Potential-Dependent Adsorption Behavior of Fluorescent Species at Liquid|Liquid Interfaces Studied by Polarization-Modulation Total Internal Reflection Fluorescence Spectroscopy

13301甲第4724号博士（理学）金沢大学博士論文本文Full 掲載予定あ

A sensitive resonance Rayleigh scattering sensor for dopamine in urine using upconversion nanoparticles

A highly sensitive resonance light scattering method for detecting dopamine in urine was developed by using a novel probe based on lanthanide‐doped upconversion nanoparticles (UCNPs) linked to dopamine–quinone (DQ) by hydrogen bonding and electrostatic interactions. Adding dopamine to a solution containing UCNPs decreases their size and the intensity of their resonance light scattering signals. Based on the decrease, dopamine can be determined in Tris–HCl buffer and in urine samples spiked with analyte concentrations over the range 0–300 μM with a limit of detection of 1.62 μM. As‐prepared UD can thus provide an effective platform for biosensor development, drug discovery, and rapid diagnosis of Parkinson's and Alzheimer's disease, among other medical conditions

NMR, EM and functional studies on TBsmr, a small multidrug transporter from M. tuberculosis

Antibiotic resistance of pathogenic bacteria is a major worldwide problem. Bacteria can resist antibiotics by active efflux due to multidrug efflux pumps. The focus of this study has been the mycobacterial multidrug transporter TBsmr because it belongs to the small multidrug resistance (SMR) family whose members are a paradigm to study multidrug efflux due to their small size. SMR proteins are typically 11-12 kDa in size and have a four-transmembrane helix topology. They bind cationic, lipophilic antibiotics such as ethidium bromide (EtBr) and TPP+, and transport them across the membrane in exchange for protons. To understand the molecular mechanism of multidrug resistance, we have to gain information about the structure and function of these proteins. The research described in this thesis aimed to deduce details about the topology, transport cycle and key residues of TBsmr using biophysical techniques. Solid-state NMR (ssNMR) can provide detailed insight into structural organization and dynamical properties of these systems. However, a major bottleneck is the preparation of mg amounts of isotope labeled protein. In case of proteoliposomes, the problem is compounded by the presence of lipids which have to fit into the small active volume of the ssNMR rotor. In Chapter 3, an enhanced protein preparation is described which yields large amounts of TBsmr reconstituted in a native lipid environment suitable for further functional and structual studies. The achieved high protein-to-lipid ratios made a further characterization by ssNMR feasible. The transport activity and oligomeric state of the reconstituted protein in different types of lipid was studied as shown in Chapter 4. The exact oligomeric state of native SMR proteins is still uncertain but a number of biochemical and biophysical studies in detergent suggest that the minimal functional unit capable of binding substrate is a dimer. However, binding assays are not ideal since a protein may bind substrate without completing the transport cycle which can only be shown for reconstituted protein in transport assays.By combining functional data of a TPP+ transport assay with information about theoligomeric state of reconstituted TBsmr obtained by freeze-fracture electron microscopy, it could be shown that lipids affect the function and the oligomeric state of the protein, and that the TBsmr dimer is the minimal functional unit necessary for transport. The transport cycle must involve various conformational states of the protein needed for substrate binding, translocation and release. A fluorescent substrate will therefore experience a significant change of environment while being transported, which influences its fluorescence properties. Thus the substrate itself can report intermediate states that form during the transport cycle. In Chapter 5, the existence of such a substrate-transporter complex for the TBsmr and its substrate EtBr could be shown. The pH gradient needed for antiport has been generated by co-reconstituting TBsmr with bacteriorhodopsin. The measurements have shown the formation of a pH-dependant, transient substrate-protein complex between binding and release of EtBr. This state was further characterized by determining the Kd, by inhibiting EtBr transport through titration with non-fluorescent substrate and by fluorescence anisotropy measurements. The findings support a model with a single occluded intermediate state in which the substrate is highly immobile. Liquid-state NMR is a useful tool to monitor protein-ligand interactions by chemical shift mapping and thus identify and characterize important residues in the protein which are involved in substrate binding. In agreement with previous studies (Krueger-Koplin et al., 2004), the detergent LPPG was found to be highly suitable for liquid-state NMR studies of the membrane protein TBsmr and 42% of the residues could be assigned, as reported in Chapter 6. However, no specific interactions with EtBr were found. This observation was confirmed by LILBID mass spectrometry which showed that TBsmr was predominantly in the non-functional monomeric state. Functional protein was prepared in proteoliposomes which can be investigated by solidstate NMR (Chapter 7). Besides the essential E13, the aromatic residues W63, Y40, and Y60 have been shown to be directly involved in drug binding and transport. Different isotope labeling strategies were evaluated to improve the quality of the NMR spectra to identify and characterize these key residues. In a single tryptophan mutant of reconstituted TBsmr W30A, the binding of ethidium bromide could be detected by 13C solid-state NMR. The measurements have revealed two populations of the conserved W63 residue with distinct backbone structures in the presence of substrate. There is a controversy about the parallel or anti-parallel arrangement of the protomers in the EmrE dimer (Schuldiner, 2007) but this structural asymmetry is consistent with both a