Population-level dynamics of human pluripotent stem cell fate transitions

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019As células estaminais são células indiferenciadas com a capacidade de auto-renovação e diferenciação em células especializadas, em condições apropriadas. Desempenham funções fundamentais em diversas fases do desenvolvimento, podendo ser totipotentes, pluripotentes, multipotentes e unipotentes. As células estaminais pluripotentes humanas (hPSC), incluindo células estaminais embrionárias humanas (hESC) e células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSC), têm como principais aplicações a descoberta de fármacos, a modelação de doenças e a medicina regenerativa. O desenvolvimento embrionário humano inicia-se com a fusão dos gâmetas masculino e feminino, gerando-se reprogramações epigenéticas, uma série de divisões mitóticas (clivagem), degradação dos transcriptos maternos e ativação do genoma embrionário. De seguida, o embrião sofre compactação e cavitação, passando pelo estágio de mórula, até formar a blástula. A massa celular interna (ICM) do blastocisto diverge entre as células do epiblasto e da endoderme primitiva (hipoblasto), seguindo-se a implantação do blastocisto e gastrulação. Durante a gastrulação as células rearranjam-se, transformando o embrião numa estrutura contendo três camadas germinativas - ectoderme, mesoderme e endoderme. De forma semelhante, muitos métodos de diferenciação in vitro visam o comprometimento de hPSC numa linhagem multipotente, que dará origem ao tipo celular de interesse. Deste modo, a diferenciação de hPSC numa linhagem celular pretendida requer a regulação complexa de diversas vias de sinalização, através de fatores de crescimento, citocinas e pequenas moléculas. Quando as hPSC são induzidas com Wnt, Activina A ou BMP4, estas células formam uma população semelhante à linha primitiva e subsequentemente, a mesoderme ou endoderme. As células da linha primitiva posterior dão origem à mesoderme, seguindo-se a formação da mesoderme cardíaca e dos progenitores cardíacos, os quais geram células diferenciadas. Alternativamente, as células da linha primitiva anterior podem ser induzidas por Activina/Nodal e deste modo formar endoderme definitiva FOXA2+, seguindo-se a formação de hepatoblastos, que irão dar origem a hepatócitos. Caso estas vias não sejam ativas, as hPSC irão diferenciar-se em ectoderme. A diferenciação de hiPSC em neurónios transita através de diversos estadios intermediários. As hiPSC diferenciam-se em progenitores neurais/células estaminais neuroepiteliais que se assemelham às células estaminais neurais (NSC), que formam o tubo neural in vivo. Durante a neurulação in vivo, o tubo neural fecha e formam-se os primeiros tipos de neurónios. O passo correspondente in vitro é a formação de rosetas neurais, que irão dar origem a células da glia e neurónios. A investigação dos mecanismos que regulam as decisões celulares e especificação de sub-populações é fundamental para uma melhor compreensão do desenvolvimento humano embrionário in vivo e sua modelação in vitro. Este conhecimento poderá vir a ser explorado para a medicina regenerativa, modelação de doenças e descoberta de fármacos. No entanto, abordagens sistemáticas para a cultura e diferenciação de células estaminais permanecem pouco desenvolvidas. Esta necessidade tecnológica surgiu como o grande propósito deste estudo, sendo o seu objetivo principal a análise de processos robustos e reprodutíveis para a diferenciação de hPSC. Com este fim, começámos por expandir uma base de dados génica, de modo a abranger o maior número possível de genes associados à especificação de linhagens celulares derivadas de cada uma das três camadas germinativas. De seguida, analisámos as proteínas codificadas pelos genes dessa base de dados aumentada, de modo a identificar quais os processos biológicos e vias de sinalização enriquecidos associados. Ainda, foi possível delinear um percurso representativo do desenvolvimento humano, reconstruindo-se as trajetórias de diferenciação pelas quais as hPSC elaboram sequencialmente uma diversidade de linhas celulares derivadas da neuroectoderme, mesoderme cardíaca e endoderme hepática. Esta abordagem revelou os eventos moleculares sequenciais que regulam o estabelecimento dos três diferentes tipos celulares analisados. Para este estudo desenvolveram-se abordagens de transcriptómica e de modelação de redes, com base nos dados de sequenciação de RNA (RNA-Seq) de células diferenciadas. Esta análise permitiu revelar as vias de sinalização e perfis de expressão génica responsáveis pela indução eficiente de cada uma destas linhagens em diversos pontos temporais. Esta estratégia foi desenvolvida ao nível da expressão global de genes e, posteriormente, com enfoque exclusivo em genes que codificam fatores de transcrição, uma vez que estes controlam uma rede regulatória de programas de expressão génica, despoletando diversas respostas celulares. Deste modo, desenvolveu-se uma análise que incluiu a normalização de dados, visualização de dados de transcriptómica por heatmaps, PCAs (Principal Component Analysis) e diagramas de Venn, e investigação dos processos biológicos e principais vias de sinalização associados à expressão génica. Demonstrou-se que os cardiomiócitos derivados de hiPSC (hiPSC-CM) e os neurónios derivados de hiPSC (hiPSC-Neurons) exibiram uma diferenciação progressiva robusta, quando comparados a tecidos fetais e adultos cardíacos e cerebrais, respetivamente. Deste modo, em termos de expressão génica, os nossos métodos de diferenciação cardíaca e neural revelaram-se bem sucedidos. Realizou-se ainda uma comparação entre os protocolos que estabelecemos para a diferenciação cardíaca e neural com protocolos distintos para a obtenção dos mesmos tipos celulares, embora por intermédio de diferentes linhas celulares, fatores de diferenciação e/ou meios de cultura. Apesar destas diferenças, uma análise de PCA mostrou que os diversos grupos surgiram por ordem cronológica, claramente distinguindo as amostras de diferentes estadios de diferenciação, permitindo definir as trajetórias de linhagens celulares, validando a nossa eficiência de diferenciação. Adicionalmente, foi analisada a expressão de genes que apenas codificam fatores de transcrição, regulando a diferenciação de hiPSC-CM, hiPSC-Neurons e de hepatócitos derivados de hESC. A análise de PCA evidenciou a existência de diferenças consideráveis entre estas três diferenciações, dada a existência de redes génicas distintas a regular linhagens celulares específicas. De