Strukturelle Analyse des Enzyms N-Formylmethanofuran:Tetrahydromethanopterin-Formyltransferase

Archaea represent a third domain of life and some archaea exhibit a high degree of tolerance to extreme environmental conditions. Several members are methanogens and present in many anaerobic environments. Most methanogens are able to maintain growth simply on H2 and CO2 via the enzymatically catalyzed reaction 4H2 + CO2 > CH4 + 2 H2O. The archaeon Methanopyrus kandleri grows optimally at temperatures of 84°C to 110°C, pH values of 5.5 to 7.0 and NaCl concentrations 0.2% to 4%. The enzyme N-formylmethanofuran tetrahydromethanopterin formyltransferase (MkFTR) catalyzes the transfer of a formyl group from the cofactor N-formylmethanofuran (FMF) to the cofactor tetrahydromethanopterin (H4MPT), the second step of the above reaction. X-ray crystallographic analysis yielded insights into the structure and function of MkFTR, (1) the MkFTR monomer exhibits a pseudo-two fold structure suggestive of an evolutionary gene duplication. (2) The structure is a D2 homo-tetramer with prominent cleft-like surface features. Analysis of the interface contacts showed that the tetramer is best described as a dimer of dimers. The clefts were associated with the monomer:monomer interface and were weakly occupied by extra electron density which might be attributed to the H4MPT analog folate. (3) This suggested that the clefts are active sites and their association with oligomer interfaces suggested a basis for the dependence of activity on oligomerization. (4) The thermal stability of MkFTR most likely arises from the greater number of H- and ionic-bonds within the monomer and between monomers with respect to mesophilic protein structures. (5) The structure showed a large number of surface exposed negatively charged, glutamate and aspartate residues. These residues explain the salt dependent oligomerization, as only at high enough salt concentration is the electrostatic charge compensated by cation binding and neutralized allowing oligomerization. (6) These residues also improve the solubility of MkFTR at high salt concentration by increased charge repulsion. (7) Comparison of MkFTR structures from low and hight salt conditions showed that surface glutamate residues bind slightly more water molecules at high salt conditions further contributing to MkFTR solubility at high salt concentration.Eine kleine Gruppe von Organismen, die Methanogene, sind fähig, Methan zu erzeugen. Diese Gruppe von Organismen gehört ausschließlich der Domäne der Archaea an. Methanogene sind unter mesophilen, thermophilen, hyperthermophilen und halophilen Archaea vertreten. Das methanogene Archaeon Methanopyrus kandleri wurde in der Umgebung einer hydrothermalen Tiefseequelle entdeckt und wächst optimal bei Temperaturen zwischen 84°C und 110°C und bei pH-Werten von 5,5 bis 7,0 und NaCl-Konzentrationen zwischen 0,2% und 4%. Bis auf wenige Ausnahmen sind Methanogene in der Lage, auf Wasserstoff und Kohlendioxyd als einzigen Energiesubstraten zu wachsen und die Reaktion 4H2 + CO2 > CH4 + 2H2O zu katalysieren. Andere mögliche Substrate sind zum Beispiel Acetat und Methanol. Schritt 2: der Transfer einer Formylgruppe von FMF auf den Folate-ähnlichen Cofaktor Tetrahydromethanopterin (H4MPT) wird von der N-Formylmethanofuran:Tetrahydromethanopterin-Formyltransferase (FTR) durchgeführt. Ziel dieser Arbeit war die kristallografische Aufklärung der Proteinstruktur der FTR aus dem extrem thermophilen und salztoleranten Archaeon Methanopyrus kandleri (MkFTR). Die Bestimmung und die Analyse der Struktur könnte die strukturelle Basis der enzymatischen Aktivität und die Basis der extremen Thermostabilität und