New algorithms for the analysis of live-cell images acquired in phase contrast microscopy

La détection et la caractérisation automatisée des cellules constituent un enjeu important dans de nombreux domaines de recherche tels que la cicatrisation, le développement de l'embryon et des cellules souches, l’immunologie, l’oncologie, l'ingénierie tissulaire et la découverte de nouveaux médicaments. Étudier le comportement cellulaire in vitro par imagerie des cellules vivantes et par le criblage à haut débit implique des milliers d'images et de vastes quantités de données. Des outils d'analyse automatisés reposant sur la vision numérique et les méthodes non-intrusives telles que la microscopie à contraste de phase (PCM) sont nécessaires. Comme les images PCM sont difficiles à analyser en raison du halo lumineux entourant les cellules et de la difficulté à distinguer les cellules individuelles, le but de ce projet était de développer des algorithmes de traitement d'image PCM dans Matlab® afin d’en tirer de l’information reliée à la morphologie cellulaire de manière automatisée. Pour développer ces algorithmes, des séries d’images de myoblastes acquises en PCM ont été générées, en faisant croître les cellules dans un milieu avec sérum bovin (SSM) ou dans un milieu sans sérum (SFM) sur plusieurs passages. La surface recouverte par les cellules a été estimée en utilisant un filtre de plage de valeurs, un seuil et une taille minimale de coupe afin d'examiner la cinétique de croissance cellulaire. Les résultats ont montré que les cellules avaient des taux de croissance similaires pour les deux milieux de culture, mais que celui-ci diminue de façon linéaire avec le nombre de passages. La méthode de transformée par ondelette continue combinée à l’analyse d'image multivariée (UWT-MIA) a été élaborée afin d’estimer la distribution de caractéristiques morphologiques des cellules (axe majeur, axe mineur, orientation et rondeur). Une analyse multivariée réalisée sur l’ensemble de la base de données (environ 1 million d’images PCM) a montré d'une manière quantitative que les myoblastes cultivés dans le milieu SFM étaient plus allongés et plus petits que ceux cultivés dans le milieu SSM. Les algorithmes développés grâce à ce projet pourraient être utilisés sur d'autres phénotypes cellulaires pour des applications de criblage à haut débit et de contrôle de cultures cellulaires.Automated cell detection and characterization is important in many research fields such as wound healing, embryo development, immune system studies, cancer research, parasite spreading, tissue engineering, stem cell research and drug research and testing. Studying in vitro cellular behavior via live-cell imaging and high-throughput screening involves thousands of images and vast amounts of data, and automated analysis tools relying on machine vision methods and non-intrusive methods such as phase contrast microscopy (PCM) are a necessity. However, there are still some challenges to overcome, since PCM images are difficult to analyze because of the bright halo surrounding the cells and blurry cell-cell boundaries when they are touching. The goal of this project was to develop image processing algorithms to analyze PCM images in an automated fashion, capable of processing large datasets of images to extract information related to cellular viability and morphology. To develop these algorithms, a large dataset of myoblasts images acquired in live-cell imaging (in PCM) was created, growing the cells in either a serum-supplemented (SSM) or a serum-free (SFM) medium over several passages. As a result, algorithms capable of computing the cell-covered surface and cellular morphological features were programmed in Matlab®. The cell-covered surface was estimated using a range filter, a threshold and a minimum cut size in order to look at the cellular growth kinetics. Results showed that the cells were growing at similar paces for both media, but their growth rate was decreasing linearly with passage number. The undecimated wavelet transform multivariate image analysis (UWT-MIA) method was developed, and was used to estimate cellular morphological features distributions (major axis, minor axis, orientation and roundness distributions) on a very large PCM image dataset using the Gabor continuous wavelet transform. Multivariate data analysis performed on the whole database (around 1 million PCM images) showed in a quantitative manner that myoblasts grown in SFM were more elongated and smaller than cells grown in SSM. The algorithms developed through this project could be used in the future on other cellular phenotypes for high-throughput screening and cell culture control applications

