IMPLANTABLE NEURAL DEVICES FOR REGENERATIVE NEURAL AXON REGENERATION AND INJURY MONITORING OF SPINAL CORD

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 전기·컴퓨터공학부, 2013. 2. 전국진.중추신경계(CNS)에 속하는 척수 신경이 손상을 받으면 감각 및 운동 기능의 영구적 손실이 발생하기 때문에, 척수의 기능 회복을 위한 많은 연구가 수행되었다. 생체적합성 스캐폴드 및 재생을 돕는 약물을 이용한 다양한 연구가 수행되었고, 동물 모델을 통해서 상당히 긍정적인 재생효과를 확인하였지만, 아직까지는 그 효과에 한계가 있다. 그 대안으로써 인공 보철 장치의 신경 인터페이스 소자의 개념이 제안되어 연구되어 왔으나, 여전히 손상된 척수로부터의 신경 신호 획득은 어려운 문제이다. 본 연구에서는, 재생적인 방법을 이용하여 손상된 척수 신경으로부터 신경 신호를 직접적으로 획득할 수 있는 이식형 신경 소자를 제안하였다. 신호 획득 시에 염증 반응에 의해 발생할 수 있는 부정적인 효과를 억제하기 위해, 근래에 들어 점차 항염증 효과가 밝혀지고 있는 그렐린(ghrelin)을 수화젤 스캐폴드를 통해 신경소자에 적용하였다. 10nM 농도의 아가로즈(agarose) 스캐폴드를 전임상 이식 실험을 통해 이식하여 재생 효과를 확인해 본 결과 렛(rat)의 운동 기능에 통계학적으로 의미 있는 회복을 확인할 수 있었다. 추가로, 척수의 손상 수준을 모니터링할 수 있는 이식형 신경 센서를 제안하였다. 제안한 센서는 신경 교상흔의 주요 물질로써 신경의 재생을 억제하는 것으로 보고된 CSPG (chondroitin sulfate proteoglycan)의 양을 측정할 수 있다. 제안한 센서의 가능성을 확인하기 위하여 1~20μg/ml 농도 범위의 CSPG의 양을 센서로 측정해 보았다. 그 결과 신경의 성장을 억제하는 수준인 10μg/ml 농도의 CSPG를 충분히 측정할 수 있음을 확인할 수 있었다. 여섯 개의 시브형 신경 전극을 가진 폴리이미드에 기반한 연성 신경 소자를 MEMS 공정을 통해서 제작하였다. 제작한 소자의 전기화학적 임피던스를 삼전극법을 이용하여 측정하였으며, 1kHz에서 17.9kΩ의 낮은 임피던스 값을 얻어 신경 신호의 측정에 문제가 없음을 확인하였다. 소자의 모든 전극은 살아 움직이는 쥐의 몸에 단단히 고정할 수 있도록 특별히 고안된 인터페이스 보드에 연결되어, 연성 기판 커넥터를 통해 외부로 연결되도록 하였다. 소자가 이식된 쥐는 통상적인 후관리를 받았으며 1개월 이상 생존하였다. 신경 신호 측정을 위한 전임상 실험을 수행하였다. 렛을 마취한 후 이식한 신경 소자의 인터페이스보드에 신호 측정 장비의 커넥터를 연결하였다. 