parallel and anti-parallel topology.Die Antibiotikaresistenz pathogener Bakterien ist ein Problem für die Gesundheit von Menschen weltweit und damit ein wichtiges Forschungsziel. Ein Mechanismus zur Resistenz gegen Antibiotika ist der aktive Transport von Antibiotika aus der Zelle heraus durch so genannte Multidrug-Transportproteine. Zusätzlich sind diese Transporter als Modellsysteme auch von großem generellem Interesse, denn ihre erstaunliche Fähigkeit, eine Vielzahl sehr diverser Wirkstoffe spezifisch zu binden, scheint den verbreiteten Ansichten über Substrat-Protein-Wechselwirkung zu widersprechen. Zur Untersuchung des Multidrug-Transports befasst sich die vorliegende Arbeit mit der SMR-Familie (small multidrug resistance), deren Mitglieder sich auf Grund ihrer kleinen Größe hervorragend als Modellsysteme eignen. Die SMR-Proteine sind typischerweise 11-12 kDa schwer und bestehen aus vier transmembranen ? - Helizes. Sie transportiere eine Reihe unterschiedlicher aromatischer und positiv geladener Substrate wie zum Beispiel Ethidium Bromid im Austausch gegen Protonen durch die Membran. Um offene strukturelle und mechanistische Fragen zu beantworten, wurde TBsmr von M. tuberculosis, als ein typisches SMR Protein, ausgewählt. Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis von der Oligomerisierung, dem Transportzyklus und wichtigen, konservierten Aminosäuren der SMR-Familie durch Untersuchungen mit biophysikalischen Methoden zu bekommen. Die Festkörper-NMR-Spektroskopie eignet sich, um Informationen über die Struktur und Dynamik dieser Systeme zu erhalten. Vorteilhaft sind Messungen an Proteoliposomen, da sich das Protein dann in seiner nativen Membranumgebung befindet. Die Notwendigkeit von mg-Mengen isotopenmarkierter Proteine ist aber ein großer Engpass bei der Umsetzung. Der Nachteil dieser Proben ist darüber hinaus das zusätzliche Volumen durch Lipide, da die Festkörper-NMR-Rotoren nur ein geringes Probenvolumen fassen. Durch eine verbesserte Probenpräparation ließen sich große Mengen isotopenmarkiertes TBsmr gewinnen und mit einem hohen Protein-zu-Lipid Verhältnis in Liposomen rekonstituieren. Diese Verbesserungen ermöglichten die nachfolgenden Messungen zur Charakterisierung von TBsmr. Der Oligomerisierungszustand der nativen SMR-Proteine ist noch nicht sicher bestimmt, aber die meisten biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen in Detergenz deuten darauf hin, dass ein Dimer die minimale funktionelle Einheit ist, die Substrat binden kann. Ligand-Bindungs-Experimente haben aber den Nachteil, dass eventuell Substrat an das Protein bindet, es aber trotzdem nicht transportiert werden kann. Daher wurde der Transport des Substrats Tetraphenylphosphonium (TPP+) in verschiedenen Lipiden untersucht. Die Messungen erfolgten mit Hilfe von pH-Sprüngen und einer TPP+ -sensitiven Elektrode. Dabei wurde ein Einfluss der Lipidsorte auf die Aktivität und den Oligomerisierungszustand von TBsmr festgestellt. Durch Kombination mit Informationen über den Oligomerisierungsgrad des rekonstitutierten Proteins aus Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie-Untersuchungen, konnte die Existenz von funktionalen Dimeren, die Substrat transportieren, in POPC nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit bisherigen Untersuchungen, die auf die Existenz höherer Oligomere hindeuten, wurden in E. coli Lipiden Tetramere gefunden. Der Transportzyklus muss eine Reihe von verschiedenen Konformationen für die Bindung, den Transport und die Freisetzung des Substrats enthalten. Eine fluoreszierende Substanz wird sich beim Transport durch die starken Änderungen der Umgebung in ihren Fluoreszenzeigenschaften verändern. Deshalb könnte das Substrat selbst als Reporter für Zwischenzustände im Transportzyklus benutzt werden. Es konnte die Existenz eines solchen Substrat-Transporter-Komplexes für TBsmr und das Substrat Ethidium Bromid mit einem neu entwickelten Assay nachgewiesen werden. Die Möglichkeit eines stabilen pH-Gradienten wurde durch die Korekonstitution von TBsmr mit Bakteriorhodopsin geschaffen. Die beobachtete Fluoreszenzänderung wurde durch einen pH-abhängigen, transienten Substrat-Protein-Komplex zwischen der Bindung und der Freisetzung von Ethidium verursacht. Zusätzlich wurde dieser Zustand durch die Bestimmung eines Kds, der Hemmung des Ethidiumtransports durch die Titration mit einem nicht fluoreszierenden Substrat und durch Fluoreszenzanisotropie-Messungen genauer charakterisiert. Die Ergebnisse deuten auf einen einzelnen verdeckten Übergangszustand hin, in dem das Substrat unbeweglich ist. Lösungs-NMR-Experimente wurden durchgeführt, um zu evaluieren, ob Substrat-Protein-Interaktionen gemessen werden können. Dabei eignete sich besonders das Detergenz LPPG und es war möglich, 42 Prozent aller Resonanzen des Protein-Rückgrates vorläufig zuzuordnen. Es konnten aber keine spezifische Interaktion von TBsmr mit Ethidium Bromid nachgewiesen werden. Die Beobachtungen wurden durch LILBID-Massenspektrometrie-Messungen (Laser Induced Liquid Beam Ionization/Desorption) unterstützt, welche nicht-funktionale TBsmr Monomere in LPPG nachwiesen. Das Problem einer funktionalen Präparation ließ sich durch Aktivität in Lipidmembranen lösen, wo Membranproteine sehr gut mittels Festkörper-NMR untersucht werden können. Neben dem essentiellen Glutamat 13 sind einige weitere, aromatische Aminosäuren (Y40, Y60, W63) für den Transportzyklus wichtig. Es wurden Festkörper-NMR-Messungen an vollständig und selektiv markierten Proben durchgeführt, um durch verschiedene Isotopenmarkierungs-Schemata die Qualität der NMR-Spektren soweit zu verbessern, dass einzelne Aminosäuren identifiziert und charakterisiert werden können. Mit der Mutante TBsmr W30A, in der ein einzelnes Tryptophan vollständig mit 13C Isotopen markiert war, konnte die Bindung von Ethidium Bromid detektiert werden. Die Messungen offenbarten zwei Populationen der konservierten Aminosäure W63 mit verschiedenen Konformationen des Peptidrückgrats in Gegenwart von Substrat. Die beobachtete strukturelle Asymmetrie von W63 ist sowohl in einer parallelen, wie auch anti-parallelen Topologie der Dimere möglich

