Study of the Lysogenic Phages and Their Potential Applications in Clinical Strains of Multi-Drug Resistant Bacteria

Programa Oficial de Doutoramento en Bioloxía Celular e Molecular . 5004V01[Abstract] Bacteria with multiple resistance entail a global threat. In recent years, phage therapy has been widely reconsidered as an alternative to antibiotics. In particular, lytic phages have been shown to have great potential for treating infections with multi-resistant bacteria. In this thesis, we present the utility and study of lysogenic phages in clinical strains of multi-resistant bacteria. Concerning the potential of lysogenic phages in phage therapy, we have developed the strategy of transforming a lysogenic phage into a lytic one, Ab105-2φΔCI, and characterized its microbial activity. We also have purified and assayed the antimicrobial activity of two endolysins ElyA1 and ElyA2, from two prophages of a clinical strain of A. baumannii. Both alternatives have been shown to be effective in combination with antibiotics. In relation to the study of lysogenic phages in clinical strains, we pointed out the problem of the possible appearance of bacterial resistance against phages and the importance of searching and characterizing these resistance systems by searching in silico for phage resistance mechanisms in clinical strains of A. baumannii. We also identified 4 complete prophages in clinical strains of P. aeruginosa, 2 of them were newly identified: a Siphovirus phage, AUS531phi, and a filamentous Inovirus phage, pf8. Furthermore, we characterized a gene that increases the ability of one of them, the bci gene in AUS531phi, to infect the bacteria by the regulation of the Quorum system.[Resumo] As bacterias con múltiples resistencias supoñen unha ameaza a nivel global. Nos últimos anos, a terapia de fagos reconsiderouse amplamente como unha alternativa aos antibióticos. Especialmente, demostrouse que os fagos líticos teñen un gran potencial para tratar infeccións con bacterias multirresistentes. Nesta tese presentamos a utilidade e o estudo dos fagos lisoxénicos en cepas clínicas de bacterias con múltiple resistencia aos antibióticos. En relación ao potencial dos fagos lisoxénicos en terapia de fagos, desenvolvemos a estratexia de converter un fago lisoxénico nun lítico, Ab105-2φΔCI, e caracterizar a súa actividade microbiana. Tamén purificamos e caracterizamos a actividade microbiana de dúas endolisinas, ElyA1 e ElyA2 de dous profagos dunha cepa clínica de A. baumannii. Ambas alternativas demostraron ser efectivas en combinación con antibióticos. En relación ao estudo dos fagos lisoxénicos en cepas clínicas, sinalamos a problemática da posible aparición de resistencia contra fagos e a importancia de buscalas e caracterizalas buscando in silico mecanismos de resistencia contra fagos en cepas clínicas de A. baumannii. Tamén localizamos 4 profagos completos en cepas clínicas de P. aeruginosa, 2 deles foron novamente identificados: un fago do tipo Siphovirus, AUS531phi, e outro filamentoso do tipo Inovirus, pf8. Ademais, caracterizamos un xene que incrementa a habilidade dun deles, o xene bci en AUS531phi, para infectar a bacteria mediante a regulación do Quorum Sensing.[Resumen] Las bacterias con múltiples resistencias suponen una amenaza a nivel global. En los últimos años, la terapia de fagos se ha reconsiderado ampliamente como una alternativa a los antibióticos. Especialmente, se ha demostrado que los fagos líticos poseen un gran potencial para tratar infecciones con bacterias multirresistentes. En esta tesis presentamos la utilidad y estudio de los fagos lisogénicos en cepas clínicas de bacterias multirresistentes. En relación al potencial de los fagos lisogénicos en terapia de fagos hemos desarrollado la estrategia de convertir un fago lisogénico en uno lítico, Ab105-2φΔCI, y caracterizar su actividad microbiana. También purificamos y caracterizamos la actividad microbiana de dos endolisinas, ElyA1 y ElyA2, de dos profagos de una cepa clínica de A. baumannii. Ambas alternativas han demostrado ser efectivas en combinación con antibióticos. En relación al estudio de fagos lisogénicos en cepas clínicas, hemos señalado la problemática de la posible aparición de resistencia contra fagos y la importancia de buscarlas y caracterizarlas buscando in silico mecanismos de resistencia contra fagos en cepas clínicas de A. baumannii. También localizamos 4 profagos completos en cepas clínicas de P. aeruginosa, 2 de ellos fueron nuevamente identificados: un fago del tipo Siphovirus, AUS531phi, y otro filamentoso del tipo Inovirus, pf8. Además, también caracterizamos un gen que incrementa la habilidad de uno de ellos, el gen bci en AUS531phi, para infectar a la bacteria mediante la regulación del Quorum Sensing