부드러운 솔을 이용하여 쥐의 하부 다리를 자극함으로써 강제작인 신경 신호를 형성하였고, 이 방법을 통해 200~400μV 크기의 신경 신호를 획득할 수 있었다. 주파수 영역의 분석에 따르면, 피크 주파수의 범위는 500Hz에서 1kHz의 범위에서 나타났으며, 자극에 의한 신경 신호임을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 제안한 신경 소자는 추후 척수 손상 장애인을 위한 인공 보철의 신경 인터페이스로 활용 가능할 것으로 기대 된다.요약문 목차 그림 목차 표 목차 1. 서론 1.1. 연구 배경 1.2. 조직 공학 및 신경 전극 연구의 동향 1.2.1. 조직 공학 연구 동향 1.2.2. 신경 전극 연구의 동향 1.3. 연구의 목적 1.4. 연구의 수월성 1.5. 논문의 구성 2. 척수 신경 재생용 스캐폴드 2.1. 스캐폴드의 디자인 2.1.1. 스캐폴드 재질의 선택 2.1.2. 신경 재생 약물의 선택 2.1.3. 스캐폴드의 구조 설계 및 제작 2.2. 전임상 이식 수술 2.3. 기능 회복 테스트 2.4. 기능 회복의 의미 2.5. 조직학적 검증 2.5.1. 조직 처리 과정 2.5.2. 조직 염색 결과 2.6. 스캐폴드 전임상 이식 실험의 결론 3. 척수 손상 평가용 이식형 신경 소자 3.1. 척수 손상 평가 센서의 개념 및 원리 3.1.1. Chondroitin Sulfate Proteoglycan (CSPG) 3.1.2. CSPG 센서의 개념 3.1.3. CSPG 센서의 원리 3.2. 나노와이어 특성 평가 3.2.1. 나노 와이어의 종류 3.2.2. 나노와이어 그물망의 제작 3.2.3. 나노와이어 임피던스 특성 평가 3.2.4. 나노와이어 독성 평가 3.2.5. 나노와이어 세포 형상 평가 3.2.6. 나노와이어 특성 실험 결론 3.3. CSPG 센서의 제작 3.3.1. CSPG 센서의 연성 기판 선택 및 공정 조건 3.3.2. Polyimide의 금속 배선을 위한 접착력 향상 3.3.3. Polyimide 식각 조건 3.3.4. CSPG 센서의 제작 공정 3.4. CSPG 센서 측정 4. 척수신경 신호 측정용 이식형 신경 소자 4.1. 신호 측정용 신경 소자의 설계 4.1.1. 신호 측정용 신경 소자의 개념 및 신호 측정 원리 4.1.2. 시브형태 신경 전극의 설계 4.1.3. 시브형태 신경 전극의 공정 설계 4.2. 스캐폴드와 시브형태 신경 전극의 일체화 4.3. 신경 소자 이식 수술 4.3.1. 신경 소자의 척수 고정법 4.3.2. 신경 소자 인터페이스 보드 고정법 4.4. 신경소자의 신경 신호 측정 4.4.1. 신경소자의 임피던스 측정 4.4.2. 신경 신호의 측정 방법 4.5. 신경 신호 측정 결과 분석 4.5.1. 측정된 신경 신호 4.5.2. 신경 신호의 주파수 분석 5. 결론 5.1. 결론 5.2. 추후 과제 ABSTRACTDocto