Salztoleranz der Enzyme erklären. Erstes Ergebnis dieser Arbeit war der Ausbau der MkFTR- Struktur aus Kristallform P, also PEG8000, als Fällungsmittel. Die Struktur besteht aus vier identischen Ketten pro asymmetrischer Einheit. Die Ketten bilden ein Tetramer mit D2-Symmetrie. Die unterschiedliche Größe der Kontaktfläche zwischen verschiedenen Monomeren lässt das MkFTR-Tetramer eher als ein Dimer von zwei Dimeren bezeichnen. Eine genauere Betrachtung des Monomers führt zu dem Schluss, dass das MkFTR- Monomer trotz fehlender Sequenzhomologie aus zwei Domänen besteht, und dass die beiden Domänen eine ähnliche Faltung haben. Die Domänen konnten mit dem DALI-Server überlagert werden. Dieses Ergebnis deutet eine evolutionäre Genverdoppelung an. Die Oberfläche des MkFTR-Tetramers zeigt vier große, symmetrisch verteilte Spalten. Diese Spalten haben jeweils drei Abzweigungen und liegen zum Teil direkt auf der Grenzfläche zwischen MkFTR-Monomeren. Der Zusammenhang dieser Stellen mit der Grenzfläche zwischen Monomeren verweist auf eine mögliche strukurelle Erklärung des Zusammenhangs zwischen der Aktivität und dem Oligomerzustand des MkFTR-Enzyms. Ein weiteres Indiz dafür, dass die Stellen Substrate-bindend sind, liegt daran, dass eine zusätzliche Elektronendichte in diesen Stellen zu finden war. Die Elektronendichte lässt sich nicht als Wassermoleküle modellieren. Eine mögliche Alternative wäre Folat, vielleicht in Form von Tetrahydro- oder Dihydrofolat. MkFTR könnte dies als Substratanalog zu H4MPT nach der heterologen Proteinproduktion in E. coli binden. Die höhere thermische Stabilität von MkFTR liegt wahrscheinlich an einer höheren Zahl von Wasserstoff- und Ionenbrücken, sowohl innerhalb eines Monomers als auch zwischen den Monomeren. Die Zahl der Ionenbrücken pro Aminosäurerest liegt deutlich höher gegenüber dem Durchschnittswert für mesophile Proteine. Die MkFTR-Struktur zeigt eine große Anzahl an negativ geladenen Resten auf der Moleküloberfläche, die für die höhere Löslichkeit und salzabhängige Thermostabilität der MkFTR verantwortlich sind. Diese Eigenschaft ist auch für die salzabhängige Oligomerisierung der MkFTR verantwortlich, weil die elektrostatische Abstoßung der Monomere erst bei erhöhter Salzkonzentration kompensiert wird, indem sich also an der Oberfläche Kationen anbinden. Die molekulare Basis der Salztoleranz von MkFTR könnte durch den Vergleich von Strukturen erklärt werden, die unter verschiedenen Salzkonzentrationen gelöst werden. Daraufhin wurde die MkFTR bei hoher Salzkonzentration (1% PEG 8000, 1.2M (NH4)2SO4 kristallisiert, Kristallform S und die gelöste Struktur mit der Struktur aus niedriger Salzkonzentration, Kristallform P (22% PEG 8000, 0.3M (NH4)2SO4, verglichen. Die Struktur der MkFTR Kristallform S wurde mittels Molekular-Ersatz (MR) gelöst und verfeinert. Die asymmetrische Einheit enthielt zwei MkFTR Monomere. Weiterhin zeigt der Vergleich der MkFTR Kristallform P- und S-Strukturen, dass Glutamatreste in Kristallform S eine geringfügig höhere Anzahl von Wassermolekülen gegenüber Kristallform P binden, circa 1,5 mal so viele Wassermoleküle pro Glutamat. Die größere Anzahl von gebundenen Wassermolekülen könnte zu der höheren Löslichkeit der MkFTR bei erhöhter Salzkonzentration beitragen. Die zusätzlichen gebundenen Wassermoleküle könnten die Hydrationsschicht des Proteins erweitern und dadurch die hydrophobe Oberfläche effektiv minimieren. Dies würde dazu führen, dass die hydrophobischen Wechselwirkungen, also der “salting-out“-Effekt, reduziert, und die MkFTR-Löslichkeit bei hoher Salzkonzentration erhöht würde

Kinetic stability and temperature adaptation. Observations from a cold adapted subtilisin-like serine protease.