Pseudomonas fluorescens: the effect of evolution on the effectiveness of lytic phage as a control agent

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Antibiotic resistance in pathogenic bacteria is an increasing concern in health programs, and a number of alternatives are currently under investigation. One promising alternative is phage therapy, the use of specific bacteriophages to control or eradicate pathogenic bacteria. Despite having many advantages, the use of phages still presents some limitations and requires experimental investigation. Phage therapy benefits from the abilities of phages to multiply in situ and evolve, but bacteria can also evolve resistance to phages, in a process called antagonistic coevolution. Through the coevolution and evolution of wild type and mutator strains of Pseudomonas fluorescens and its lytic phage φ2, this study sought to determine how the nature of selection affects phage killing efficiency. Phages were sequentially transferred either with bacteria (coevolution) or passaged on the ancestral bacteria (evolution). The efficiency of phages from three time points (transfers 1, 4 and 8) was estimated by plating on ancestral and allopatric coevolved bacteria. The results indicate that the coevolution treatment leads to a greater increase in phage efficiency than the evolution treatment. This is specially seen when phage populations are confronted with mutator coevolved bacteria, which may be due to a specialization cost to the evolved phage populations. Wild type coevolved bacteria were resistant to all allopatric phages, whether from the past, present or future. Phage infectivity to ancestral bacteria peaked early in the transfer regime. Further studies are necessary to confirm these results and should consider the effects of phage dose.O alastramento de infecções hospitalares com bactérias resistentes a antibióticos têm vindo a aumentar nos últimos anos. A evolução de bactérias resistentes a antibióticos tem sido acelerada, em parte, devido ao excessivo uso destas substâncias, durante mais de meio século, não só no tratamento médico de pacientes, mas também na criação de animais para consumo humano. Também a evolução de resistência simultânea a múltiplos antibióticos tem vindo a aumentar em bactérias patogénicas graças à existência de elevadas taxas de mutação e à ocorrência de transmissão horizontal de genes. Por outro lado, os custos da resistência a antibióticos tendem a diminuir rapidamente no curso da evolução, o que faz com que a simples suspenção temporária do uso de um dado antibiótico não seja suficiente para eliminar os genótipos resistentes. Também uma diminuição na produção de novos antibióticos tem vindo a tornar clara a necessidade de criação de alternativas à simples administração de um antibiótico. Algumas alternativas incluem a alternância do uso de mais do que uma classe de antibióticos ao longo de vários meses ou anos e o uso simultâneo de diferentes antibióticos em diferentes pacientes no mesmo hospital (chamado “mixing”) ou no mesmo paciente. Outros métodos incluem a utilização de hidrolases da parede celular bacteriana (enzimas que degradam o principal constituinte da parede celular bacteriana, os peptidoglicanos, levando à lise celular e podendo ter origem em células eucarióticas, bacterianas e em bacteriófagos) e de péptidos antimicrobiais (péptidos com grande actividade bactericida e também com origem em células eucarióticas, bacterianas e em bacteriófagos). Embora apresentem algumas características promissoras, como a baixa capacidade que as bactérias apresentam para evoluir resistência a algumas destas moléculas, elevados custos de produção e a sua potencial toxicidade fazem com que estes métodos ainda necessitem de aperfeiçoamento antes que possam ser aplicados. Uma outra alternativa à utilização de antibióticos é a terapia fágica, que consiste na utilização de bacteriófagos (ou