1,207 research outputs found

    Tensor product approach to modelling epidemics on networks

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    To improve mathematical models of epidemics it is essential to move beyond the traditional assumption of homogeneous well--mixed population and involve more precise information on the network of contacts and transport links by which a stochastic process of the epidemics spreads. In general, the number of states of the network grows exponentially with its size, and a master equation description suffers from the curse of dimensionality. Almost all methods widely used in practice are versions of the stochastic simulation algorithm (SSA), which is notoriously known for its slow convergence. In this paper we numerically solve the chemical master equation for an SIR model on a general network using recently proposed tensor product algorithms. In numerical experiments we show that tensor product algorithms converge much faster than SSA and deliver more accurate results, which becomes particularly important for uncovering the probabilities of rare events, e.g. for number of infected people to exceed a (high) threshold

    A Dynamical Graph Prior for Relational Inference

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    Relational inference aims to identify interactions between parts of a dynamical system from the observed dynamics. Current state-of-the-art methods fit a graph neural network (GNN) on a learnable graph to the dynamics. They use one-step message-passing GNNs -- intuitively the right choice since non-locality of multi-step or spectral GNNs may confuse direct and indirect interactions. But the \textit{effective} interaction graph depends on the sampling rate and it is rarely localized to direct neighbors, leading to local minima for the one-step model. In this work, we propose a \textit{dynamical graph prior} (DYGR) for relational inference. The reason we call it a prior is that, contrary to established practice, it constructively uses error amplification in high-degree non-local polynomial filters to generate good gradients for graph learning. To deal with non-uniqueness, DYGR simultaneously fits a ``shallow'' one-step model with shared graph topology. Experiments show that DYGR reconstructs graphs far more accurately than earlier methods, with remarkable robustness to under-sampling. Since appropriate sampling rates for unknown dynamical systems are not known a priori, this robustness makes DYGR suitable for real applications in scientific machine learning

    Química dinámica combinatoria : optimización de la química reversible y aplicación en el descubrimiento de fármacos

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    Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Químicas, leída el 26-01-2023Dynamic combinatorial chemistry is defined as “the chemistry under thermodynamic control”. It is based on the combination of building blocks that react with each other through reversible chemical bonds to form the final products, reaching the thermodynamic equilibrium (dynamic combinatorial library, DCL). This chemistry is able to respond to external stimuli such as pH, temperature, or the addition of a biomolecule acting as a template. For instance, adding a template will shift the equilibrium towards the formation of the compounds with higher affinity to the template.Templated-DCLs developed under physiological conditions require an effective design of the dynamic chemical system composed of a biomolecule as a template, reversible chemistry that works effectively under physiological conditions, structurally diverse building blocks compatible with the target, and an analysis method. Protein-directed dynamic combinatorial chemistry (P-D DCC) is currently a powerful and efficient tool for discovering ligands with high affinity to a protein target. In this thesis, adding two different protein targets, NCS1 and glucose oxidase, shifted the DCL equilibrium to forming the best ligands in a pool of compounds...La química dinámica combinatoria se define como la química bajo control termodinámico. Se basa en la combinación de monómeros (en inglés, building blocks), que reaccionan entre sí a través de enlaces químicos reversibles formando compuestos, hasta alcanzar el equilibrio termodinámico (librería dinámica combinatoria, DCL, del inglés dynamic combinatorial library). Esta química reversible, en unas condiciones concretas, tiene la capacidad de responder a estímulos externos como el pH, la temperatura o la adición de una biomolécula que actúe como plantilla. En este último caso, el equilibrio se desplazará hacia la formación de complejos más estables y afines por la plantilla. En condiciones fisiológicas y en presencia de una plantilla, las DCLs requieren de un sistema químico-dinámico eficiente compuesto, además de la biomolécula que actúa como plantilla, de una química reversible adecuada y de unos monómeros estructuralmente distintos compatibles con la biomolécula y del método de análisis. La química dinámica combinatoria dirigida por proteínas (en inglés, protein-directed DCC, P-D DCC) se considera actualmente una herramienta eficaz y potente para encontrar ligandos que poseen una afinidad alta por la proteína que actúa como plantilla. En esta tesis, la adición de dos proteínas diferentes como dianas, NCS1 y glucosa oxidasa, desplaza el equilibrio de la dcl hacia la formación de los ligandos más prometedores del conjunto de compuestos formados en el equilibrio..Fac. de Ciencias QuímicasTRUEunpu