seguida, procurou-se identificar os padrões de expressão génica que modulam a especificação progressiva da ectoderme e da mesoderme, bem como os seus principais papéis funcionais. Assim, compararam-se as alterações de expressão génica em fases sequenciais da diferenciação neural e cardíaca, juntamente como uma análise dos genes diferencialmente expressos (DEGs) (Differentially Expressed Genes) no Gene Ontology (GO). Esta abordagem foi desenvolvida tanto a um nível global de expressão de genes, como posteriormente direcionada apenas para genes que codificam fatores de transcrição. Ambas demonstraram diferenças consideráveis entre os DEGs durante a diferenciação em ectoderme comparativamente à diferenciação em mesoderme, em termos de expressão de genes e suas funções associadas, bem como na modulação de vias de sinalização, os quais foram devidamente identificados. Estes resultados permitiram comparar e discriminar as principais alterações de expressão génica e respetivos processos biológicos enriquecidos, durante a transição de um estado de pluripotência para um comprometimento em ectoderme ou mesoderme. Adicionalmente, foi feito um screening de genes que apenas codificam fatores de transcrição em fases comuns da diferenciação em três datasets (hiPSC-Neurons, hiPSC-CM e hepatócitos derivados de hESC). Deste modo, foi possível identificar que fatores de transcrição estão particularmente envolvidos em fases sequenciais da especificação de cada camada germinativa. Para concluir, realizou-se um estudo do perfil de alterações transcripcionais em fases sequenciais, através da comparação de dois datasets de RNA-Seq para cada tipo de diferenciação. Esta estratégia foi utilizada para analisar com maior precisão alterações determinadas e suportadas por ambos os datasets para cada tipo de diferenciação, validando as nossas observações. Apesar das diferenças entres os protocolos de diferenciação e linhas celulares utilizadas, os dois tipos de neurónios diferenciados continuaram a exibir transcriptomas altamente concordantes durante a diferenciação neural, evidenciados por picos específicos de expressão génica que ocorreram aproximadamente nos mesmos pontos temporais da diferenciação, apresentando tendências similares de expressão. O mesmo se observou entre os dois datasets cardíacos que foram analisados. Esta investigação permitiu ainda identificar novos reguladores putativos da cardiogénese (HOXB4, HOXB5, HOXB6 e RARB) e neurogénese (TERF2IP, RFX4 e ZHX1), os quais foram subsequentemente validados por Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Globalmente, os resultados obtidos por qRT-PCR foram concordantes com os dados de RNA-Seq. Adicionalmente, a eficiência da diferenciação cardíaca foi confirmada por citometria de fluxo, validando assim os resultados obtidos por qRT-PCR ao longo da diferenciação. A caracterização transcriptómica efetuada definiu um mapeamento representativo do desenvolvimento da neuroectoderme e mesoderme cardíaca, revelando picos de expressão temporal quer de marcadores específicos de cada linhagem, quer de novos candidatos envolvidos na diferenciação. Estes resultados evidenciaram uma diferenciação eficiente de hPSC nos tipos celulares pretendidos. Em suma, este estudo pretendeu contribuir para a análise de modelos de cultura celular que possam mimetizar a função in vivo, apresentando dados que poderão ser utilizados futuramente na otimização de protocolos de diferenciação. Deste modo, pretendemos fornecer informação importante relativa aos mecanismos que controlam as transições das hPSC, com implicações no conhecimento acerca da diferenciação de células estaminais em diferentes linhagens celulares, na biologia celular e do desenvolvimento, e na medicina regenerativa. Esperamos que esta área de investigação se mantenha altamente dinâmica num futuro próximo.Stem cells are undifferentiated cells with the ability to self-renew and differentiate into specialized cells, under appropriate conditions. During gastrulation cells rearrange themselves transforming the early embryo into a multi-layered structure containing three germ layers, endoderm, mesoderm and ectoderm. Accordingly, pluripotent stem cells (PSC), e.g. embryonic stem cells (ESC) or induced pluripotent stem cells (iPSC), differentiate into cells of all three primitive germ layers. Differentiating stem cells negotiate branching lineage choices, avoiding alternate fates to decisively commit to a single lineage. However, the regulatory mechanisms underlying PSC differentiation into specific lineages remain elusive. Here, we define a representative roadmap for early human development and reconstruct the differentiation trajectories by which pluripotent cells sequentially elaborate diverse neuroectodermal, cardiac mesodermal and hepatic endodermal progeny. Tracking these three-germ layer-derived lineage-choices in vitro uncovers the sequential molecular events that ultimately lead to the establishment of different cell types. Therefore, we provide a comprehensive study through transcriptomic and network modeling approaches, based on RNA-Sequencing data, to investigate the critical changes that may occur during human early cardiogenesis, neurogenesis and hepatogenesis, mimicked by human PSC-derived cardiomyocytes, neurons and hepatocytes. In addition, published datasets were also analysed to cover multiple cellular lineages and construct the developmental trajectories of cells derived from all three germ layers, as well as to identify key lineage specifiers. This paved the way for a deeper understanding of the regulatory mechanisms driving distinct cellular subpopulations present at each differentiation stage. To that aim, we have developed two main approaches, one comprising global gene expression of lineage specifiers and another focusing solely on genes encoding transcription factors, as key regulators of cellular decisions. Interestingly, this transcriptomic analysis allowed us to identify novel key putative regulators of cardiogenesis (HOXB4, HOXB5, HOXB6 and RARB) and neurogenesis (TERF2IP, RFX4 and ZHX1), whose expression results throughout differentiation have been validated by Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction. Collectively, these data provide a starting point to better understand the mechanisms that control human PSC fate transitions, revealing the cellular landscape of human PSC early differentiation. We expect that this knowledge might one day be exploited for developmental cell biology, regenerative medicine, disease modeling and drug discovery applications