fagos) específicos para erradicar ou controlar bactérias patogénicas. Após a descoberta, no início do século 20, da capacidade dos fagos de matarem bactérias, esta técnica foi durante várias décadas desenvolvida e aplicada apenas nos países da ex-União Soviética. Apenas recentemente voltou a ser considerada nos países Ocidentais, dada a urgência em desenvolver alternativas à utilização de antibióticos. Os bacteriófagos têm várias vantagens face ao uso de antibióticos, entre as quais se podem destacar o facto de se multiplicarem exponecialmente no local da infecção; serem bastante específicos no seu hospedeiro, o que protege a flora normal do organismo do paciente e diminui o número de estirpes bacterianas que lhes poderão evoluir resistência; serem eficientes contra bactérias resistentes a antibióticos; e poderem ser combinados com outros fagos ou com antibióticos para aumentar a sua eficácia. No entanto, a terapia fágica também apresenta algumas limitações, como o facto de os fagos utilizados para este fim terem de ser obrigatoriamente fagos líticos (que injectam o seu material genético dentro das células bacterianas e libertam a sua progenia através da indução da lise bacteriana); com uma baixa capacidade de transferir material genético entre células bacterianas; e, preferencialmente, com o seu genoma totalmente sequenciado (para evitar a presença de genes indesejados, como os que codificam proteínas tóxicas para os pacientes). A existência da várias limitações à aplicação da terapia fágica sublinha a importância da investigação nesta área, para garantir uma adequada selecção e formulação dos fagos utilizados. A capacidade que os fagos têm de evoluir in situ pode também ser considerada como uma desvantagem, dado o facto de tornar o seu comportamento algo imprevisível. No entanto, esta característica está na base da sua capacidade de se adaptarem ao seu hospedeiro. Infelizmente, as bactérias têm também a capacidade de evoluir resistência aos fagos, originando um processo designado por coevolução antagonística entre um parasita e o seu hospedeiro: o hospedeiro evolui resistência ao seu parasita devido à selecção exercida pelo parasita e, reciprocamente, ocorre a evolução da infectividade do parasita, contrapondo assim os mecanismos de defesa do hospedeiro. Os microorganismos são um modelo que apresenta bastantes vantagens para o estudo da evolução e coevolução, como o facto de terem tempos de geraçãos curtos e serem fáceis de manter em grande número, o que lhes permite evoluirem rapidamente no decurso de uma experiência. Outra vantagem é o facto de poderem ser congelados indefenidamente, o que permite a comparação de diferentes pontos temporais do processo evolutivo. Este estudo utilizou o sistema Pseudomonas fluorescens SBW25 e o seu fago lítico associado ɸ2 (onde já foi demonstrada a ocorrência de coevolução antagonística) para estudar o efeito da evolução e coevolução na capacidade dos fagos de matarem bactérias (um dos prerequesitos da terapia fágica). O seu objectivo é contribuir para o desenvolvimento de um protocolo experimental que aumente a eficiência dos fagos, melhorando assim o controlo de bactérias patogénicas. Estudos anteriores verificaram que estes diferentes tipos de selecção afectam diferentemente a virulência dos fagos. Nesta experiência, os fagos foram coevoluídos (transferidos sequencialmente em conjunto com as bactérias) ou evoluídos (transferidos sequencialmente para as bactérias ancestrais) com duas estirpes de P. fluorescens, wild-type (WT) e mutS- (mutS) (um “hypermutator”). A estirpe mutS SBW25 tem um knockout no gene mutS, o que lhe confere uma taxa de mutação aproximadamente 100 vezes superior à do WT (mutS tem uma taxa de mutação de c 5x10-5 mutações por par de bases, por geração). Esta estirpe foi utilizada devido ao facto de bactérias com elevadas taxas de mutação (“mutators”) serem frequentemente encontradas em populações naturais e laboratoriais e estarem frequentemente associadas a infecções clínicas. Experiências laboratoriais demonstraram também que estas bactérias têm uma maior probabilidade de evoluir e conservar resistência a antibióticos na presença de fagos. Foram realizadas 8 transferências sequenciais (uma a cada 48h). As populações fágicas iniciais cresceram a partir de culturas de WT ou mutS ancestrais e foram estimadas através do seu plaqueamento em tapetes bacterianos (da mesma estirpe ancestral na qual cresceram) e da contagem no número de placas fágicas (PfUs). 