Characterization of Microparticles through Digital Holography

In this work, digital holography (DH) is extensively utilized to characterize microparticles. Here, “characterization” refers to the determination of a particle’s shape, size, and, in some cases, its surface structure. A variety of microparticles, such as environmental dust, pollen, volcanic ash, clay, and biological samples, are thoroughly analyzed. In this technique, the microscopically fine interference pattern generated by the coherent superposition of an object and a reference wave fields is digitally recorded using an optoelectronic sensor, in the form of a hologram, and the desired particle property is then computationally extracted by performing a numerical reconstruction to form an image of the particle. The objective of this work is to explore, develop, and demonstrate the feasibility of different experimental arrangements to reconstruct the image of various arbitrary-shaped particles. Both forward- and backward-scattering experimental arrangements are constructed and calibrated to quantify the size of several micron-sized particles. The performance and implications of the technique are validated using the National Institute of Standards and Technology (NIST)-traceable borosilicate glass microspheres of various diameters and a Thorlabs resolution plate. After successful validation and calibration of the system, the resolution limit of the experimental setup is estimated, which is ~10 microns. Particles smaller than 10 microns in size could not be imaged well enough to ensure that what appeared like a single particle was not in fact a cluster. The forward- and backward-scattering holograms of different samples are recorded simultaneously and images of the particles are then computationally reconstructed from these recorded holograms. Our results show that the forward- and backward-scattering images yield different information on the particle surface structure and edge roughness, and thus, reveal more information about a particle profile. This suggests that the two image perspectives reveal aspects of the particle structure not available from a more commonly used forward-scattering based image alone. The results of this work could be supportive to insight more on the particles’ morphology and subsequently important for the advancement of contactree particle characterization technique

Structure-Property Relationships in Aluminum-Copper alloys using Transmission X-Ray Microscopy (TXM) and Micromechanical Testing

abstract: Aluminum alloys are ubiquitously used in almost all structural applications due to their high strength-to-weight ratio. Their superior mechanical performance can be attributed to complex dispersions of nanoscale intermetallic particles that precipitate out from the alloy’s solid solution and offer resistance to deformation. Although they have been extensively investigated in the last century, the traditional approaches employed in the past haven’t rendered an authoritative microstructural understanding in such materials. The effect of the precipitates’ inherent complex morphology and their three-dimensional (3D) spatial distribution on evolution and deformation behavior have often been precluded. In this study, for the first time, synchrotron-based hard X-ray nano-tomography has been implemented in Al-Cu alloys to measure growth kinetics of different nanoscale phases in 3D and reveal mechanistic insights behind some of the observed novel phase transformation reactions occurring at high temperatures. The experimental results were reconciled with coarsening models from the LSW theory to an unprecedented extent, thereby establishing a new paradigm for thermodynamic analysis of precipitate assemblies. By using a unique correlative approach, a non-destructive means of estimating precipitation-strengthening in such alloys has been introduced. Limitations of using existing mechanical strengthening models in such alloys have been discussed and a means to quantify individual contributions from different strengthening mechanisms has been established. The current rapid pace of technological progress necessitates the demand for more resilient and high-performance alloys. To achieve this, a thorough understanding of the relationships between material properties and its structure is indispensable. To establish this correlation and achieve desired properties from structural alloys, microstructural response to mechanical stimuli needs to be understood in three-dimensions (3D). To that effect, in situ tests were conducted at the synchrotron (Advanced Photon Source) using Transmission X-Ray Microscopy as well as in a scanning electron microscope (SEM) to study real-time damage evolution in such alloys. Findings of precipitate size-dependent transition in deformation behavior from these tests have inspired a novel resilient aluminum alloy design.Dissertation/ThesisDoctoral Dissertation Materials Science and Engineering 201

Fabrication and characterization of microstructured scaffolds for complex 3D cell cultures