Terrorism, Espionage and the Media: Snowden at EC 2017

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Francisco de Zea Bermúdez e alguns aspectos da política externa portuguesa do seu tempo (1828-1824)

Resumen: El presente artículo pretende enumerar algunas perspectivas documentadas sobre la intervención que Francisco de Zea Bermúdez, famoso estadista y diplomático español de la primera mitad del s. XIX, desarrolló en relación a la política externa portuguesa. En Londres y Madrid, mientras era embajador, Presidente del consejo y Ministro de asuntos extranjeros en España, Zea influenció directa e indirectamente en la diplomacia portuguesa de su tiempo, durante la regencia del reinado de D. Miguel (1828-1834). Una de las fuentes privilegiadas utilizadas fue el ministro portugués de los extranjeros de D. Miguel, el vizconde de Santarém, que desempeñó esa función entre marzo de 1828 y agosto de 1833. Palabras clave: Francisco de Zea Bermúdez; vizconde de Santarém; Luís Fernández de Córdoba; política externa portuguesa; miguelismo; carlismo. Abstract: the present article aims to itemize some documented perspectives about the intervention of Francisco de Zea Bermúdez, famous Spanish statesman and diplomat of the first half of the 19th century, regarding Portuguese external politics. In London and Madrid, as ambassador, president of the council of ministers and Foreign Affairs minister of Spain, Zea influenced, both directly and indirectly, the Portuguese diplomacy of his time, during the years of the regency and reign of D. Miguel (1828-1834). One of the main written sources that was used was D. Miguel’s foreign affairs minister, viscount of Santarém, in office between March of 1828 and August of 1833. Key words: Francisco de Zea Bermúdez; viscount of Santarém; Luís Fernández de Córdova; portuguese external politics; miguelist mouvement; carlist mouvement