24 microcosmos com fagos e bactérias foram preparados, cada um através da adição de c 104 partículas fágicas, vindas da população inicial, e de 60μl de bactérias crescidas overnight (c 107 células) a 6ml de meio Kings B (KB). Em 12 destas populações, os fagos foram confrontados com bactérias WT e, nas outras 12 populações, com bactérias mutS. Metade das réplicas de cada tratamento foram coevoluídas, sendo que a cada passagem foram transferidos 60μl de cultura para novos microcosmos com 6ml de meio KB. Na outra metade das réplicas de cada tratamento (evolução), os fagos foram isolados a cada passagem, e 60μl de solução fágica, juntamente com 60μl da estirpe bacteriana ancestral correspondente crescida overnight, foram transferidos para um novo microcosmos com 6ml de meio KB. Foram guardados stocks a -80ºC. Fagos de três pontos temporais (transferências 1, 4 e 8) foram isolados e todas as populações fágicas foram testadas em tapetes bacterianos de bactérias WT e mutS, quer ancestrais, quer previamente coevoluídas até à 4ª transferência (numa experiência preliminar, portanto as bactérias eram alopátricas aos fagos). A densidade de partículas fágicas que mataram bactérias (a eficiência fágica) foi estimada através da contagem de placas fágicas. Os fagos coevoluídos mostraram-se mais eficientes do que os fagos evoluídos, embora exista a possibilidade de haver um efeito de dose (o aumento no número de fagos observado pode reflectir um aumento na eficiência de ataque por partícula fágica ou um aumento no número de fagos). Para corrigir um possível efeito de dose foram testados modelos estatísticos em que o número de fagos foi expresso em relação ao número de fagos obtido nas bactérias WT ancestrais. Foi demonstrado que as bactérias WT ancestrais não são sensíveis a todos os fagos, o que indica que o número de fagos pode ser subestimado nestas bactérias. Todas as bactérias coevoluídas mostraram-se mais resistentes aos fagos que as ancestrais. As bactérias WT coevoluídas (até t4) mostraram-se totalmente resistentes a todas as populações de fagos (alopátricos), quer estes fossem coevoluídos ou evoluidos (em bactérias WT ou mutS), e quer fossem fagos do passado (t1), presente (t4) ou futuro (t8). Isto poderá estar relacionado com a aquisição de custos de resistência. Já as bactérias mutS coevoluídas (até t4) mostraram-se sucessivamente mais sensíveis as fagos t1, t4 e t8. Estas bactérias poderão ter uma desvantagem face aos fagos (em comparação com as bactérias WT). Também as populações de fagos coevoluídos mostraram-se mais eficientes quando confrontadas com as bactérias coevoluídas do que as populações de fagos evoluídos, o que pode dever-se ao facto de os fagos evoluídos em bactérias ancestrais sofrerem um custo nas bactérias coevoluídas. Todas as populações fágicas aumentaram em eficiência até à 8ª transferência face às bactérias mutS coevoluídas. No entanto, quando confrontados com as bactérias ancestrais, os fagos aumentaram maioritariamente a sua eficiência até t4, tendo-a mantido entre t4 e t8. Isto pode indicar que os fagos atingiram o seu pico de eficiência face às bactérias ancestrais após um curto número de transferências e que, no caso dos fagos coevoluídos, estes poderão sofrer custos de especialização. Devido ao potencial efeito de dose, mais estudos serão necessários para confirmar estes resultados

