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Feasability of yeast and bacteria identification using UV-VIS-SWNIR difusive reflectance spectroscopy
UV-VIS spectroscopy is a powerfull qualitative and quantitative technique used in analytical chemistry, which gives information about electronic transitions of electrons in molecular orbitals. As in UV-VIS spectra there is no direct information on characteristic organic groups, vibrational spectroscopy (e.g. infrared) has been preferred for biological applications. In this research, we try to use state-of-the-art fiber optics probes to obtain UV-VIS-SWNIR diffusive reflectance measurements of yeasts and bacteria colonies on plate count agar in the region of 200-1200nm; in order to discriminate the following microorganisms: i) yeasts: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Candida albicans, Yarrowia lipolytica; and ii) bacteria: Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Bacillus cereus. Spectroscopy results show that UV-VIS-SWNIR has great potential for identifying microorganisms on plate count agar. Scattering artifacts of both colonies and plate count agar can be significantly removed using a robust mean scattering algorithm, allowing also better discriminations between the scores obtained by singular value decomposition. Hierarchical clustering analysis of UV-VIS and VIS-SWNIR decomposed spectral scores lead to the conclusion that the use of VIS-SWNIR light source produces higher discrimination ratios for all the studied microorganisms, presenting great potential for developing biotechnology applications.info:eu-repo/semantics/publishedVersio
Desenvolvimento de abordagens de espectroscopia de fibra ótica para a análise em alto débito de estirpes de Saccharomyces cerevisiae
Dissertação de mestrado em Genética MolecularO objetivo deste trabalho consistiu na implementação de um teste
espectrométrico miniaturizado e de alto rendimento para a análise de estirpes de
Saccharomyces cerevisiae da coleção do Centro de Biologia Molecular e Ambiental da
Universidade do Minho. Para atingir esse objetivo foi necessário desenvolver um
suporte para microplacas de 96 poços onde se realizaram as medições, no sentido de
encontrar as melhores condições de crescimento para as estirpes e a posterior
aquisição dos espectros. Os espectros foram adquiridos na zona da luz ultravioletavisÃvel-
infravermelha próximo de ondas curtas (200 – 1100 nm). As estirpes utilizadas
foram inoculadas em meio YPD agarizado numa microplaca de 96 poços. Os
espectros obtidos foram submetidos a pré-tratamentos e posteriormente a análise de
componentes principais relevantes e a análise discriminante por mÃnimos quadrados
parciais, quando indicado.
Ensaios preliminares de otimização sugeriram a necessidade de ter em
atenção determinados cuidados para minimizar os erros provenientes do material
utilizado e que podiam interferir com a análise espectral das estirpes. Foi demonstrada
a possibilidade de distinguir 11 estirpes da levedura S. cerevisiae, provenientes de
diferentes localizações geográficas e origens de isolamento, bem como de 9 isolados
isogénicos da estirpe comercial de vinificação Zymaflore VL1 (Lallemand), desde que
se consideram condições experimentais muito padronizados como, por exemplo, a
obtenção de espectros que foram obtidos na mesma microplaca. Com esta abordagem
foi alcançada uma boa reprodutibilidade de réplicas de crescimentos e medições
espectrométricas. No entanto, não foi obtida uma boa reprodutibilidade entre
microplacas contendo as mesmas estirpes. Verificou-se também que a semelhança
espectral não está relacionada com a localização geográfica e/ou a origem do
isolamento das estirpes. As modificações espectrais foram também registadas durante
o crescimento das estirpes nos poços das microplacas. As análises posteriores
distinguiram as diferentes fases de crescimento, mas para o tempo de incubação entre
42 h e 76 h não se verificaram diferenças espectrais significativas. Em todas as
experiências anteriores, a identidade de cada estirpe analisada era conhecida. Para
validar este método espectroscópico foi necessário verificar a possibilidade de se
conseguir distinguir isolados da estirpe S. cerevisiae sem conhecimento prévio da sua
identidade. Os resultados das análises espectrais obtidos foram comparados com os
de perfis moleculares (análise interdelta) destes isolados e não se observou uma
correspondência entre o número de estirpes identificado por cada um dos métodos.
Por este motivo, trata-se de uma técnica que não poderá ser utilizada para distinguir
estirpes cuja identidade seja desconhecida. Sendo uma técnica no inÃcio do seu
desenvolvimento, verificou-se a ocorrência de vários problemas sistemáticos nas
experiências realizadas, inerentes ao material utilizado e devido à variação na
composição das microplacas e do meio de cultura. Contudo, foram apresentadas
soluções para a obtenção de resultados mais fiáveis e reprodutÃveis no futuro.The aim of this work was to develop a high-throughput spectrometric assay for
the analysis of Saccharomyces cerevisiae strains from the collection of the Centre for
Molecular Biology and Environment, University of Minho. To achieve this goal it was
necessary to develop a support for 96-well microplates for small-scale spectra
acquisition and for the development of the best growth conditions. The spectra were
acquired in the region of ultraviolet-visible-near infrared short wave light (200 - 1100
nm). The strains used were inoculated in wells of a 96-well microplate containing YPD
agar. The spectra obtained were subjected to pre-treatments and subsequently to
relevant principal components analysis and the discriminant analysis by partial least
squares, whenever indicated.
Preliminary optimization tests suggested the need to consider several aspects
(such as the material used), that could interfere with the spectral analysis of the S.
cerevisiae strains. It was possible to distinguish between 11 S. cerevisiae strains from
different geographical locations and sources of isolation and 9 isogenic isolates of the
commercial winemaking strain Zymaflore VL1 (Lallemand), that were re-isolated from
vineyards when the obtained spectra derived from a single microplate. The distinction
of strains occurred with a good reproducibility of the four replicates included in each
microplate. However, a lack of reproducibility occurred between spectra obtained from
different microplates that contained the same strains. It was also found that the spectral
similarity of strains did not correlate with the geographic localisation and the source of
isolation. Spectral analyses distinguished different stages of exponential cellular
growth, whereas no significant spectral differences were recorded between 42 h and
76 h of growth. In all previous experiments, the identity of each strain analysed was
known. For further validation of this spectroscopic method, we evaluated the ability to
distinguish among several S. cerevisiae isolates that were previously characterized by
interdelta analysis. The comparison of results from spectral analysis with interdelta
profiles revealed the number of strains identified by each method was different. We
herein developed a first exploratory approach for the high throughput analysis of S.
cerevisiae strains by fiber optics spectroscopy. Several systemic problems, inherent to
the materials used, such as variation in the composition of the microplate and the
culture medium still need to be solved and we present solutions for the achievement of
more reliable and reproducible results in the future