In einem natürlichen Gewebe wird das zelluläre Verhalten durch Stimuli der Mikroumgebung reguliert. Verschiedene chemische, mechanische und physikalische Reize befinden sich in einem lokalen Milieu und versorgen die Zellen mit einem biologischen Kontext. Im Vergleich zur in vivo Situation, zeigen Standard 2D in vitro Zellkulturmodelle viele Unterschiede in der zellulären Mikroumgebung und können infolgedessen eine Veränderung der Zellantwort verursachen. Die Schaffung einer physiologisch realistischeren Umgebung auf künstlichem Substrat ist ein Schlüsselfaktor für die Entwicklung zuverlässiger Plattformen, die es den kultivierten Zellen ermöglichen, sich natürlicher zu verhalten. Daher sind neuartige Substrate auf Biomaterialbasis mit maßgeschneiderten Eigenschaften sehr gefragt. Die Mikrotechnik ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das bei der Herstellung der Funktionsgerüste hilft, um verschiedene Eigenschaften der in vivo Umgebung zu reproduzieren und auf in vitro Bedingungen zu übertragen. Die Gerüstkonstruktionsparameter können manipuliert werden, um die für das jeweilige Gewebe spezifischen Anforderungen zu erfüllen. Eine der grundlegenden Einschränkungen bei aktuellen Herstellungsverfahren ist jedoch die Unfähigkeit, mehrere Gerüsteigenschaften auf vorgefertigte Weise in eine einzelne Gerüststruktur zu integrieren. Diese Dissertation befasst sich mit Gerüstmikrofabrikations- und Oberflächenmodifikations-techniken, welche die Mikrostrukturierungstechnologie verwenden und die gleichzeitige Kontrolle über verschiedene Gerüsteigenschaften ermöglichen. Diese Ansätze bei der Mikrofabrikation von Polymergerüsten werden verwendet, um physikalische und chemische Eigenschaften bereitzustellen, die für die Leberzellkultur optimiert sind. Die physikochemischen Aspekte, die die zelluläre Mikroumgebung von Lebergewebe in vivo ausmachen, werden diskutiert und anschließend werden relevante Technologien vorgestellt, mit denen einige dieser Aspekte in vitro reguliert werden können. Im ersten Teil dieser Arbeit wird ein neuartiges zweistufiges Verfahren zur Herstellung von Polymergerüsten mit mikroporöser Struktur und definierter Topographie gezeigt. Um 3D-Matrizen mit integrierter Porosität zu erhalten, wurde nach der Herstellung mikroporöser Folien ein Mikrostrukturierungsprozess unter Verwendung der Mehrschicht Polymer-Thermoformtechnologie durchgeführt. Diese Methoden wurden verwendet, um Substrate für die organotypische 3D-Hepatozytenkultivierung herzustellen. Poröse Gerüste mit Mikrokavitäten wurden aus lösungsmittelgegossenen und phasengetrennten Polymilchsäure (PLA) Folien gebildet. Die Proben wurden auf grundlegende mechanische und Oberflächenspezifische Eigenschaften sowie auf die Zellleistung untersucht. Um einen Bezugspunkt für die Bewertung der hergestellten Matrices bereitzustellen, wurden PLA-Gerüste mit zuvor beschriebenen Substraten auf Polycarbonat (PC)-Basis mit ähnlicher Geometrie verglichen. HepG2-Zellen, die in PLA-Gerüsten kultiviert wurden, zeigten eine gewebeartige 3D-Aggregation und eine erhöhte Sekretionsrate von Albumin im Vergleich zu PC-Gerüsten. Anschließend wurde dieses zweistufige Herstellungsverfahren verwendet, um schnell abbaubare Gerüste für die gerüstfreie Zellblatttechnik herzustellen. Gerüste mit kontrollierter Porosität und Topographie, die die Schlüsselmerkmale von Lebersinusoiden nachahmen, wurden aus Poly(milch-co-glykolsäure) (PLGA)-Copolymer hergestellt und für den in vitro Abbau in Zellkultur charakterisiert. Um die Beziehung zwischen dem Abbau des Gerüsts und der Organisation der Zellen in der PLGA-Matrix aufzudecken, wurde die Lebensfähigkeit und Morphologie der kultivierten Zellen zusammen mit der Morphologie des Gerüsts untersucht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden verschiedene technische Lösungen für die gerichtete Strukturierung mikroporöser Polymergerüste bewertet und ihre Eignung zur Erzeugung einer benutzerdefinierten lebenswichtigen oligozellulären Morphologie auf künstlichem Substrat vorgestellt. Besonderes Augenmerk wurde auf das 3D-Mikrokontaktdruckverfahren (3DµCP) gelegt, das die Vorteile des Mikrothermoformens und des Mikrokontaktdrucks kombiniert und eine räumlich-zeitliche Kontrolle über morphologische und chemische Merkmale in einem einzigen Schritt ermöglicht. Um das Potenzial dieser Technik aufzuzeigen, wurden Gerüste mit bestimmten Mikrostrukturen wie Kanäle mit verschiedenen Tiefen und Breiten sowie komplexere Muster hergestellt und verschiedene ECM-Moleküle gleichzeitig in die vordefinierten Geometrien übertragen. Die Gültigkeit des 3DµCP-Prozesses wurde durch mikroskopische Messungen, Fluoreszenzfärbung und Testen der Substrate auf Zelladhäsionsantwort gezeigt. Schließlich wird in dieser Arbeit die Herstellungsmethode zur Erzeugung komplexer Gerüste für die 3D- und gesteuerte Co-Kultivierung von Leberzellen vorgestellt. Polymermatrizen, die die grundlegende Leberarchitektur replizieren und somit eine gut organisierte Leberzellzusammensetzung ermöglichen, wurden erfolgreich unter Verwendung der 3DµCP-Methode hergestellt. Auf der Polycarbonatoberfläche wurden gleichzeitig chemische und topografische Leitfäden in Form sinusförmiger Strukturen strukturiert. Um die 3D-Gewebemikrostruktur zu replizieren, wurden EA.hy926- und HepG2-Zellen auf beiden Seiten des strukturierten porösen Gerüsts Co-kultiviert und anschließend einander gegenüber gestapelt, wodurch zugehörige Kanäle