    An optimal approach to the design of experiments for the automatic characterisation of biosystems

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    The Design-Build-Test-Learn cycle is the main approach of synthetic biology to re-design and create new biological parts and systems, targeting the solution for complex and challenging paramount problems. The applications of the novel designs range from biosensing and bioremediation of water pollutants (e.g. heavy metals) to drug discovery and delivery (e.g. cancer treatment) or biofuel production (e.g. butanol and ethanol), amongst others. Standardisation, predictability and automation are crucial elements for synthetic biology to efficiently attain these objectives. Mathematical modelling is a powerful tool that allows us to understand, predict, and control these systems, as shown in many other disciplines such as particle physics, chemical engineering, epidemiology and economics. Yet, the inherent difficulties of using mathematical models substantially slowed their adoption by the synthetic biology community. Researchers might develop different competing model alternatives in absence of in-depth knowledge of a system, consequently being left with the burden of with having to find the best one. Models also come with unknown and difficult to measure parameters that need to be inferred from experimental data. Moreover, the varying informative content of different experiments hampers the solution of these model selection and parameter identification problems, adding to the scarcity and noisiness of laborious-to-obtain data. The difficulty to solve these non-linear optimisation problems limited the widespread use of advantageous mathematical models in synthetic biology, broadening the gap between computational and experimental scientists. In this work, I present the solutions to the problems of parameter identification, model selection and experimental design, validating them with in vivo data. First, I use Bayesian inference to estimate model parameters, relaxing the traditional noise assumptions associated with this problem. I also apply information-theoretic approaches to evaluate the amount of information extracted from experiments (entropy gain). Next, I define methodologies to quantify the informative content of tentative experiments planned for model selection (distance between predictions of competing models) and parameter inference (model prediction uncertainty). Then, I use the two methods to define efficient platforms for optimal experimental design and use a synthetic gene circuit (the genetic toggle switch) to substantiate the results, computationally and experimentally. I also expand strategies to optimally design experiments for parameter identification to update parameter information and input designs during the execution of these (on-line optimal experimental design) using microfluidics. Finally, I developed an open-source and easy-to-use Julia package, BOMBs.jl, automating all the above functionalities to facilitate their dissemination and use amongst the synthetic biology community

    Modelling complexity and redundancy in endocytic actin polymerisation

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    Actin is one of the most ubiquitous proteins of life and can form filaments which play crucial roles in a wide range of processes from cell division to intracellular trafficking. Formation of these filament networks is tightly controlled using a wide array of protein types, chief among them being nucleators. Nucleators facilitate the unfavourable first steps of filament formation and thus their regulation dictates when and where filamentous networks are produced. The central proline-rich region of Las17 (yeast homologue of human WASp) is thought to nucleate actin “mother filaments” at the endocytic sites. Arp2/3 – a potent nucleator activated by Las17 – can branch these mother filaments. Proline also constitutes the core binding region of SH3 domains which leaves the nucleating region of Las17 open to competitive regulation. Eleven Las17-binding SH3 domains are recruited to yeast endocytic sites. Five of these bind via a tandem of domains (three SH3s in Sla1 and two SH3s in Bzz1). We hypothesise that this “cloud” of SH3 domains can regulate the access of actin to the proline-rich region of Las17. However, the high number of proteins and interactions involved renders a purely experimental approach challenging. Throughout this thesis, two agent-based models are built (one being a progression of the other) to test the veracity of our regulatory cloud hypothesis. Binding affinities were experimentally obtained to build the model, demonstrate the power of avidity conferred through tandem SH3 binding, and refine our Las17 nucleating mechanism. We identify that the weak interactions of the SH3 cloud can combine in effect – particularly complemented by the tandem binding of Sla1 and Bzz1 – to define a window of Las17 nucleating activity. This work suggests how endocytic SH3 domains can regulate endocytic progression whilst also furthering our understanding of the relatively unexplored nucleating mechanisms employed by Las1