Life on earth is found everywhere where water is found, meaning that life has adapted to extremely varied environments. Thus, protein structures must adapt to a myriad of environmental stressors while maintaining their functional forms. In the case of enzymes, temperature is one of the main evolutionary pressures, affecting both the stability of the structure and the rate of catalysis. One of the solutions Nature has come up with to maintain activity and stability in harsh environments over biological relevant timescales, are kinetically stable proteins. This thesis will outline work carried out on the kinetically stable VPR, a cold active subtilisin-like serine protease and discuss our current understanding of protein kinetic stability, temperature adaptation and our current hypothesis of the molecular interactions contributing to the stability of VPR. The research model that we have used to study these attributes consists of the cold active VPR and its thermostable structural homolog AQUI. The results discussed in this thesis will be on the importance of calcium, the role of prolines in loops, the role of a conserved N-terminal tryptophan residue and lastly primary observations on differences in active site dynamics between VPR and AQUI. A model is proposed of a native structure that unfolds in a highly cooperative manner. This cooperativity can be disrupted, however, by modifying calcium binding of the protein or via mutations that affect how the N-terminus interacts with the rest of the protein. The N-terminus likely acts as a kinetic lock that infers stability to the rest of the structure through many different interactions. Some of these interactions may be strengthened via proline residues, that seemingly act as anchor points that tend to maintain correct orientation between these parts of the protein as thermal energy is increased in the system. Our results give a deeper insight into the nature of the kinetic stability, the importance of cooperativity during unfolding of kinetically stable proteases, synergy between distant parts of the protein through proline mutations and how different calcium binding sites have vastly differing roles. The results provide a solid ground for continuing work in designing enzyme variants with desired stabilities and activities and improve our understanding of kinetically stable systems.The Icelandic Research Fund [grant number 162977-051

53rd National Meeting of the Italian Society of Biochemistryand Molecular Biology (SIB)andNational Meeting of Chemistry of Biological Systems – Italian Chemical Society (SCI - Section CSB)

The 53rd National Congress of the Italian Society of Biochemistry and Molecular Biology (SIB), which will be held in Riccione from 23 to 26 September, is characterised by the elevated scientific level and interdisciplinary interest of the numerous sessions in which it is organised. The Scientific Programme comprises three joint Symposia of the SIB and the Chemistry of Biological Systems section of the Italian Chemistry Society (SCI) on Molecular Systems Biology, Chemistry of Nucleic Acids, Protein and Drug Structure, and Environmental Biotechnology. These Symposia address groundbreaking arguments, making the joint interest of the two societies particularly fascinating; the joint organisation of these events in fact signals the shared intention to proceed along the path of scientific exchange. The topics of the other sessions have been chosen by the Scientific Committee on the basis of their scientific relevance and topicality, with particular attention paid to the selection of the speakers. The SIB sessions will range from Signal Transduction and Biomolecular Targets, Protein Misfolding and its Relationship with Disease, Emerging Techniques in Biochemistry, Gene Silencing, Redox Signalling and Oxidative Stress, Lipids in Cell Communication and Signal Transduction, Mitochondrial Function and Dysfunction

53rd National Meeting of the Italian Society of Biochemistry and Molecular Biology (SIB) and National Meeting of Chemistry of Biological Systems – Italian Chemical Society (SCI - Section CSB)

Il 53° Congresso Nazionale della Società Italiana di Biochimica e Biologia Molecolare che si tiene a Riccione dal 23 al 26 Settembre si distingue per l'alto livello scientifico e l'interesse interdisciplinare delle numerose sessioni nelle quali è strutturato. Il Programma scientifico vede tre Simposi congiunti della SIB con la Sezione della Chimica dei Sistemi Biologici della Società Italiana di Chimica (SCI) su Molecular Systems Biology, Chemistry of Nucleic Acids, Protein and Drug Structure, Environmental Biotechnology. Questi Simposi, riguardano argomenti di avanguardia per i quali fa piacere l'interesse condiviso delle due Società, che per la prima volta organizzano dei Simposi congiunti a significare l'intento di procedere insieme negli scambi scientifici. Gli argomenti delle altre sessioni sono stati scelti dal comitato scientifico in base alla loro rilevanza e attualità scientifica, con particolare cura nella individuazione dei relatori. Le sessioni SIB spazieranno da Signal Transduction and Biomolecular Targets, Protein Misfolding and its Relationship with Diseases, Emerging Techniques in Biochemistry, Gene Silencing, Redox Signalling and Oxidative Stress, Lipids in Cell Communication and Signal Transduction, Mitochondrial Function and Dysfunction