Les pratiques instrumentales de la musique sacrée portugaise dans son contexte ibérique. XVIe-XVIIe siècles. le ms. 1 du fond Manuel Joaquim (Coimbra)

(INTRODUCTION) Un point de depart: la question de l'a cappella La Musicologie, comme toutes les sciences récentes, est bâtie sur une pluridisciplinarité qui peut comprendre l'analyse des techniques musicales, l'étude paléographique. (musicale. Et littéraire), l'histoire. des civililations, l'histoire de l'art, l'étude littéraire, l'iconographie et même l'architecture. Le croisement de toutes ces perspectives permet. de dessiner une histoire de la Musique qui essaye non seulement de dégager une liste chronologique d'œuvres ct d'auteurs, mais également de déceler l'environnement social, économique et politique qui conditionne la création de chaque moment musical. Cette démarche multidisciplinaire est d'autant plus importante quand l'étude. porte sur les pratiques interprétatves de jadis. En effet, le monde artistique connaît., en particulier à partir de la seconde moitié du XXe siècle, un mouvement de redécou verte des trésors musicaux d'anta.n, régi par des principes interprétatifs qui obéissent à un idéal d'authenticité, c'est-à-dire, ce que l'on a cru, à différents moments de l’histoire, être le jeu musical de nos ancêtres. Or, précisément, la conception de ce qu 'ont pu être les pratiques interprétatives d'autrefois connaît des revirements au fur et à mesure que la. recherche mnusicologique avance. Le. répertoire. sacré est parmi les primiers à faire l'objet dr. cette quête musicale car il est., pendant. une bonne partie de l'histoire de la musique, le seul à se présenter sur un suppor t écrit. Sa création et. sa prat.ique ont lieu dans les principaux centres d'érudition de l'êpoque, les institutions ecclésiastiques et notamment les cathédrales. Voyons donc commnent la pensée rnusicologique, résultat. de l'intersection de différentes disciplines, évolue, dès le XIXe siècle, au sujet de l'idéal interprétatif de la musique sacrée ancienne, en particulier, sur la question de l'a ca.ppella, c'est. à dire, de savoir si son exécut.ion doit ou non comprendre une participation instrumentale. La, musicologie connaît essentiellement trois stades bien distincts en matière de questionnement sur la question de la participation instrumentale dans la musique sacrée: tout d’abord, l'établissement d'une doctrine a cappella durant le XIXe siècle; puis, pendant la première moitié du XXe siècle, une réaction à cette doctrine a cappella; et, vers 1960, le retour à une pratique a cappella aprés une démarche plus scicntifique, axée sur des recherches iconographiques et des archives. La religiosité romantique du XIXe siècle, incarnée dans des mouvements comme celui des Ceciliens, cherche le renouvellement de la musique de l'Église. "Les jugements négatifs fusent à l'égard de la musique sacrée telle qu'elle est pratiquée en Italie durant le XVIIIe siècle. Avant d'être critiques, ces dénigrements sont d'abord réactionnaires" . Les qualités accordées au plainchant (considéré comme la 'vraie' musique de l'Église), - sa simplicité, sa clarté et la tranquillité' apportre -, sont retrouvées dans la polyphonie vocale 'classique', non accompagnée, des compositeurs de la fin du XVc et du XVIe siècles. "[Les] polyphonies de la Renaissance [ont] un sens d'expérience religieuse dont nulle autre musique si ce n'est celle de Bach ou Haendel ne peut. se prôvaloir". Le XIX siècle connaît. ainsi un nombre croissant concerts et d'éditions musicales préconisant un idéal d'exécution de la musique religieuse sans l'interférence 'troublante' de l'instrument musical . C'est la naissance d'une doctrine a cappdla qui reste présente dans le raisonnement musieologique pratiquement jusqu’à nos jours..

