Simple method for sub-diffraction resolution imaging of cellular structures on standard confocal microscopes by three-photon absorption of quantum dots

This study describes a simple technique that improves a recently developed 3D sub-diffraction imaging method based on three-photon absorption of commercially available quantum dots. The method combines imaging of biological samples via tri-exciton generation in quantum dots with deconvolution and spectral multiplexing, resulting in a novel approach for multi-color imaging of even thick biological samples at a 1.4 to 1.9-fold better spatial resolution. This approach is realized on a conventional confocal microscope equipped with standard continuous-wave lasers. We demonstrate the potential of multi-color tri-exciton imaging of quantum dots combined with deconvolution on viral vesicles in lentivirally transduced cells as well as intermediate filaments in three-dimensional clusters of mouse-derived neural stem cells (neurospheres) and dense microtubuli arrays in myotubes formed by stacks of differentiated C2C12 myoblasts

3D Architectural Analysis of Neurons, Astrocytes, Vasculature & Nuclei in the Motor and Somatosensory Murine Cortical Columns

Characterization of the complex cortical structure of the brain at a cellular level is a fundamental goal of neuroscience which can provide a better understanding of both normal function as well as disease state progression. Many challenges exist however when carrying out this form of analysis. Immunofluorescent staining is a key technique for revealing 3-dimensional structure, but subsequent fluorescence microscopy is limited by the quantity of simultaneous targets that can be labeled and intrinsic lateral and isotropic axial point-spread function (PSF) blurring during the imaging process in a spectral and depth-dependent manner. Even after successful staining, imaging and optical deconvolution, the sheer density of filamentous processes in the neuropil significantly complicates analysis due to the difficulty of separating individual cells in a highly interconnected network of tightly woven cellular arbors. In order to solve these problems, a variety of methodologies were developed and validated for improved analysis of cortical anatomy. An enhanced immunofluorescent staining and imaging protocol was utilized to precisely locate specific functional regions within brain slices at high magnification and collect four-channel, complete cortical columns. A powerful deconvolution routine was established which collected depth variant PSFs using an optical phantom for image restoration. Fractional volume analysis (FVA) was used to provide preliminary data of the proportions of each stained component in order to statistically characterize the variability within and between the functional regions in a depth-dependent and depth-independent manner. Finally, using machine learning techniques, a supervised learning model was developed that could automatically classify neuronal and astrocytic nuclei within the large cortical column datasets based on perinuclear fluorescence. These annotated nuclei were then used as seed points within their corresponding fluorescent channel for cell individualization in a highly interconnected network. For astrocytes, this technique provides the first method for characterization of complex morphology in an automated fashion over large areas without laborious dye filling or manual tracing

Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei

The article reviews the existing methods of multicolor FISH on nuclear targets, first of all, interphase chromosomes. FISH proper and image acquisition are considered as two related components of a single process. We discuss (1) M-FISH (combinatorial labeling + deconvolution + widefield microscopy); (2) multicolor labeling + SIM (structured illumination microscopy); (3) the standard approach to multicolor FISH + CLSM (confocal laser scanning microscopy; one fluorochrome - one color channel); (4) combinatorial labeling + CLSM; (5) non-combinatorial labeling + CLSM + linear unmixing. Two related issues, deconvolution of images acquired with CLSM and correction of data for chromatic Z-shift, are also discussed. All methods are illustrated with practical examples. Finally, several rules of thumb helping to choose an optimal labeling + microscopy combination for the planned experiment are suggested. Copyright (c) 2006 S. Karger AG, Basel

