCA2, FANCD2 e PALB2) e a reparação do tipo “interstrand crosslink” do DNA (genes FANCA e FANCF); os outros mecanismos incluem a reparação da quebra da cadeia simples de DNA por excisão de nucleótido (genes ERCC4 e ERCC2) e por excisão de base (gene APC). Na abordagem que envolveu o estudo directo de genes candidatos para FNMTC, utilizouse a sequenciação de Sanger, não tendo sido identificadas variantes potencialmente patogénicas a nível germinal no promotor do TERT, nos 75 probandos das famílias estudadas. Contudo, nos 54 tumores da tiróide dos familiares estudados identificaram-se mutações no promotor do TERT (9%), BRAF (41%) e RAS (7%), não tendo sido identificadas mutações no gene EIF1AX. As amostras positivas para o TERT também eram positivas para o BRAF, sendo esta co-ocorrência estatisticamente significativa (p=0.008). Além disso, as mutações no gene TERT em concomitância com mutações no gene BRAF revelaram uma correlação significativa em estádios mais avançados do tumor (T4) (p=0.020). Este estudo demonstrou que as mutações no promotor do TERT não estão envolvidas na etiologia do FNMTC, mas sim implicadas na progressão e agressividade tumoral, quando coexistem com mutações no BRAF. Concluindo, identificaram-se genes que poderão estar envolvidos na tumorigénese do FNMTC. O gene SPRY4 poderá explicar a etiologia dos tumores da tiróide na família com FNMTC estudada e os genes de reparação do DNA parecem estar implicados na iniciação do FNMTC em diferentes famílias. Confirmou-se o papel oncogénico dos genes RAS e BRAF na progressão dos tumores da tiróide de origem familiar e, pela primeira vez, demonstrou-se que a coexistência de mutações no promotor do TERT e no BRAF está relacionada com a progressão e agressividade em FNMTC. O presente estudo incrementou o conhecimento actual sobre a base genética do FNMTC e corroborou que se trata de uma doença geneticamente heterogénea. A identificação destes genes envolvidos na iniciação e progressão do FNMTC, se suportado por estudos noutras séries, poderá permitir que famílias com esta doença tenham acesso a um diagnóstico precoce, facilitando o manejo clínico dos doentes

In silico Analysis of Publicly Available Transcriptomics Data Identifies Putative Prognostic and Therapeutic Molecular Targets for Papillary Thyroid Carcinoma

Background: Thyroid cancer is the most common endocrine malignancy. However, the molecular mechanism involved in its pathogenesis is not well characterized. Purpose: The objective of this study is to identify key cellular pathways and differentially expressed genes along the thyroid cancer pathogenesis sequence as well as to identify potential prognostic and therapeutic targets. Methods: Publicly available transcriptomics data comprising a total of 95 samples consisting of 41 normal, 28 non-aggressive and 26 metastatic papillary thyroid carcinoma (PTC) cases were used. Transcriptomics data were normalized and filtered identifying 9394 differentially expressed genes. The genes identified were subjected to pathway analysis using absGSEA identifying PTC related pathways. Three of the genes identified were validated on 508 thyroid cancer biopsies using RNAseq and TNMplot. Results: Pathway analysis revealed a total of 2193 differential pathways among non-aggressive samples and 1969 among metastatic samples compared to normal tissue. Pathways for non-aggressive PTC include calcium and potassium ion transport, hormone signaling, protein tyrosine phosphatase activity and protein tyrosine kinase activity. Metastatic pathways include growth, apoptosis, activation of MAPK and regulation of serine threonine kinase activity. Genes for non-aggressive are KCNQ1, CACNA1D, KCNN4, BCL2, and PTK2B and metastatic PTC are EGFR, PTK2B, KCNN4 and BCL2. Three of the genes identified were validated using clinical biopsies showing significant overexpression in aggressive compared to non-aggressive PTC; EGFR (p < 0.05), KCNN4 (p < 0.001) and PTK2B (p < 0.001). DrugBank database search identified several FDA approved drug targets including anti-EGFR Vandetanib used to treat thyroid cancer in addition to others that may prove useful in treating PTC. Conclusion: Transcriptomics analysis identified putative prognostic targets including EGFR, PTK2B, BCL2, KCNQ1, KCNN4 and CACNA1D. EGFR, PTK2B and KCN44 were validated using thyroid cancer clinical biopsies. The drug search identified FDA approved drugs including Vandetanib in addition to others that may prove useful in treating the disease