    Entkopplung von Wachstum und Überproduktion von Chemikalien in Escherichia coli

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    Das Metabolic Engineering ermöglicht es, mikrobielle Stämme zu konstruieren, die Chemikalien effektiv überproduzieren. Allerdings nutzen die Produktionsstämme Substrate nicht nur für die Überproduktion von Chemikalien sondern auch um zu wachsen. Also besteht ein trade-off zwischen der Produktion und dem Wachstum, der zu sub-optimaler Produktionsleistung führen kann. Eine Lösung dafür ist die Entkopplung des Zellwachstums von der Überproduktion mittels Zwei-Phasen-Bioprozessen. Nach einer ersten Phase, in der Zellen wachsen ohne zu produzieren, wird das Wachstum in der zweiten Phase gestoppt und die Produktion gestartet. Bei der Kreierung eines Zwei-Phasen-Bioprozesses gibt es zwei zentrale Herausforderungen: (1) Der mikrobielle Stoffwechsel und das Zellwachstum müssen dynamisch kontrolliert werden, um einen Übergang zwischen den beiden Prozess-Phasen zu erzielen. (2) Die Stoffwechselaktivität und Produktionsraten sind in nicht-wachsenden Zellen typischerweise niedrig, was durch genetische Modifikationen korrigiert werden muss. Für beide Herausforderungen ist die genaue Kenntnis über die Metabolitkonzentrationen in den modifizierten Stämmen kritisch, um entscheiden zu können, welche genetischen Modifikationen zum Erfolg führen. Daher werden quantitative und Hochdurchsatz-Massenspektrometrie-Methoden entwickelt, die es ermöglichen Metabolitkonzentrationen in einer großen Anzahl an modifizierten Stämmen in kurzer Zeit zu untersuchen. Eine der schnellsten Methoden ist die flow-injection Massenspektrometrie. In dieser Arbeit untersuchen wir Aspekte der dynamischen Kontrolle des Stoffwechsels und Wachstums, der metabolischen Aktivität in nicht-wachsenden Zellen und der flow-injection Massenspektrometrie. Es ist wichtig all diese Aspekte zu untersuchen, um besser zu verstehen, wie das Zellwachstum und die Überproduktion von Chemikalien entkoppelt werden kann. Das Kapitel 1 dient als Einleitung in das Metabolic Engineering, die Massenspektrometrie-basierte Metabolomik, und Zwei-Phasen-Bioprozessen. Das Kapitel 2 ist ein kurze Abhandlung über metabolische Netzwerke. Die flow-injection Massenspektrometrie (FI-MS) ist eine Metabolomik-Methode, die hunderte Metabolite detektieren kann und Messzeiten im Sekundenbereich hat. Allerdings werden Metabolite vor einer Messung mit FI-MS nicht durch chromatographische Methoden aufgetrennt. Dadurch erreichen alle Metabolite das Massenspektrometer zur gleichen Zeit. Das kann zu negativen Effekten führen, wie zum Beispiel Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle und falschen Annotation. Mit dem Kapitel 3, stellen wir eine systematische Untersuchung von Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle während der Messungen mittels FI-MS vor. Dabei war die Nutzung von 160 authentischen Metabolitstandards, die wir einer Metabolitextrakt-Probe hinzugegeben haben, zentral für unsere Analyse. Mittels einer Netzwerk-Analyse und Informationen über Metabolit-Fragmentierung konnten wir zeigen, dass Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle abundant sind und sogar sequentielle Mehrfachmodifikationen vorkommen. Mit unserem Analyse-Ansatz konnten wir einen großen Anteil dieser Modifikationen erklären. Die hier vorgestellten Daten sind eine wertvolle Ressource und sind hilfreich, um falsche Annotationen zu vermeiden. Temperatur-sensitive Proteine haben Aminosäure-Substitutionen, die eine Aktivität bei niedrigen Temperaturen erlauben. Bei höheren Temperaturen, bei denen Wildtyp-Proteine noch aktiv sind, sind Temperatur-sensitive Proteine hingegen inaktiv. Als Teil dieser Arbeit haben wir untersucht, ob Temperatur-sensitive Proteine als Hilfsmittel für das Metabolic Engineering nützlich sind und eine dynamische Kontrolle des Zellwachstums und