Superresolution fluorescence microscopy with structured illumination

The resolution of a conventional fluorescence microscope image is diffraction limited which achieves a spatial resolution of 200nm lateral and 500nm axial. Recently, many superresolution fluorescence microscopy techniques have been developed which allow the observation of many biological structures beyond the diffraction limit. Structured illumination microscopy (SIM) is one of them. The principle of SIM is based on using a harmonic light grid which down modulates the high spatial frequencies of the sample into the observable region of the microscope. The resolution enhancement is highly dependent on the reconstruction technique, which restores the high spatial frequencies of the sample to their original position. Common SIM reconstructions require the perfect knowledge of the illumination pattern. However, to perfectly control the harmonic illumination patterns on the sample plane is not easy in experimental implementations and this makes the experimental setup very technical. Reconstructing SIM images assuming the perfect knowledge of the illumination intensity patterns may, therefore, introduce artifacts on the estimated sample due to the misalignment of the grid that can occur during experimental acquisitions. To tackle this drawback of SIM, in this these, we have developed blind-SIM reconstruction strategies which are independent of the illumination patterns. Using the 3D blind-SIM reconstruction strategies we extended the harmonic SIM to speckle illumination microscopy which uses random unknown speckle patterns that need no control, unlike the harmonic grid patterns. For harmonic-SIM images, since incorporating some information about illumination patterns is valuable, we have developed a 3D positive filtered blind-SIM reconstruction which confines the iterative estimation of the illuminations in the vicinity of the Fourier peaks (using carefully designed Fourier filter masks) in the Fourier space. Using blind-SIM reconstruction techniques a lateral resolution of about 100nm and axial resolution of about 200nm is obtained in both speckle and harmonic SIM. In addition, to reduce the out-of-focus problem in widefield images, a simple computational technique which is based on reconstructing 2D data with 3D PSF is developed based on blind-SIM reconstruction. Moreover, to combine the functionalities of SIM and light sheet microscopy, as a proof of concept, we have developed a simple microscope setup which produces a structured light sheet illumination pattern.La microscopie de fluorescence optique est l’un des outils les plus puissants pour étudier les structures cellulaires et moléculaires au niveau subcellulaire. La résolution d’une image de microscope conventionnel à fluorescence est limitée par la diffraction, ce qui permet d’obtenir une résolution spatiale latérale de 200nm et axiale de 500nm. Récemment, de nombreuses techniques de microscopie de fluorescence de super-résolution ont été développées pour permettre d’observer de nombreuses structures biologiques au-delà de la limite de diffraction. La microscopie d’illumination structurée (SIM) est l’une de ces technologies. Le principe de la SIM est basé sur l’utilisation d’une grille de lumière harmonique qui permet de translater les hautes fréquences spatiales de l’échantillon vers la région d’observation du microscope. L’amélioration de la résolution de cette technologie de microscopie dépend fortement de la technique de reconstruction, qui rétablit les hautes fréquences spatiales de l’échantillon dans leur position d’origine. Les méthodes classiques de reconstruction SIM nécessitent une connaissance parfaite de l’illumination de l’échantillon. Cependant, l’implémentation d’un contrôle parfait de l’illumination harmonique sur le plan de l’échantillon n’est pas facile expérimentalement et il présente un grand défi. L’hypothèse de la connaissance parfaite de l’intensité de la lumière illuminant l’échantillon en SIM peut donc introduire des artefacts sur l’image reconstruite de l’échantillon, à cause des erreurs d’alignement de la grille qui peuvent se présenter lors de l’acquisition expérimentale. Afin de surmonter ce défi, nous avons développé dans cette thèse des stratégies de reconstruction «aveugle» qui sont indépendantes de d’illumination. À l’aide de ces stratégies de reconstruction dites «blind-SIM», nous avons étendu la SIM harmonique pour l’appliquer aux cas de «SIM-speckle» qui utilisent des illuminations aléatoires et inconnues qui contrairement à l’illumination harmonique, ne nécessitent pas de controle. Comme il est utile de récupérer des informations sur l’illumination en SIM harmonique, nous avons développé une reconstruction blind-SIM tridimensionnel et filtrée qui confine l’estimation itérative des illuminations au voisinage des pics dans l’espace de Fourier, en utilisant des masques de filtre de Fourier soigneusement conçus. En utilisant des techniques de reconstruction blind-SIM, une résolution latérale d’environ 100 nm et une résolution axiale d’environ 200 nm sont obtenues, à la fois en SIM harmonique et en SIM speckle. En outre, pour réduire le problème de focalisation dans les images de champ large, une technique de calcul simple qui repose sur la reconstruction bidimensionnel de données à partir de PSF tridimensionnel est développée. En outre, afin de combiner à la fois les fonctionnalités de la SIM et de la microscopie á nappe de lumière, en tant que preuve de concept, nous avons développé une configuration de microscope simple qui produit une nappe de lumière structuré