The degradation of glial scar and enhancement of chronic intracortical recording electrode performance through the local delivery of dexamethasone and chondroitinase

The ability of conducting polymers such as poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) to store a drug as a dopant and release it following electrical stimulus make them an intriguing coating possibility for intracortical electrodes, along with their ability to reduce electrode impedance. The mechanism allows for the release of an assortment of useful agents, including anti-inflammatory drugs and neuromodulatory chemicals. We evaluated the release capabilities of a multi-walled carbon nanotube (MWCNT)-doped PEDOT coating incorporating the anti-inflammatory steroid dexamethasone in vitro using sputtered-gold macroelectrodes, and then applied the coating to half of the electrodes within 16-shank platinum/iridium floating microelectrode arrays for chronic in vivo evaluation in rat visual cortex. Impedance measurement, neurophysiological recording, and cyclic voltammetric release stimulus (-0.9 V to 0.6 V, 1 V/s, 20 cycles) was performed daily to all channels. On the 11th day, histology was performed to quantitatively characterize inflammatory tissue response using OX42 (microglia) and GFAP (astroglia). Equivalent circuit analysis was performed to assist the interpretation of impedance data. Our results indicated that the MWCNT/PEDOT-coated gold macroelectrodes released double the amount of dexamethasone using passive release followed by CV stimulation (10 sets of 20 cycles) compared to passive release alone. Coatings applied to Pt/Ir microelectrodes reduced 1 kHz impedance in PBS by approximately 38%. Coated probes in vivo exhibited a significant decrease in 1 kHz impedance for the initial three days of implantation followed by an increase, between days 4 and 7, to values equivalent to those exhibited by uncoated probes. Neurophysiological recording performance of coated and uncoated probes remained equivalent for the duration of the experiment, in terms of signal-to-noise ratio and noise amplitude. Histology revealed no significant difference in tissue inflammatory response to coated and uncoated electrodes. Explant imaging revealed the presence of a membranous film enveloping coated electrodes, and equivalent circuit analysis suggested that the day 4-7 increase in 1 kHz impedance of coated electrodes was due to a decrease in effective surface area of the coatings as well as the core electrodes. Additional work was also performed developing a model for the in vivo microinjection of the enzyme Chondroitinase ABC into tissue surrounding implanted microelectrodes

Structures based on semi-degradable biomaterials for neural regeneration in the central nervous system

Se pretende obtener un material semibiodegradable basado en ácido hialurónico químicamente enlazado a cadenas de polímeros acrílicos. Los hidrogeles de ácido hialurónico presentan en general buenas características para su utilización en regeneración del sistema nervioso central: es biodegradable, es un componente importante del tejido neural, sus propiedades mecánicas son semejantes a las del tejido cerebral, promueve la formación de nuevos capilares (angiogénesis), y limita la inflamación. Con este nuevo material se pretende mejorar el excesivo grado de hinchado en medio fisiológico, su rápida degradación, mejorar la adhesión celular, además la matriz permanente de las cadenas acrílicas pueden actuar como un soporte permanente durante el proceso regenerativo sin que se produzca una pérdida brusca de propiedades mecánicas y estructurales. El trabajo consiste en caracterizar este nuevo material así como los productos intermedios necesarios para su obtención final, comparándolo con las propiedades de un hidrogel de ácido hialurónico sin incorporar cadenas acrílicas. Los estudios celulares se llevaran a cabo in vitro, como fase preliminar para futuros implantes en el cortex cerebral, estudiando la capacidad de diferenciación de precursores neurales y de generación de nuevos capilares con el fenotipo típico de la barrera hematoencefálica, mediante el estudio de cocultivos de precursores neurales y células endoteliales.Perez Garnes, M. (2015). Structures based on semi-degradable biomaterials for neural regeneration in the central nervous system [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4879

Developing a new generation of neuro-prosthetic interfaces: structure-function correlates of viable retina-CNT biohybrids

PhD ThesisOne of the many challenges in the development of neural prosthetic devices is the choice of electrode material. Electrodes must be biocompatible, and at the same time, they must be able to sustain repetitive current injections in a highly corrosive physiological environment. We investigated the suitability of carbon nanotube (CNT) electrodes for retinal prosthetics by studying prolonged exposure to retinal tissue and repetitive electrical stimulation of retinal ganglion cells (RGCs). Experiments were performed on retinal wholemounts isolated from the Cone rod homeobox (CRX) knockout mouse, a model of Leber congenital amaurosis. Retinas were interfaced at the vitreo-retinal juncture with CNT assemblies and maintained in physiological conditions for up to three days to investigate any anatomical (immunohistochemistry and electron microscopy) and electrophysiological changes (multielectrode array stimulation and recordings; electrodes were made of CNTs or commercial titanium nitride). Anatomical characterisation of the inner retina, including RGCs, astrocytes and Müller cells as well as cellular matrix and inner retinal vasculature, provide strong evidence of a gradual remodelling of the retina to incorporate CNT assemblies, with very little indication of an immune response. Prolonged electrophysiological recordings, performed over the course of three days, demonstrate a gradual increase in signal amplitudes, lowering of stimulation thresholds and an increase in cellular recruitment for RGCs interfaced with CNT electrodes, but not with titanium nitride electrodes. These results provide for the first time electrophysiological, ultrastructural and cellular evidence of the time-dependent formation of strong and viable bio-hybrids between the RGC layer and CNT arrays in intact retinas. We conclude that CNTs are a promising material for inclusion in retinal prosthetic devices