Genetics of familial non-medullary thyroid carcinoma (FNMTC)

Non-medullary thyroid carcinoma (NMTC) is the most frequent endocrine tumor and originates from the follicular epithelial cells of the thyroid. Familial NMTC (FNMTC) has been defined in pedigrees where two or more first-degree relatives of the patient present the disease in absence of other predisposing environmental factors. Compared to sporadic cases, FNMTCs are often multifocal, recurring more frequently and showing an early age at onset with a worse out-come. FNMTC cases show a high degree of genetic heterogeneity, thus impairing the identification of the underlying molecular causes. Over the last two decades, many efforts in identifying the susceptibility genes in large pedigrees were carried out using linkage-based approaches and genome-wide association studies, leading to the identification of susceptibility loci and variants associated with NMTC risk. The introduction of next-generation sequencing technologies has greatly contrib-uted to the elucidation of FNMTC predisposition, leading to the identification of novel candidate variants, shortening the time and cost of gene tests. In this review we report the most significant genes identified for the FNMTC predisposition. Integrating these new molecular findings in the clinical data of patients is fundamental for an early detection and the development of tailored ther-apies, in order to optimize patient management

Implications of Na+/I- Symporter transport to the plasma membrane for thyroid hormonogenesis and radioiodide therapy

Iodine is a crucial component of thyroid hormones; therefore, a key requirement for thyroid hormone biosynthesis is that iodide (I2) be actively accumulated in the thyroid follicular cell. The ability of the thyroid epithelia to concentrate I2 is ultimately dependent on functional Na+/ I2 symporter (NIS) expression at the plasma membrane. Underscoring the significance of NIS for thyroid physiology, loss-of-function mutations in the NIS-coding SLC5A5 gene cause an I2 transport defect, resulting in dyshormonogenic congenital hypothyroidism. Moreover, I2 accumulation in the thyroid cell constitutes the cornerstone for radioiodide ablation therapy for differentiated thyroid carcinoma. However, differentiated thyroid tumors often exhibit reduced (or even undetectable) I2 transport compared with normal thyroid tissue, and they are diagnosed as cold nodules on thyroid scintigraphy. Paradoxically, immunohistochemistry analysis revealed that cold thyroid nodules do not express NIS or express normal, or even higher NIS levels compared with adjacent normal tissue, but NIS is frequently intracellularly retained, suggesting the presence of posttranslational abnormalities in the transport of the protein to the plasma membrane. Ultimately, a thorough comprehension of the mechanisms that regulate NIS transport to the plasma membrane would have multiple implications for radioiodide therapy, opening the possibility to identify new molecular targets to treat radioiodide-refractory thyroid tumors. Therefore, in this review, we discuss the current knowledge regarding posttranslational mechanisms that regulate NIS transport to the plasma membrane under physiological and pathological conditions affecting the thyroid follicular cell, a topic of great interest in the thyroid cancer field.Fil: Martín, Mariano. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Geysels, Romina Celeste. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; ArgentinaFil: Peyret, Victoria. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Bernal Barquero, Carlos Eduardo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; ArgentinaFil: Masini-Repiso, Ana María. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; ArgentinaFil: Nicola, Juan Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentin

Teneurins: Role in Cancer and Potential Role as Diagnostic Biomarkers and Targets for Therapy

Teneurins have been identified in vertebrates as four different genes (TENM1-4), coding for membrane proteins that are mainly involved in embryonic and neuronal development. Genetic studies have correlated them with various diseases, including developmental problems, neurological disorders and congenital general anosmia. There is some evidence to suggest their possible involvement in cancer initiation and progression, and drug resistance. Indeed, mutations, chromosomal alterations and the deregulation of teneurins expression have been associated with several tumor types and patient survival. However, the role of teneurins in cancer-related regulatory networks is not fully understood, as both a tumor-suppressor role and pro-tumoral functions have been proposed, depending on tumor histotype. Here, we summarize and discuss the literature data on teneurins expression and their potential role in different tumor types, while highlighting the possibility of using teneurins as novel molecular diagnostic and prognostic biomarkers and as targets for cancer treatments, such as immunotherapy, in some tumors