Stoffwechsels ermöglichen. Ein Ziel war es Temperatur-sensitive Proteine zu nutzen, um Zwei-Phasen-Bioprozesse zu kreieren. Dadurch, dass es schwierig sein kann Temperatur-sensitive Mutanten zu finden, lag ein Fokus unserer Arbeit auf der Entwicklung von Hochdurchsatzverfahren zur Erzeugung von Temperatur-sensitiven Mutanten. Mit dem Kapitel 4, stellen wir eine Hochdurchsatz-Methode zur Anreicherung von Temperatur-sensitiven Mutanten eines einzelnen essentiellen Genes in Escherichia coli vor. Die Methode verbindet einen Einzelzell-Wachstumsraten-Sensor, der auf einem TIMER-Protein basiert, mit Fluoreszens-aktivierter Zellsortierung. Dies hat es uns ermöglicht, Millionen von Zellen zu screenen und Temperatur-sensitive Mutanten der Argininosuccinat Synthetase ArgG anzureichern. Wir konnten zeigen, dass ArgG ähnlich wie ein Ventil für Stoffwechselwege funktionieren kann, und, dass es uns ermöglicht das Wachstum graduell mittels der Temperatur zu steuern. Gleichzeitig erlaubt es auch die Überproduktion von Citrullin, das das Substrat der ArgG-katalysierten Reaktion ist. Mittels Temperatur-sensitivem ArgG, haben wir einen Zwei-Phasen-Bioprozess kreiert, mit dem innerhalb von 45 Stunden 3 g/L Citrullin in 1 L-Bioreaktoren hergestellt werden konnte. Anschließend zu der Studie über Temperatur-Sensitivität als Hilfsmittel für das Metabolic Engineering, beschreiben wir in Kapitel 5 eine Methode, um Temperatur-sensitive Mutanten in vielen unterschiedlichen Genen zu erzeugen und zu identifizieren. Wir haben eine CRISPR/Cas9-basierte Methode zur Genomeditierung adaptiert und einen angepassten Designansatz genutzt, um eine gepoolte Sammlung von 15.120 E. coli Stämmen zu erzeugen. Jeder dieser Stämme hat eine Mutation, die eine einzelne Aminosäure-Substitution in einem von 346 essentiellen Proteinen hervorruft. In kompetitiven Fitness-Untersuchungen bei zwei unterschiedlichen Temperaturen haben wir die Abundanz einzelner Stämme mit Hilfe von deep sequencing der Plasmid-basierten barcodes verfolgt. Das hat es uns ermöglicht, 1.045 Temperatur-sensitive Kandidaten zu identifizieren. Nachdem wir 92 Stämme isoliert hatten, konnten wir die Funktion von 42 Temperatur-sensitiven Enzymen als metabolische Ventile mittels FI-MS bestätigen. Als letzten Schritt haben wir sieben Temperatur-sensitive Stämme für die Überproduktion von Chemikalien in Zwei-Phasen-Prozessen genutzt. Das enforced ATP wasting (erzwungene ATP-Verschwendung) ist ein vielversprechender Ansatz, um hohe metabolische Aktivitäten während des Wachstum-Stopps zu erzielen. Mit Kapitel 6 stellen wir eine Studie zu dem enforced ATP wasting in E. coli vor. Die Überexpression von ATPase führte unter anaeroben Bedingungen und Stickstofflimitierung zu stark erhöhten Glukose-Aufnahmeraten. Fermentationsprodukte akkumulierten bis die Glukose im Medium erschöpft war. Wir haben an der ersten Studie zum enforced ATP wasting angeknüpft und untersucht, wie der Energiestoffwechsel durch unterschiedliche Expressionsstärken der ATPase beeinflusst wird (Kapitel 7). Mit steigender ATPase-Expressionsstärke stieg auch die Glukose-Aufnahmerate bis zu einem kritischen Punkt. Eine weitere Erhöhung der Expressionsstärke über diesen kritischen Punkt hinweg führte zu einem rapiden Abfall in der Glukose-Aufnahmerate, sogar unter das Niveau eines Wildtyp-Stamms. Wir konnten zeigen, dass dieser Effekt auf ein Enzym in der oberen Glykolyse zurückzuführen ist: die Phosphofructokinase,welcheATP als Substrat hat und die durch ADP allosterisch aktiviert wird. Diese Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis des Energiestoffwechsels in E. coli bei. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse auch, dass enforced ATP wasting sehr effektiv ist, um die Glukose-Aufnahmeraten in nicht-wachsenden Zellen deutlich zu steigern. Das macht enforced ATP wasting zu einem sehr nützlichen Mittel für das Metabolic Engineering