Comets: Gases, ices, grains and plasma

The program and abstracts of the 97 papers delivered at the colloquium are presented. Cometary nuclei, comet dust, the coma, ion tails, several comet missions, and cometary origin and evolution were discussed

A Low Reabsorbing Luminescent Solar Concentrator Employing π-Conjugated Polymers

A highly efficient thin-film luminescent solar concentrator (LSC) utilizing two π-conjugated polymers as antennae for small amounts of the valued perylene bisimide Lumogen F Red 305 is presented. The LSC exhibits high photoluminescence quantum yield, low reabsorption, and relatively low refractive indices for waveguide matching. A Monte Carlo simulation predicts the LSC to possess exceptionally high optical efficiencies on large scales.National Science Foundation (U.S.) (Graduate Research Fellowship Program (Grant No. 1122374))Eni S.p.A. (Firm) (Eni-MIT Solar Frontiers Alliance

An investigation into the characteristics and sources of light emission at deep-sea hydrothermal vents

Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy at the Massachusetts Institute of Technology and the Woods Hole Oceanographic Institution June 2000A spectral camera (ALISS - Ambient Light Imaging and Spectral System) was used to image ambient light from high-temperature vents at 9°N East Pacific Rise and the Juan de Fuca Ridge during 1997 and 1998 Alvin dive cruises. ALISS is a low-light digital camera with custom-designed optics. A set of nine lenses, each covered by an individual bandpass filter (50 and 100 nm nominal bandwidths), allows vents to be imaged in nine wavelength bands simultaneously spanning the range of 400-1 000 nm. Thus, both spatial and spectral information are obtained. ALISS was used to image three types of vents: black smokers, flange pools, and beehives. The primary source of light is thermal radiation due to the high temperature of the hydrothermal fluid (-350°C). This light is dominant at wavelengths greater than 700 nm. At flange pools, where the fluid is relatively stable, only thermal radiation is present. Black smokers and beehives, however, are subject to mixing with ambient seawater (2°C) leading to mineral precipitation. Data from these types of vents show the existence of non-thermal, temporally varying light in the 400-700 nm region. This light is probably caused by mechanisms related to mixing and precipitation, such as chemiluminescence, crystalloluminescence and triboluminescence