Identifying Diagnostic and Prognostic targets for Papillary Thyroid Carcinoma through mining Gene Expression BIG Datasets using Adaptive Filtering and Advanced Bioinformatics Algorithms

Thyroid Cancer is the most common endocrine malignancy. Although the mortality rate of thyroid cancer is considered to be low, however the reoccurrence and persistence of the disease is still considered high. The most common type of thyroid cancer is papillary thyroid carcinoma consisting of >70% of all types of thyroid cancer. Thyroid cancer is heterogeneous and complex. BIG data in the form of publicly available gene expression (transcriptomics) datasets can provide valuable source to gain deeper understanding of complex diseases such as papillary thyroid carcinoma (PTC). In this study, we used a novel bioinformatics method based on adaptive filtering to reduce the number of genes expressed eliminating genes that are invariant across the various disease stages. In order to shed light on some of the mechanisms involved in PTC, the filtered genes were used in systematic pathway analysis searches across 20,500 annotated cellular pathways using modified Kolmogorov-Smirnov algorithm to identify the relevant differentially activated cellular pathways across the various stages of the disease. Our analysis from 95 PTC patient biopsies consisting of 41 normal, 28 nonaggressive and 26 metastatic papillary thyroid carcinoma revealed 2193 differential activated cellular pathways among non-aggressive samples and 1969 among metastatic samples compared to normal tissue. The key pathways for non-aggressive PTC includes calcium and potassium ion transport, hormone signaling pathways, protein tyrosine phosphatase activity and protein tyrosine kinase activity. The key pathways for metastatic PTC include growth, apoptosis, activation of MAPK activity and regulation of serine threonine kinase activity. The most frequent genes across the enriched pathways were KCNQ1, CACNA1D, KCNN4, BCL2, and PTK2B for non-aggressive PTC, and EGFR, PTK2B, KCNN4 and BCL2 for metastatic PTC. Survival analysis results showed that PTK2B, CACNA1D and BCL2 contributed to poor survival of PTC patients. The study identified insights into mechanisms of PTC

In vitro assessment of the oncogenic potential of novel MTC-associated germline RET mutations