Francisco Adolfo de Varnhagen e algumas linhas de força da historiografia potuguesa do seu tempo (1839-1841)

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Polémicas entre Alexander von Humboldt e o visconde de Santarém, 1837-1849

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Guia do estudante online

peerreviewe

Varnhagen, Santarém e Avezac: um episódio da polêmica vespuciana (1842-1858)

 Francisco Adolfo de Varnhagen (1816-1878), the viscount of Santarém (1791-1856) and Marie-Armand d’Avezac de Castera-Macaya (1799-1875) were three historians and geographers who, in the 19th Century, wrote about Amerigo Vespucci and his voyages, about which there are more doubts than certainties up to this day (Which did he narrate and which did he actually take part in). Based on their writings and on some of their correspondence, as well as on later interpretations of their interventions, I will try to contribute to a better knowledge of the vespuciccian controversy, which can be characterized by the theory of eternal recurrence.Francisco Adolfo de Varnhagen (1816-1878), o visconde de Santarém (1791-1856) e Marie-Armand d’Avezac de Castera-Macaya (1799-1875) foram três historiadores e geógrafos que, no século XIX, escreveram acerca de Américo Vespúcio e suas viagens, sobre as quais hoje ainda imperam mais dúvidas que certezas (quais as que narrou e em quais participou). Com base nos escritos e alguma correspondência daqueles autores, bem como de interpretações posteriores das suas intervenções, procurarei contribuir para um maior conhecimento da polêmica vespuciana, a qual pode ser caracterizada pela teoria do eterno retorno.

Pós-graduação em ciências da informação

Este poster apresenta a estrutura curricular do curso de Pós-graduação em Ciências da Informação, em oferta na Universidade Aberta de Portugal. Além de enumerar as UC que compõem o 1º e 2º semestres do 1º ano, dá-se especial ênfase ao 1º trimestre do 2º ano, periodo durante o qual os estudante desenvolvem a sua 'Prática Porfissional'. Os três meses dedicados à Prática Profissional destinam-se ao desenvolvimento de um projeto gizado pelo estudante, sob a orientação de um dos docentes do curso. Este trabalho tem lugar em contexto real, desejavelmente no local de trabalho do próprio estudante e o projeto incidirá numa temática de interesse para o estudante e para a instituição.N/

Francisco Adolfo de Varnhagen e algumas linhas de força da historiografia portuguesa do seu tempo (1839-1841)

With the present article, I intend to contribute to the study of Francisco Adolfo de Varnhagen’s relations with the Portuguese historiographical community, and also to emphasize his personal and intellectual proximity and distance to some of the most relevant names of the Portuguese historiography of the period, such as Cardinal Saraiva, Alexandre Herculano, and the Viscount of Santarem. The study was based on manuscript sources and on Portuguese and Brazilian bibliography. The letter that the Viscount of Santarem wrote to Varnhagen, dated December 8, 1839, is frequently cited as having used, for the first time, the word cartography, which is credited to Santarem. The letter was written during a dispute between the two authors, about some of the characteristics of the cultural studies dedicated to the Portuguese history, both in Paris and Lisbon, and, more importantly, about the work Crónica da Guiné, by Zurara, and the importance of the undiscovered document’s relevance as an instrument of affirmation and prestige for the historian.Com o presente artigo, pretendo contribuir para o estudo das relações de Francisco Adolfo de Varnhagen com o meio historiográfico português, bem como salientar aproximações e distanciamentos pessoais e intelectuais face a figuras cimeiras da historiografia portuguesa coeva, como o Cardeal Saraiva, o visconde de Santarém e Alexandre Herculano. O estudo foi conduzido com base em fontes manuscritas e em bibliografia portuguesa e brasileira. A carta que o visconde de Santarém dirigiu a Varnhagen, datada de 8 de Dezembro de 1839, é frequentemente citada como contendo a primeira referência explícita ao neologismo cartografia, atribuído ao primeiro. Tal missiva foi escrita no âmbito de uma polémica, mantida pelos dois autores, sobre algumas características dos estudos culturais e historiográficos dedicados à história portuguesa, realizados em Paris e Lisboa e sobretudo a propósito da Crónica da Guiné, de Zurara, e da importância do documento inédito relevante como instrumento de afirmação e prestígio do historiador