A High-Energy Neutron Flux Spectra Measurement Method for the Spallation Neutron Source

The goal of this work was to develop a foil activation method to measure high-energy (∼1-100 MeV) neutron flux spectra at the Spallation Neutron Source by researching the scientific literature, assembling an experimental apparatus, performing experiments, analyzing the results, and refining the technique based on experience. The primary motivation for this work is to provide a benchmark for the neutron source term used in target station and shielding simulations Two sets of foil irradiations were performed, one at the ARCS beamline and one at the POWGEN beamline. The gamma radiation of the foil activation products was measured with a high purity germanium gamma-ray spectrometer, and the product reaction rates during irradiation were quantified. Corrections, such as self-shielding factors, were applied to the measurements to account for particular effects. The corrected measurement data, along with calculated response functions and an initial guess spectrum, were input to the MAXED neutron spectrum unfolding computer code. MAXED uses the maximum entropy method to unfold an output spectrum that is the minimally modified guess spectrum consistent with the measurement data. The foil irradiation and subsequent analysis from the ARCS spectrum produced a reasonable neutron spectrum, which noticeably differed from the initial guess spectrum. This measurement is regarded as consistent, but yet unverified. The gamma-ray spectrum of the foil irradiation at the POWGEN beamline showed no high-energy activation. This is regarded as an experimental error, and no conclusions can be drawn about the high-energy neutron spectrum. Future foil irradiations are planned to verify and expand the neutron spectrum measurements

Electronic structure of manganese doped pentacene

The desire for low cost electronics has led to a huge increase in research focused on organic materials. These materials are appealing due to their unique electrical and material-processing properties and are rapidly being adopted in old and new electronic applications. To create practical devices requires a further understanding of the charge transport properties of the unique anisotropic molecular crystal structures. This work looks at how doping with the transition-metal element manganese can alter the electronic structure of the organic material pentacene. It has been found that using manganese as a dopant provides novel physical characteristics previously not encountered in organic field effect transistors based on pentacene. These organic thin films were characterized using X-ray absorption spectroscopy and the results compared to computational density functional theory analysis

Fluorescent Tracers for air-sided Concentration Profile Measurements at the Air-Water Interface

Diese Arbeit behandelt die Visualisierung der luftseitigen Stofftransportgrenzschicht zur Untersuchung des Gasaustauschs an einer windbewegten Wasseroberfläche. Hierzu wurde erstmalig eine planare, laserinduzierte Fluoreszenztechnik (PLIF) eingesetzt, womit zeitlich hochaufgelöste vertikale Konzentrationsprofile gewonnen werden können. Dies erlaubt die Untersuchung des Stofftransports von Substanzen die teilweise oder vollständig luftseitig kontrolliert sind, z.B. hinsichtlich des Einflusses der Löslichkeit. Der PLIF Aufbau basiert auf einem gepulsten UV-Laser mit 266 nm Wellenlänge und 20 Pulsen pro Sekunde mit einer Pulsdauer von 6 ns zur Fluoreszenzanregung. Die Aufnahme der Konzentrationsprofile erfolgt mittels einer bildgebenden UV-Optik. Für die Visualisierungsmesstechnik wurde zudem ein optimierter Wind-Wellen-Kanal aufgebaut. Basierend auf einer Literaturrecherche wurde ein Satz von Tracern mit verschiedenen Löslichkeiten ausgewählt. Das PLIF-Signal wurde gemessen und die Tracer hinsichtlich ihrer Signalstärke verglichen. Für eine bestimmte Wind-Wellen-Bedingung wurden die Transfergeschwindigkeit berechnet und der Einfluss der Löslichkeit auf den Gasaustausch ausgewertet. Die Signalstärke von Aceton, Fluorobenzol, Anisol, 4-Fluoranisol, 2,4-Difluoranisol, 2-Fluorphenol und 2-Methoxyphenol erlaubt Aufnahmen von Profilen mit einer Auflösung von 227 um, gemittelt über 2,5 Sekunden. 1,4-Difluorobenzol verfügt über ein Signal stark genug für Einzelpulsmessungen. Das Fluoreszenzsignal von Ethanal und 4-Methylanisol war nicht ausreichend. Die luftseitigen Transfergeschwindigkeiten und der Einfluss der Löslichkeit auf den Transfer konnten jedoch aufgrund von Unsicherheiten durch zu hohe Fluoreszenzdynamik an der Grenzfläche und Mehrfachreflexionen innerhalb der ersten 10 mm nicht abschließend bewertet werden