Towards new generation of neuro-implantable devices : engineering neuron/carbon nanotubes integrated functional units

2008/2009Le nanotecnologie sono un campo delle scienze che utilizza materiali e dispositivi ingegnerizzati aventi la più piccola organizzazione funzionale a livello di dimensioni nanometriche. Questo implica che nanodispositivi e nanomateriali possano interagire con i sistemi biologici a livello molecolare con un elevato grado di specificità. É largamente accettato che l’applicazione delle nanotecnologie nell’ambito delle neuroscienze abbia un forte potenziale (Silva, 2006). In questo contesto, i nanotubi di carbonio (CNT), un’innovativa forma di carbonio composta da strutture tubulari di grafite dalle dimensioni nanometriche dotate di buone proprietà di conduzione elettrica, si sono dimostrati promettenti candidati per sviluppare la tecnologia di dispositivi impiantabili in ambito biomedico. Diversi studi hanno dimostrato la biocompatibilità dei substrati di CNT per i neuroni in termini di adesione, crescita e differenziamento cellulare (riassunti in Sucapane et al., 2009). Al fine di aumentare la nostra conoscenza riguardo alle interazioni presenti in sistemi ibridi formati da CNT e neuroni, abbiamo caratterizzato l’attività di reti neuronali cresciuti su supporti di CNT attraverso la tecnica del patch clamp. Il nostro gruppo ha riportato che circuti neuronali cresciuti in vitro su substrati di CNT presentano un’aumentata attività sinaptica spontanea rispetto al controllo a fronte di comparabili proprietà base (proprietà passive di membrana, morfologia e densità dei neuroni) delle colture nelle due condizioni di crescita (Lovat et al., 2005). Si è quindi ipotizzato che tale aumentata attività spontanea potesse originare da una modificazione nel modo in cui i singoli neuroni generano il segnale elettrico. A tal fine, si sono monitorate variazioni nelle proprietà elettrogeniche di singoli neuroni, utilizzando un protocollo standard per caratterizzare l’integrazione di potenziali d’azione retropropaganti nei dendriti (Larkum et al., 1999). In configurazione current clamp, attraverso brevi iniezioni di corrente nel soma della cellula, abbiamo indotto una serie di regolari potenziali d’azione (PA) a varie frequenze nel neurone sotto registrazione, quindi abbiamo studiato la presenza di un’addizionale depolarizzazione somatica dopo l’ultimo PA del treno. Abbiamo osservato che neuroni di controllo mostrano nella maggioranza dei casi una iperpolarizzazione (AHP) del potenziale di membrana dopo l’ultimo PA del treno, mentre una depolarizzazione (ADP) è presente solo in una piccola quota di casi. In presenza di CNT, invece, l’ADP risulta essere l’evento predominante. L’ADP è inoltre abolita dall’applicazione di CoCl2, un bloccante non specifico dei canali calcio voltaggio dipendenti. Per di più, l’area dell’ADP può essere diminuita dall’applicazione di nifedipina (10 μM) e l’ulteriore coapplicazione di NiCl2 (50 μM) elimina totalmente l’ADP, suggerendo che sia i canali calcio voltaggio dipendenti ad alta soglia di attivazione, sia quelli a bassa soglia, siano coinvolti in questo processo (Cellot et al., 2009). Attraverso la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e, più recentemente, mediante quella a scansione (SEM) è stata messa in evidenza la presenza di discontinui punti di stretto contatto tra CNT e membrane neuronali: la nostra ipotesi è che tali strutture ibride siano in grado di favorire la retropropagazione dei PA nei dendriti distali. La maggiore eccitabilità a livello del singolo neurone, inoltre, potrebbe essere responsabile dell’incremento di attività spontanea della rete neuronale. Abbiamo quindi ulteriormente caratterizzato l’attività della rete neuronale attraverso registrazioni da coppie di neuroni, dove il neurone presinaptico veniva stimolato ad avere treni di potenziali d’azione a 20 Hz in configurazione current clamp e simultaneamente il neurone postsinaptico era monitorato in configurazione voltage clamp per vedere la presenza o l’assenza di una risposta sinaptica. I nostri esperimenti indicano che la probabilità di trovare connessioni monosinaptiche gabaergiche tra neuroni è aumentata in presenza di CNT (56% vs 40% in controllo). Inoltre, è stato rilevato un ulteriore effetto dei CNT sulla plasticità a breve termine delle sinapsi: nelle condizioni di controllo, treni di potenziali d’azione nella cellula presinaptica evocano nella cellula postsinaptica nel 90% dei casi una chiara depressione nell’ampiezza di consecutivi ePSCs, mentre solo in meno del 10% è possibile rilevare una facilitazione. Al contrario, in presenza di CNT, nel 39% delle coppie, il neurone postsinaptico risponde in modo chiaramente facilitativo. Nelle più recenti serie di esperimenti, abbiamo voluto indagare più approfonditamente l’origine di questa modificazione in termini di plasticità sinaptica; a tal fine, abbiamo trattato neuroni in controllo e su CNT con tetrodotossina 1 µM per 5 giorni, al fine di bloccare completamente l’attività elettrica della rete neuronale, e abbiamo compiuto delle registrazioni da coppie di neuroni. Mentre la risposta prevalentemente di depressione dei controlli non è modificata da tale trattamento, neuroni cresciuti su substrati di cnt in condizioni di blocco dell’attività elettrica non presentano più sinapsi con caratteristiche di facilitazione, ma hanno un comportamento simile ai contolli. Questi risultati indicano che la facilitazione è una proprietà tipica di sinapsi attive sviluppatesi in presenza di CNT.XXII Ciclo198