zur Bildung einer Kapillare führen. Das Potenzial unseres 3DµCP-strukturierten Gerüsts für die gerichtete Co-Kultivierung von Zellen wurde unter statischen Zellkulturbedingungen demonstriert. Am Ende wurden Gerüste für die weiteren Anwendungen im perfundierten Bioreaktorsystem angepasst.In a natural tissue, cellular behavior is regulated by microenvironmental stimuli. Different chemical, mechanical and physical cues reside in a local milieu and provide cells with a biological context. Compare to the in vivo situation, standard 2D in vitro cell culture models show many differences in the cellular microenvironment and as a consequence can cause alteration in cellular response. Creating physiologically more realistic environment on artificial substrate is a key factor for development of reliable platforms that enables the cultured cells to behave in a more natural manner. Therefore, novel biomaterial-based substrates with tailored properties are highly demanded. Microtechnology is a powerful tool that helps in the production of the functional scaffolds for reproducing various characteristics of the in vivo environment and transfer them to in vitro conditions. Scaffold design parameters can be manipulated to meet the needs specific to given tissue. However, one of the fundamental limitations in current fabrication methods is the inability to integrate multiple scaffold characteristics within a single scaffold structure in a pre-designed manner. This dissertation discusses scaffold microfabrication and surface modification techniques that use microstructuring technology and allows simultaneous control over various scaffold properties. These approaches in microfabricating polymeric scaffolds are used to provide physical and chemical characteristic those are more optimal for liver cell culture. The physiochemical aspects that constitute the in vivo cellular microenvironment of liver tissue are discussed and subsequently relevant technologies that can be used to regulate some of those aspects in vitro are presented. In the first part this thesis demonstrates a novel two-step procedure for manufacturing polymeric scaffolds with microporous structure and defined topography. To achieve 3D matrixes with integrated porosity, fabrication of microporous foils was followed by microstructuring process using multilayer polymer thermoforming technology. These methods were used to produce substrates for organotypic 3D hepatocyte cultivation. Porous scaffolds with the structure of microcavities were formed from solvent casted and phase separated polylactic acid (PLA) foils. Samples were investigated for basic mechanical and surface properties as well as cellular performance. Moreover, to provide a reference point for the evaluation of produced matrixes, PLA scaffolds were compared to previously reported polycarbonate (PC) based substrates with similar geometry. HepG2 cells cultured within PLA scaffolds showed 3D tissue-like aggregation and enhanced secretion rate of albumin in comparison to PC scaffolds. Subsequently, this two-step fabrication method was used to produce fast degradable scaffolds for scaffold-free cell sheet engineering. Scaffolds with controlled porosity and topography mimicking the key features of liver sinusoids were produced from poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) copolymer and characterized for in vitro degradation in cell culture. To reveal the relationship between degradation of the scaffold and organization of the cells in PLGA matrix, viability and morphology of the cultured cells was examined along with scaffolds morphology. In the second part of this work, various technical solutions for directed patterning of microporous polymer scaffolds were evaluated and their suitability for creating a user-defined vital oligocellular morphology on artificial substrate was presented. Special attention was given to the 3D microcontact printing (3DµCP) method that combines the advantages of microthermoforming and microcontact printing and provides spatiotemporal control over morphological and chemical feature in a single step. To show the potential of this technique, scaffolds with determined microstructures like channels with various depths and widths as well as more complex patterns were fabricated and different ECM molecules were simultaneously transferred inside the predesigned geometries. The validity of 3DµCP process has been demonstrated by microscopic measurements, fluorescence staining and testing the substrates to cell adhesion response. Finally, this thesis presents fabrication method for manufacturing complex scaffolds for 3D and guided co-cultivation of liver cells. Polymer matrixes that replicate basic liver architecture and thus facilitate well-organized hepatic cell composition were successfully produced using the 3DµCP method. Chemical and topographical guidance cues in the form of sinusoidal structures were simultaneously patterned on the polycarbonate surface. To replicate 3D tissue microstructure, EA.hy926 and HepG2 cells were co-cultured on both sides of the patterned porous scaffold and subsequently stacked facing each other by virtue of which associated channels results in the formation of a capillary. The potential of our 3DµCP patterned scaffold for directed co-cultivation of cells was demonstrated under static cell culture conditions. At the end, scaffolds were adapted for the further applications in perfused bioreactor system