Directed evolution of an organophosphate hydrolase : methyl parathion hydrolase

Organophosphates (OPs) are the most common pesticides used in agriculture. Although they can be broken down in nature, OPs pose a severe health hazard to human due to their inhibitory effect on acetylcholine, a major enzyme in nervous transmission. Therefore, detoxification of water and soil contaminated by OPs is important. One way of achieving this is by bioremediation of sites with OP-degrading enzymes. One such enzyme is methyl parathion hydrolase (MPH) isolated from Pseudomonas sp. WBC-3. MPH is a highly efficient enzyme that is capable of hydrolysing methyl parathion at near diffusion-limited rate. While MPH can hydrolyse a wide range of OPs, the substrate specificity of the enzyme was not well characterised. In order to study MPH, the enzyme was expressed and purified. In the process of MPH protein purification, proteolytic degradation was observed. Various methods, including protein engineering and optimising the purification, were employed to investigate and overcome the degradation. A protocol that allowed rapid purification of MPH was developed so that the proteolysis can be minimised. Due to initial suspicion of autoproteolysis, nickel affinity chromatography was also used in further investigations and autoproteolysis was eventually ruled out. Stability is one of the most important characteristics that define an enzyme's practical use in the industry. For MPH to be an effective bioremediator, it needs to be thermally and chemically stable. Unfortunately, MPH does not have exceptional thermostability and could benefit from extra thermostability. To achieve this, MPH was subjected to directed evolution for enhanced thermostability. In the course of characterising the mutants isolated, it was discovered that MPH expressed in E. coli had lower than expected metal content. It was also found that Zn2+ supplementation prior to activity and stability assay drastically increased the activity and stability of WT MPH. Since the evolution was performed without metal supplementation and the isolated mutant did not have enhanced stability with Zn2+ supplementation, we hypothesised that the mutant isolated was stabilised "metal independently". Another desired characteristic for a bioremediator is the ability to hydrolyse various OPs efficiently. The substrate profile characterisation of WT MPH revealed that while MPH is highly efficient towards methyl parathion, its activity towards other OPs varies. To alter and broaden the substrate specificity of MPH, structure-guided site saturation mutagenesis (SSM) on active site lining residues was performed to obtain mutants with enhanced activity towards ethyl paraoxon. Mutants with modest improvements were isolated and two rounds of DNA shuffling were performed to compound the mutations. The best mutant towards ethyl paraxon exhibited 98-fold increase in kcat/Km. Several other mutants exhibited interesting and respectable changes in their substrate profiles. One mutant with selective activity towards chlorpyrifos class substrates was found. These results highlighted the 'plasticity' of MPH active site that allow efficient hydrolysis of other OPs with only minor changes. In short, progress had been made in purifying MPH and in evolving it to be more stable - although further work is required in this area. Considerable progress had been made in identifying mutations that alter the substrate specificity of MPH