Progenitor cells in auricular cartilage demonstrate promising cartilage regenerative potential in 3D hydrogel culture

The reconstruction of auricular deformities is a very challenging surgical procedure that could benefit from a tissue engineering approach. Nevertheless, a major obstacle is presented by the acquisition of sufficient amounts of autologous cells to create a cartilage construct the size of the human ear. Extensively expanded chondrocytes are unable to retain their phenotype, while bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSC) show endochondral terminal differentiation by formation of a calcified matrix. The identification of tissue-specific progenitor cells in auricular cartilage, which can be expanded to high numbers without loss of cartilage phenotype, has great prospects for cartilage regeneration of larger constructs. This study investigates the largely unexplored potential of auricular progenitor cells for cartilage tissue engineering in 3D hydrogels

Brain-Targeted Drug Delivery

Brain diseases currently affect one in six people worldwide; they include a wide range of neurological diseases, from Alzheimer’s and Parkinson’s diseases to epilepsy, brain injuries, brain cancer, neuroinfections, and strokes. The treatment of these diseases is complex and limited due to the presence of the blood–brain barrier (BBB), which covers the entirety of the brain. The BBB not only has the function of protecting the brain from harmful substances; it is also a metabolic barrier and a transport regulator of nutrients/serum factors/neurotoxins. Knowing these characteristics when it comes to the treatment of brain diseases makes it easier to understand the lack of efficacy of therapeutic drugs, resulting from the innate resistance of the BBB to permeation. To overcome this limitation, drug delivery systems based on nanotechnology/microtechnology have been developed. Brain-targeted drug delivery enables targeted therapy with a higher therapeutic efficacy and fewer side effects because it targets moieties present in the drug delivery systems