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Thyroid carcinoma is the most frequent endocrine malignancy. Medullary thyroid carcinoma (MTC) is one of the thyroid tumors and represents about 5 to 8% of all cases. It arises from C cells (parafollicular cells), in contrast with the other thyroid tumors that arise from follicular cells. MTC can occur either in a sporadic or hereditary form, being the latter associated to multiple endocrine neoplastic type 2 (MEN2) and familial MTC (FMTC). RET (rearrangement during transfection) encodes a membrane receptor tyrosine kinase that, when mutated, can originate MTC. The aim of this project was to evaluate, through in vitro functional experimental approaches, the oncogenic potential of two newly identified RET germinal variants detected in two MTC patients from our institution: RET C515T (RET missense alteration TGCTGG at codon 515 - Cys515Trp) and RET T636M (RET missense alteration ACGATG at codon 636 - Thr636Met. By expressing the novel RET variants in non-transformed NIH 3T3 mouse fibroblasts, and comparing their effect with wild-type RET, we were able to observe an increase of cell growth and proliferation, loss of contact inhibition and an increase in cell migration rate. All these are common characteristics of tumoral cells, indicating that these new RET variants hold some relevant transforming potential. This transforming potential is, nevertheless, low when compared to that of RET MEN2A- causing mutation, C634R, which is consistent with the mild phenotype, observed in the patients of this study, characterized by late onset and low aggressiveness. The functional characterization of these two new variants not only contributes to the understanding of the molecular mechanisms behind the development of MTC in these families, but also provides useful information to optimize the diagnostic and clinical management of hereditary MTC.Após um quarto de século de grandes avanços, a investigação na área da oncologia tornou-se rica e complexa, mostrando assim que o cancro é uma doença que envolve mudanças dinâmicas no genoma. Muitas evidências indicam que a tumorigénese em humanos é um processo com várias etapas, que reflete não só as alterações no genoma, mas também que levam a uma transformação progressiva de células normais em células derivadas altamente malignas. Carcinoma é qualquer tumor maligno que provenha de células epiteliais, e que pode originar metástases. Existem inúmeros tipos de carcinoma, sendo os carcinomas endócrinos um deles, abrangendo uma enorme variedade, tanto a nível do fenótipo como do genótipo. Os carcinomas da tiróide são o tipo de carcinomas endócrinos mais frequentes, e podem ser divididos em dois grandes grupos: os carcinomas da tiróide que provêm de células foliculares e os carcinomas da tiróide que provêm de células parafoliculares. Os carcinomas medulares da tiróide (CMT) representam cerca de 5 a 8% dos carcinomas da tiróide. Estes desenvolvem-se a partir de células C (células parafoliculares), enquanto os outros tipos de tumores desenvolvem-se a partir das células foliculares. Os carcinomas medulares podem ocorrer de forma esporádica (cerca de 75% do total dos casos) ou hereditária (cerca de 25%), sendo esta última associada a síndrome de neoplasia endócrina múltipla de tipo 2 (NEM2), subdividida em NEM2A e NEM2B, e CMT familiar (CMTF). Os carcinomas medulares da tiróide possuem uma enorme variedade, que podem ir de tumores com bom prognóstico, a carcinomas altamentes agressivos, com uma elevada taxa de mortalidade. Mutações no proto oncogene RET (Rearranjado durante a transfeção) estão na origem do desenvolvimento do carcinoma medular da tiróide. Este proto oncogene codifica para um recetor membranar com atividade de tirosina-cinase e está envolvido em várias vias de sinalização que controlam processos como a sobrevivência e proliferação celular, migração e angiogénese, entre outros. Os casos de CMTF estão geralmente associados a mutações pontuais a nível germinal no gene RET que podem ser mutações que afetam a região extracelular ou o domínio de tirosina-cinase deste recetor. Nos casos onde não existe qualquer mutação na proteína RET, as cisteínas extracelulares formam ligações de bissulfito intramoleculares, estabilizando o recetor na sua conformação monomérica. O domínio das cisteínas é altamente conservado e tem um papel importante na manutenção da estrutura secundária e terciária do domínio extracelular do RET, através destas ligações de bissulfito. Quando ocorre uma mutação que leva à perda de um resíduo de cisteína esta torna-se livre para formar uma ligação intermolecular com outro receptor mutado, ocorrendo assim a dimerização e fosforilação da proteína RET, tornando-a ativa, mesmo na ausência de ligandos. Assim, mutações ativadoras neste gene conduzem a uma ativação não-regulada destas vias, levando assim ao surgimento do fenótipo tumoral. Este trabalho tem como objectivo a realização de estudos funcionais in vitro para duas variantes germinais do proto-oncogene RET, não descritas na literatura, associadas a dois casos distintos de carcinoma medular da tiróide (referidos como paciente A e paciente B), tentando assim avaliar seu o grau de patogenicidade. A paciente A, sem evidência clínica na família de síndrome NEM2A/2B ou CMTF, foi submetida, aos 79 anos, a tiroidectomia total devido a um CMT unifocal. O teste genético ao gene RET identificou uma variante heterozigótica no codão 636 (ACGATG) no exão 11, que resulta na substituição do aminoácido treonina por metionina na região extracelular da proteína RET, designada por RET T636M. Apenas um membro da família desta paciente foi testado, a filha de 50 anos que apresentava bócio multinodular, tendo-se verificado ser negativa para esta variante. A paciente