Entkopplung von Wachstum und Überproduktion von Chemikalien in Escherichia coli

Das Metabolic Engineering ermöglicht es, mikrobielle Stämme zu konstruieren, die Chemikalien effektiv überproduzieren. Allerdings nutzen die Produktionsstämme Substrate nicht nur für die Überproduktion von Chemikalien sondern auch um zu wachsen. Also besteht ein trade-off zwischen der Produktion und dem Wachstum, der zu sub-optimaler Produktionsleistung führen kann. Eine Lösung dafür ist die Entkopplung des Zellwachstums von der Überproduktion mittels Zwei-Phasen-Bioprozessen. Nach einer ersten Phase, in der Zellen wachsen ohne zu produzieren, wird das Wachstum in der zweiten Phase gestoppt und die Produktion gestartet. Bei der Kreierung eines Zwei-Phasen-Bioprozesses gibt es zwei zentrale Herausforderungen: (1) Der mikrobielle Stoffwechsel und das Zellwachstum müssen dynamisch kontrolliert werden, um einen Übergang zwischen den beiden Prozess-Phasen zu erzielen. (2) Die Stoffwechselaktivität und Produktionsraten sind in nicht-wachsenden Zellen typischerweise niedrig, was durch genetische Modifikationen korrigiert werden muss. Für beide Herausforderungen ist die genaue Kenntnis über die Metabolitkonzentrationen in den modifizierten Stämmen kritisch, um entscheiden zu können, welche genetischen Modifikationen zum Erfolg führen. Daher werden quantitative und Hochdurchsatz-Massenspektrometrie-Methoden entwickelt, die es ermöglichen Metabolitkonzentrationen in einer großen Anzahl an modifizierten Stämmen in kurzer Zeit zu untersuchen. Eine der schnellsten Methoden ist die flow-injection Massenspektrometrie. In dieser Arbeit untersuchen wir Aspekte der dynamischen Kontrolle des Stoffwechsels und Wachstums, der metabolischen Aktivität in nicht-wachsenden Zellen und der flow-injection Massenspektrometrie. Es ist wichtig all diese Aspekte zu untersuchen, um besser zu verstehen, wie das Zellwachstum und die Überproduktion von Chemikalien entkoppelt werden kann. Das Kapitel 1 dient als Einleitung in das Metabolic Engineering, die Massenspektrometrie-basierte Metabolomik, und Zwei-Phasen-Bioprozessen. Das Kapitel 2 ist ein kurze Abhandlung über metabolische Netzwerke. Die flow-injection Massenspektrometrie (FI-MS) ist eine Metabolomik-Methode, die hunderte Metabolite detektieren kann und Messzeiten im Sekundenbereich hat. Allerdings werden Metabolite vor einer Messung mit FI-MS nicht durch chromatographische Methoden aufgetrennt. Dadurch erreichen alle Metabolite das Massenspektrometer zur gleichen Zeit. Das kann zu negativen Effekten führen, wie zum Beispiel Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle und falschen Annotation. Mit dem Kapitel 3, stellen wir eine systematische Untersuchung von Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle während der Messungen mittels FI-MS vor. Dabei war die Nutzung von 160 authentischen Metabolitstandards, die wir einer Metabolitextrakt-Probe hinzugegeben haben, zentral für unsere Analyse. Mittels einer Netzwerk-Analyse und Informationen über Metabolit-Fragmentierung konnten wir zeigen, dass Metabolit-Modifikationen in der Ionenquelle abundant sind und sogar sequentielle Mehrfachmodifikationen vorkommen. Mit unserem Analyse-Ansatz konnten wir einen großen Anteil dieser Modifikationen erklären. Die hier vorgestellten Daten sind eine wertvolle Ressource und sind hilfreich, um falsche Annotationen zu vermeiden. Temperatur-sensitive Proteine haben Aminosäure-Substitutionen, die eine Aktivität bei niedrigen Temperaturen erlauben. Bei höheren Temperaturen, bei denen Wildtyp-Proteine noch aktiv sind, sind Temperatur-sensitive Proteine hingegen inaktiv. Als Teil dieser Arbeit haben wir untersucht, ob Temperatur-sensitive Proteine als Hilfsmittel für das Metabolic Engineering nützlich sind und eine dynamische Kontrolle des Zellwachstums und Stoffwechsels ermöglichen. Ein Ziel war