    The landscape of combination therapies against glioblastoma:From promises to challenges

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    We demonstrate in this thesis how new targets can be identified and highlight the challenges that lie in front of us when trying to translate these steps toward the clinic. We conclude that the blood-brain barrier, PD/PK of drugs, and therapy resistance are still major challenges and explain the limited improvement in treatment options for patients with GBM. First, GBM is a diffuse glioma located in the brain where the blood-brain barrier prevents the crossing of drugs and thereby limits the efficacy of treatment. Second, inter- and intratumoral heterogeneity have been observed in GBM leading to different cellular subpopulations with distinctive genetic profiles. Hence, treating these subpopulations with targeted drugs allows until now still survival of certain subpopulations that are not sensitive to this treatment. Lastly, therapy resistance is often seen in GBM patients and is probably related to intratumoral heterogeneity, but the intrinsic molecular mechanism is still not fully understood. Together they lead to the inevitable recurrence of the tumor

    Glycolytic Inhibitors as Leads for Drug Discovery in the Pathogenic Free-Living Amoebae

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    The free-living amoeba, Naegleria fowleri, can cause a rare yet usually lethal infection of the brain called primary amebic meningoencephalitis. Because of poor diagnostics and limited treatment options, the mortality rate associated with the disease is \u3e97%. Due to our finding that glucose is critical for trophozoite growth in culture, we have been interested in exploiting amoebae glucose metabolism to identify new potential drug targets. We have characterized the first enzyme of the glycolytic pathway, glucokinase (Glck), from N. fowleri and two other pathogenic free-living amoeba, Acanthamoeba castellanii and Balamuthia mandrillaris. We have assessed their biochemical properties and tested potential inhibitors on the recombinant Glcks, which revealed that these enzymes are sufficiently different from one another that developing pan-amoeba inhibitors may be challenging. However, their individual differences from the human host enzyme suggests that species-specific Glck inhibitors could be identified. We have also explored targeting the glucose metabolizing enzyme enolase in N. fowleri using a series of phosphonate human enolase 2 (ENO-2) specific inhibitors that were developed to treat human cancer. These compounds are curative for ENO-1 deleted glioblastoma in a rodent model, can cross the blood-brain barrier, and are of limited toxicity to non-human primates. The phosphonate inhibitors were toxic to N. fowleri in vitro with (1-hydroxy-2-oxopiperidin-3-yl) phosphonic acid (HEX) being the most potent, with an EC50 value of 0.21 ± 0.02 µM, almost 1500-fold lower than the concentration required to impact human cells. Unbiased metabolomics indicates that glycolytic intermediates upstream of NfENO accumulate in HEX treated amoebae. In an effort to genetically validate new targets for therapeutic intervention, we have initiated efforts to develop molecular tools for use in N. fowleri. We have designed a vector for transient transfection of the amoebae that harbors portions of the 5’UTR of actin 1 (NF0111190) upstream of both eYFP and a hygromycin resistance gene, termed pJMJM1. We have tested a variety of approaches used in other parasite systems for plasmid delivery including the transfection reagent SuperFect, Amaxa Nucleofector technologies, and various electroporation settings. Transfection of N. fowleri flagellates with 5 µg pJMJM1 by electroporation (100 V, 500 µF, 400 Ω) yielded a population of fluorescent cells seven days after being treated with 300 µg/mL hygromycin, but this expression of eYFP was lost over time. More recently, we have used CRISPR/Cas9- mediated gene editing to successfully introduce an eYFP repair template into a predicted protein locus. While fluorescent cells were not noted in the culture, editing was confirmed by PCR analysis. Development of these molecular techniques will provide an important tool for uncovering potential target genes and allow for a better understanding of amoeba biology
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