B tinha 60 anos à data do diagnóstico, tendo sido submetida a tiroidectomia total devido a CMT multifocal. O teste genético ao gene RET revelou uma variante germinal presente em homozigotia no exão 8, codão 515 (TGCTGG), que leva à substituição de uma cisteína por um triptofano no domínio extracelular da proteína RET, designada por RET C515T. O facto dos pais desta paciente serem primos em primeiro grau levou provavelmente a esta variante se apresentar em homozigotia. Esta variante foi também encontrada, apesar de em heterozigotia, em oito de dez familiares estudados. Nenhum destes apresentou qualquer sintoma sugestivo de CMT ou NEM2, exceto uma prima que também veio a desenvolver CMT aos 63 anos. O potencial oncogénico de uma variante pode ser estimado através de diversos ensaios funcionais in vitro, avaliando-se assim sua capacidade de transformação induzida pela mutação comparativamente com o controlo normal, sem mutação. Para estes estudos tem-se em conta as características específicas das células tumorais, que as distinguem das células normais, não transformadas. Para tal, utiliza-se normalmente a linha celular de fibroblastos de ratinho NIH 3T3, comercialmente disponível, sendo analisado o efeito da expressão exógena do péptido mutante nestas células. Antes de se dar inicio aos ensaios funcionais, efetuou-se a análise funcional in silico para prever o efeito patogénico de cada variante. Os ensaios funcionais incluíram o ensaio de formação de focos, migração, crescimento e ciclo celular. A expressão exógena do gene RET nas células transfetadas foi monitorizada e quantificada pela técnica de western-blott. O resultado destes estudos funcionais revelou que as novas variantes do gene RET, RET C515T e RET T636M, em comparação com o efeito induzido pelo RET selvagem, levavam um aumento do crescimento e proliferação celular, à perda de inibição por contacto e um aumento da migração celular. Todas estas características são comuns às células tumorais, levantando-se assim a hipótese de que estas novas variantes podem possuir um potencial oncogénico relevante. O potencial transformante destas novas variantes foi, no entanto, inferior ao observado para a mutação RET C634R, causadora do fenótipo NEM2A e utilizada como controlo positivo neste estudo. Com base nos estudos funcionais in vitro, estas novas variantes apresentam um baixo potencial oncogénico, resultados estes consistentes com o fenótipo pouco agressivo observado em ambas as pacientes deste estudo. Apesar da variante RET T636M não envolver diretamente um resíduo de cisteína, poderá induzir a uma alteração conformacional na proteína que poderá afetar uma ligação intramolecular localizada na vizinhança deste codão. Isto poderá ter um impacto na estrutura da proteína RET, bem como na sua ativação. Curiosamente, esta variante está localizada na vizinhança de certos codões que, quando mutados, estão associados a fenótipos mais agressivos. Por outro lado, a variante RET C515W envolve diretamente um resíduo de cisteína, podendo a sua perda ter consequências diretas na ativação do recetor RET. Indivíduos com mutações pouco patogénicas no gene RET podem necessitar de uma segunda mutação germinal ou somática para desenvolver um fenótipo mais agressivo, que leve à expressão clínica da doença. Esta hipótese foi levantada para a paciente B que possuía a variante em homozigotia, mas foi descartada quando se descobriu que uma prima, que possuía a mesma variante embora em heterozigotia, veio igualmente a desenvolver CMT, sugerindo que apenas um alelo mutado é suficiente para a manifestação da doença. Fatores externos como o estilo de vida de cada indivíduo ou do próprio ambiente em que este se encontra inserido, adicionado ao desenvolvimento tardio da doença, bem como à sua baixa penetrância, são fatores que provavelmente contribuem para as variações na expressão clínica da doença, sendo assim difícil de perceber o efeito da mutação só por si. Apesar de serem necessários estudos funcionais adicionais, a caracterização destas duas novas variantes contribui, não só, para o conhecimento dos mecanismos moleculares inerentes ao desenvolvimento de CMT nestas famílias, como também para a optimização do diagnóstico e o aconselhamento clinico de CMT hereditário

The importance of the RET gene in thyroid cancer and therapeutic implications

Since the discovery of the RET receptor tyrosine kinase in 1985, alterations of this protein have been found in diverse thyroid cancer subtypes. RET gene rearrangements are observed in papillary thyroid carcinoma, which result in RET fusion products. By contrast, single amino acid substitutions and small insertions and/or deletions are typical of hereditary and sporadic medullary thyroid carcinoma. RET rearrangements and mutations of extracellular cysteines facilitate dimerization and kinase activation, whereas mutations in the RET kinase coding domain drive dimerization-independent kinase activation. Thus, RET kinase inhibition is an attractive therapeutic target in patients with RET alterations. This approach was initially achieved using multikinase inhibitors, which affect multiple deregulated pathways that include RET kinase. In clinical practice, use of multikinase inhibitors in patients with advanced thyroid cancer resulted in therapeutic efficacy, which was associated with frequent and sometimes severe adverse effects. However, remarkable progress has been achieved with the identification of novel potent and selective RET kinase inhibitors for the treatment of advanced thyroid cancer. Although expanded clinical validation in future trials is needed, the sustained antitumoural activity and the improved safety profile of these novel compounds is opening a new exciting era in precision oncology for RET-driven cancers