es Temperatur-sensitive Proteine zu nutzen, um Zwei-Phasen-Bioprozesse zu kreieren. Dadurch, dass es schwierig sein kann Temperatur-sensitive Mutanten zu finden, lag ein Fokus unserer Arbeit auf der Entwicklung von Hochdurchsatzverfahren zur Erzeugung von Temperatur-sensitiven Mutanten. Mit dem Kapitel 4, stellen wir eine Hochdurchsatz-Methode zur Anreicherung von Temperatur-sensitiven Mutanten eines einzelnen essentiellen Genes in Escherichia coli vor. Die Methode verbindet einen Einzelzell-Wachstumsraten-Sensor, der auf einem TIMER-Protein basiert, mit Fluoreszens-aktivierter Zellsortierung. Dies hat es uns ermöglicht, Millionen von Zellen zu screenen und Temperatur-sensitive Mutanten der Argininosuccinat Synthetase ArgG anzureichern. Wir konnten zeigen, dass ArgG ähnlich wie ein Ventil für Stoffwechselwege funktionieren kann, und, dass es uns ermöglicht das Wachstum graduell mittels der Temperatur zu steuern. Gleichzeitig erlaubt es auch die Überproduktion von Citrullin, das das Substrat der ArgG-katalysierten Reaktion ist. Mittels Temperatur-sensitivem ArgG, haben wir einen Zwei-Phasen-Bioprozess kreiert, mit dem innerhalb von 45 Stunden 3 g/L Citrullin in 1 L-Bioreaktoren hergestellt werden konnte. Anschließend zu der Studie über Temperatur-Sensitivität als Hilfsmittel für das Metabolic Engineering, beschreiben wir in Kapitel 5 eine Methode, um Temperatur-sensitive Mutanten in vielen unterschiedlichen Genen zu erzeugen und zu identifizieren. Wir haben eine CRISPR/Cas9-basierte Methode zur Genomeditierung adaptiert und einen angepassten Designansatz genutzt, um eine gepoolte Sammlung von 15.120 E. coli Stämmen zu erzeugen. Jeder dieser Stämme hat eine Mutation, die eine einzelne Aminosäure-Substitution in einem von 346 essentiellen Proteinen hervorruft. In kompetitiven Fitness-Untersuchungen bei zwei unterschiedlichen Temperaturen haben wir die Abundanz einzelner Stämme mit Hilfe von deep sequencing der Plasmid-basierten barcodes verfolgt. Das hat es uns ermöglicht, 1.045 Temperatur-sensitive Kandidaten zu identifizieren. Nachdem wir 92 Stämme isoliert hatten, konnten wir die Funktion von 42 Temperatur-sensitiven Enzymen als metabolische Ventile mittels FI-MS bestätigen. Als letzten Schritt haben wir sieben Temperatur-sensitive Stämme für die Überproduktion von Chemikalien in Zwei-Phasen-Prozessen genutzt. Das enforced ATP wasting (erzwungene ATP-Verschwendung) ist ein vielversprechender Ansatz, um hohe metabolische Aktivitäten während des Wachstum-Stopps zu erzielen. Mit Kapitel 6 stellen wir eine Studie zu dem enforced ATP wasting in E. coli vor. Die Überexpression von ATPase führte unter anaeroben Bedingungen und Stickstofflimitierung zu stark erhöhten Glukose-Aufnahmeraten. Fermentationsprodukte akkumulierten bis die Glukose im Medium erschöpft war. Wir haben an der ersten Studie zum enforced ATP wasting angeknüpft und untersucht, wie der Energiestoffwechsel durch unterschiedliche Expressionsstärken der ATPase beeinflusst wird (Kapitel 7). Mit steigender ATPase-Expressionsstärke stieg auch die Glukose-Aufnahmerate bis zu einem kritischen Punkt. Eine weitere Erhöhung der Expressionsstärke über diesen kritischen Punkt hinweg führte zu einem rapiden Abfall in der Glukose-Aufnahmerate, sogar unter das Niveau eines Wildtyp-Stamms. Wir konnten zeigen, dass dieser Effekt auf ein Enzym in der oberen Glykolyse zurückzuführen ist: die Phosphofructokinase,welcheATP als Substrat hat und die durch ADP allosterisch aktiviert wird. Diese Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis des Energiestoffwechsels in E. coli bei. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse auch, dass enforced ATP wasting sehr effektiv ist, um die Glukose-Aufnahmeraten in nicht-wachsenden Zellen deutlich zu steigern. Das macht enforced ATP wasting zu einem sehr nützlichen Mittel für das Metabolic Engineering