Terapia fágica: passado, presente e futuro

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências FarmacêuticasO termo bacteriófago resulta da associação de duas distintas designações, “bactéria” e “phagein”. Deste modo, um bacteriófago é um ser capaz de devorar bactérias. Como tal, este bacteriófago, ou apenas fago, como também é denominado, é o centro de aplicabilidade da Terapia Fágica. As infecções bacterianas são actualmente uma constante preocupação, não só para o Homem, como também para as plantas e animais, isto porque, a sensibilidade por elas demonstrada perante o tratamento com antibióticos se mostra presentemente comprometida. Revela-se nesta fase, a administração de bacteriófagos uma prática bastante promissora. Os fagos mostram-se capazes de lisar a bactéria infectante sem que se mostrem prejudiciais para o Homem. Contraposta à terapêutica antibiótica, a terapia fágica apresenta maior selectividade, maior eficácia, menor custo e maior capacidade de contornar a resistência bacteriana. Torna-se imprescindível a aposta científica nesta área ainda em descobrimento, especialmente no que se refere ao aprofundamento de estudos específicos que simulem as mais variadas condições do organismo humano. The term bacteriophage results from the association of two distinct designations, "bacteria" and "phagein". Thus, a bacteriophage is a being able to eat bacteria. This way, this bacteriophage, or just phage, as it is also called, is the center of applicability of phage therapy. Bacterial infections are a constant concern today, not only when in humans, but also when in plants or animals, because, their sensibility to the treatment with antibiotics is presently compromised. At this phase, the administration of bacteriophages is quite promising. Phage is capable of lysing the infecting bacteria without being harmful to humans. Unlike the antibiotic therapy, the phage therapy has higher selectivity, higher efficacy, lower cost and greater ability to bypass the bacterial resistance. It becomes essential the scientific bet in this area, which is still growing, especially in what regards to further specific studies, simulating the most various conditions of the human body

O potencial biotecnológico dos bacteriófagos na deteção e controlo de bactérias patogénicas

Os bacteriófagos (fagos) apresentam um imenso potencial biotecnológico com aplicação na saúde devido às suas características intrínsecas de reconhecimento e morte do hospedeiro que infetam (bactérias). A exploração destas características no desenvolvimento de métodos de deteção e de controlo de bactérias patogénicas é relativamente recente, embora a utilização de fagos como ferramentas de biologia molecular seja bastante antiga e a terapia fágica uma prática secular, actualmente limitada a alguns países

Bacteriófagos no ambiente de processamento do leite.

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Lactobacillus casei/paracasei: aislamiento de mutantes espontáneos fagorresistentes para uso industrial

ResumenLos fagos de bacterias probióticas son causa de enormes pérdidas económicas y severas limitaciones a las estrategias de control. En este trabajo se aislaron y caracterizaron mutantes de L. casei/paracasei empleando el primer fago L. paracasei aislado en Sudamérica en una planta industrial argentina. Se caracterizaron fenotipo (eficiencias de recuperación de resistentes verdaderos, estabilidad, resistencia frente a otros fagos específicos) y mecanismos de fagorresistencia (nivel de fagorresistencia, liberación espontánea de fagos virulentos, adsorción con y sin calcio). Se demostró que el aislamiento de mutantes espontáneos resistentes desde bacterias probióticas sensibles, resulta una alternativa válida para obtener cepas para rotar en procesos industriales. Summary Phage attacks to probiotic strains cause enormous economic losses and limit common control strategies. In this work, spontaneous bacteriophage insensitive mutants were isolated from sensitive L. casei/paracasei strains against the first Sudamerican L. paracasei phage isolated in an Argentinean dairy plant. Phage resistance phenotype (efficiency of phage-resistant recovery, stability, sensitivity against other specific phages) and phage resistance mechanisms (phage resistance level, spontaneous release of virulent phages, phage adsorption with or without cacium ions) were characterized. The isolation of spontaneous phage-resistant mutants, from sensitive probiotic bacteria, was demonstrated to be a useful tool to obtain strains to rotate in industrial processes.Fil: Capra, María Luján. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Lactología Industrial. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería Química. Instituto de Lactología Industrial; ArgentinaFil: Mercanti, Diego Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Lactología Industrial. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería Química. Instituto de Lactología Industrial; ArgentinaFil: Reinheimer, Jorge Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Lactología Industrial. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería Química. Instituto de Lactología Industrial; ArgentinaFil: Quiberoni, Andrea del Lujan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Lactología Industrial. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería Química. Instituto de Lactología Industrial; Argentin