Superresolution fluorescence microscopy with structured illumination

Cotutela Universitat Politècnica de Catalunya i Aix-Marseille UniversitéThe resolution of a conventional fluorescence microscope image is diffraction limited which achieves a spatial resolution of 200nm lateral and 500nm axial. Recently, many superresolution fluorescence microscopy techniques have been developed which allow the observation of many biological structures beyond the diffraction limit. Structured illumination microscopy (SIM) is one of them. The principle of SIM is based on using a harmonic light grid which down modulates the high spatial frequencies of the sample into the observable region of the microscope. The resolution enhancement is highly dependent on the reconstruction technique, which restores the high spatial frequencies of the sample to their original position. Common SIM reconstructions require the perfect knowledge of the illumination pattern. However, to perfectly control the harmonic illumination patterns on the sample plane is not easy in experimental implementations and this makes the experimental setup very technical. Reconstructing SIM images assuming the perfect knowledge of the illumination intensity patterns may, therefore, introduce artifacts on the estimated sample due to the misalignment of the grid that can occur during experimental acquisitions. To tackle this drawback of SIM, in this these, we have developed blind-SIM reconstruction strategies which are independent of the illumination patterns. Using the 3D blind-SIM reconstruction strategies we extended the harmonic SIM to speckle illumination microscopy which uses random unknown speckle patterns that need no control, unlike the harmonic grid patterns. For harmonic-SIM images, since incorporating some information about illumination patterns is valuable, we have developed a 3D positive filtered blind-SIM reconstruction which confines the iterative estimation of the illuminations in the vicinity of the Fourier peaks (using carefully designed Fourier filter masks) in the Fourier space. Using blind-SIM reconstruction techniques a lateral resolution of about 100nm and axial resolution of about 200nm is obtained in both speckle and harmonic SIM. In addition, to reduce the out-of-focus problem in widefield images, a simple computational technique which is based on reconstructing 2D data with 3D PSF is developed based on blind-SIM reconstruction. Moreover, to combine the functionalities of SIM and light sheet microscopy, as a proof of concept, we have developed a simple microscope setup which produces a structured light sheet illumination pattern.La microscopie de fluorescence optique est l’un des outils les plus puissants pour étudier les structures cellulaires et moléculaires au niveau subcellulaire. La résolution d’une image de microscope conventionnel à fluorescence est limitée par la diffraction, ce qui permet d’obtenir une résolution spatiale latérale de 200nm et axiale de 500nm. Récemment, de nombreuses techniques de microscopie de fluorescence de super-résolution ont été développées pour permettre d’observer de nombreuses structures biologiques au-delà de la limite de diffraction. La microscopie d’illumination structurée (SIM) est l’une de ces technologies. Le principe de la SIM est basé sur l’utilisation d’une grille de lumière harmonique qui permet de translater les hautes fréquences spatiales de l’échantillon vers la région d’observation du microscope. L’amélioration de la résolution de cette technologie de microscopie dépend fortement de la technique de reconstruction, qui rétablit les hautes fréquences spatiales de l’échantillon dans leur position d’origine. Les méthodes classiques de reconstruction SIM nécessitent une connaissance parfaite de l’illumination de l’échantillon. Cependant, l’implémentation d’un contrôle parfait de l’illumination harmonique sur le plan de l’échantillon n’est pas facile expérimentalement et il présente un grand défi. L’hypothèse de la connaissance parfaite de l’intensité de la lumière illuminant l’échantillon en SIM peut donc introduire des artefacts sur l’image reconstruite de l’échantillon, à cause des erreurs d’alignement de la grille qui peuvent se présenter lors de l’acquisition expérimentale. Afin de surmonter ce défi, nous avons développé dans cette thèse des stratégies de reconstruction «aveugle» qui sont indépendantes de d’illumination. À l’aide de ces stratégies de reconstruction dites «blind-SIM», nous avons étendu la SIM harmonique pour l’appliquer aux cas de «SIM-speckle» qui utilisent des illuminations aléatoires et inconnues qui contrairement à l’illumination harmonique, ne nécessitent pas de controle. Comme il est utile de récupérer des informations sur l’illumination en SIM harmonique, nous avons développé une reconstruction blind-SIM tridimensionnel et filtrée qui confine l’estimation itérative des illuminations au voisinage des pics dans l’espace de Fourier, en utilisant des masques de filtre de Fourier soigneusement conçus. En utilisant des techniques de reconstruction blind-SIM, une résolution latérale d’environ 100 nm et une résolution axiale d’environ 200 nm sont obtenues, à la fois en SIM harmonique et en SIM speckle. En outre, pour réduire le problème de focalisation dans les images de champ large, une technique de calcul simple qui repose sur la reconstruction bidimensionnel de données à partir de PSF tridimensionnel est développée. En outre, afin de combiner à la fois les fonctionnalités de la SIM et de la microscopie á nappe de lumière, en tant que preuve de concept, nous avons développé une configuration de microscope simple qui produit une nappe de lumière structuréePostprint (published version