Isolation of bacteriophages from must and wine for the elimination of contaminating bacteria as an alternative to the use of sulfurous

Acetic and some lactic acid bacteria are the main reason for the loss of quality of musts and wines, giving rise to defects such as "vinegary", "chopped" or preventing alcoholic and / or malolactic fermentation. The solution to this problem consists in the application of authorized bactericidal agents, such as sulfurous. The aim of this work is to isolate bacteriophages from musts and wines of different grape varieties, able to eliminate lactic and acetic acid bacteria spoilages. Musts obtained from grape-berries of Vitis vinifera cv. Chardonnay and Moscatel and a red wine made with the Tintilla de Rota variety were used to isolate bacteriophages. It were isolated by classical virology methods and identified by electron microscopy. Host bacteria used in the study were the lactic acid bacteria of the species Lactobacillus hilgardii, L. plantarum and Oenococcus oeni and the acetic bacteria Acetobacter aceti. A comparative study was performed on musts and wines, previously inoculated with bacteria, by phage titration and SO2 addition to study the effectiveness of bacteriophages against bacteria. Bacteriophages were obtained from all musts and wine, belonging to the order of Caudovirals and Tectivirals. The comparative study showed that a cocktail of bacteriophages at low concentration is as effective as sulfur

Detección de genes de resistencia a antibióticos en bacteriófagos

La terapia con antibióticos representa uno de los avances médicos más importantes del siglo XX y es un recurso valioso para el combate de enfermedades causadas por bacterias. Sin embargo, este uso terapéutico no ha sido utilizado de forma correcta ya que en años recientes han aparecido bacterias multiresistentes en diversos ambientes. Esta resistencia se genera por mutaciones puntuales generando genes que confieren esta capacidad resistente a los antibióticos como los betalactámicos, quinolonas, etc. La prevalencia de estos genes ha sido descrita tanto en bacterias como en bacteriófagos, al ser elementos genéticos móviles tienen la capacidad de contener y tranferir por medio de la transducción estos genes entre bacterias patógenas y comensales. El objetivo de este estudio es determinar la presencia de los genes qnrA, qnrB y blaTEM, en el ADN fágico. En este trabajo se tomaron un total de 48 muestras de agua en cuatro rastros municipales (Atlacomulco, San Felipe del Progreso, El Oro e Ixtlahuaca), de las cuales se obtuvieron 19 aislamientos de Escherichia coli de agua residual y 18 aislamientos de alcantarilla (37 en total)

Resistência de bactérias ácido-láticas a bacteriófagos provenientes de unidades de processamento de queijo Coalho.

Este trabalho teve como objetivos isolar bacteriófagos de amostras de leite, soro e queijo de Coalho e avaliar a resistência de cepas de Lactobacillus paracasei , pertencentes à Coleção de Micro-organismos de Interesse para a Agroindústria Tropical da Embrapa Agroindústria Tropical, aos fagos isolados. Posteriormente, a resistência destas cepas a fagos específicos para L. paracasei, da Coleção do Instituto de Lactología Industrial - INLAIN (Santa Fe, Argentina), também foi avaliada. As amostras para isolamento dos fagos foram obtidas em quatro unidades de processamento de queijo de Coalho, sendo duas artesanais e duas industriais, localizadas no Estado do Ceará. Para o isolamento dos bacteriófagos, foi empregado o teste de lise celular (spot), enquanto que a resistência das culturas aos fagos foi avaliada pelos testes de capacidade de produção de ácido e avaliação da turbidez. As cepas avaliadas foram resistentes aos bacteriófagos provenientes das unidades de processamento de queijo de Coalho e aos bacteriófagos da Coleção do INLAIN. Os resultados obtidos indicaram que as culturas láticas testadas, resistentes aos bacteriófagos, podem ser utilizadas na composição de fermento lático destinado à elaboração de queijo de Coalho, a partir de leite pasteurizado