An improved formalism for assigning proteins using nuclear vector replacement framework

Tezin basılısı İstanbul Şehir Üniversitesi Kütüphanesi'ndedir.Proteins are macromolecules in living systems used in crucial functions in all biological processes. In order to understand the function of a protein it is necessary to determine the structure of it. There are various techniques to obtain structural information and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy is one of the most important ones. In this technique, an essential step is the backbone resonance assignment and Structure Based Assignment (SBA) is a method solving this problem with the help of a template structure. NVR is an NMR protein SBA program, that takes as input 15N and HN chemical shifts and unambiguous NOEs, as well as RDCs, HD-exchange and TOCSY data. To run NVR, there is a sequence of steps in obtaining the datales from NMR data and the template structure. In this study, the process of preparing these datales is simpliedandautomatized, whichisanimportantpracticalstepinrunningNVRonnovel proteins. A method to distinguish NH2 peaks from HSQC peaks is generated. Finally, rather than computing a single assignment, an ensemble of assignments is computed. Using this ensemble of assignment results, degree of reliability for individual peak-amino acid assignments is obtained and assignment accuracy is improved. The results show that these improvements bring NVR closer to a tool to be useful and practical tool, able to handle the input data automatically and analyze the reliability of assignments.Declaration of Authorship ii Abstract iii Öz iv Acknowledgments v List of Figures vii List of Tables viii Abbreviations ix 1 Introduction 1 2 Literature Review 6 2.1 Related Work . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2.2 NVR Framework . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.2.1 Mathematical Formulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2.2.2 Template Selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3 Methodology 10 3.1 Automatization of the Data Preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 3.2 Distinguishing NH2 peaks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 3.2.1 Experimental Analysis of Distinguishing NH2 peaks . . . . . . . . 13 3.3 Providing a Measure of Reliability of Assignments . . . . . . . . . . . . . 14 4 Results 17 4.1 Automatization of the Data Preparation Results . . . . . . . . . . . . . . 17 4.1.1 Test Results on Two Novel Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4.2 Distinguishing NH2 peaks Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4.3 Reliability Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 5 Conclusion 21 A NH2 Removal Scores of Randomly Selected Proteins 23 Bibliography 2

Structural basis for sequence specific DNA binding and protein dimerization of HOXA13.

The homeobox gene (HOXA13) codes for a transcription factor protein that binds to AT-rich DNA sequences and controls expression of genes during embryonic morphogenesis. Here we present the NMR structure of HOXA13 homeodomain (A13DBD) bound to an 11-mer DNA duplex. A13DBD forms a dimer that binds to DNA with a dissociation constant of 7.5 nM. The A13DBD/DNA complex has a molar mass of 35 kDa consistent with two molecules of DNA bound at both ends of the A13DBD dimer. A13DBD contains an N-terminal arm (residues 324 - 329) that binds in the DNA minor groove, and a C-terminal helix (residues 362 - 382) that contacts the ATAA nucleotide sequence in the major groove. The N370 side-chain forms hydrogen bonds with the purine base of A5* (base paired with T5). Side-chain methyl groups of V373 form hydrophobic contacts with the pyrimidine methyl groups of T5, T6* and T7*, responsible for recognition of TAA in the DNA core. I366 makes similar methyl contacts with T3* and T4*. Mutants (I366A, N370A and V373G) all have decreased DNA binding and transcriptional activity. Exposed protein residues (R337, K343, and F344) make intermolecular contacts at the protein dimer interface. The mutation F344A weakens protein dimerization and lowers transcriptional activity by 76%. We conclude that the non-conserved residue, V373 is critical for structurally recognizing TAA in the major groove, and that HOXA13 dimerization is required to activate transcription of target genes

Automating the usage of unambiguous noes in nuclear vector replacement for NMR protein structure-based assignments

Proteins perform various functions and tasks in living organisms. The structure of a protein is essential in identifying the protein function. Therefore, determining the protein structure is of upmost importance. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the experimental methods used to determine the protein structure. The key bottleneck in NMR protein structure determination is assigning NMR peaks to corresponding nuclei, which is known as the assignment problem. This assignment process is manually performed in many laboratories. In this thesis, we have developed methodologies and software to automate this process. The Structure Based Assignment (SBA) is an approach to solve this computationally challenging problem by using prior information about the protein that is obtained from a template structure. NVR-BIP is an approach that uses the Nuclear Vector Replacement (NVR) framework to model SBA as a binary integer programming problem. NVR-TS is a tabu search algorithm equipped with a guided perturbation mechanism to handle the proteins with larger residue numbers. NVR-ACO is an ant colony optimization approach that is inspired by the behavior of living ants to minimize peak-nuclei matching cost. One of the input data utilized in these approaches is the Nuclear Overhauser Effect (NOE) data. NOE is an interaction observed between two protons if the protons are located close in space. These protons could be amide protons (HN), protons attached to the alpha-carbon atom in the backbone of the protein (HA), or side chain protons. NVR only uses backbone protons. In the previous approaches using the NVR framework, the proton type was not distinguished in the NOEs and only the HN coordinates were used to incorporate the NOEs into the computation. In this thesis, we fix this problem and use both the HA and HN coordinates and the corresponding distances in our computations. In addition, in the previous studies within this context the distance threshold value for the NOEs was manually tuned for different proteins. However, this limits the application of the methodology for novel proteins. In this thesis we set the threshold value in a standard manner for all proteins by extracting the NOE upper bound distances from the data. Furthermore, for Maltose Binding Protein (MBP), we extract the NOE upper bound distances from the NMR peak intensity values directly and test this protein on real NMR data. We tested our approach on NVR-ACO's data set and compared our new approaches with NVR-BIP, NVR-TS, and NVR-ACO. The experimental results show that the proposed approach improves the assignment accuracies significantly. In particular, we achieved 100% assignment accuracy on EIN and 80% assignment accuracy on MBP proteins as compared to 83% and 73% accuracies, respectively, obtained in the previous approaches

Three-dimensional structure of the weakly associated protein homodimer SeR13 using RDCs and paramagnetic surface mapping

The traditional NMR-based method for determining oligomeric protein structure usually involves distinguishing and assigning intra- and intersubunit NOEs. This task becomes challenging when determining symmetric homo-dimer structures because NOE cross-peaks from a given pair of protons occur at the same position whether intra- or intersubunit in origin. While there are isotope-filtering strategies for distinguishing intra from intermolecular NOE interactions in these cases, they are laborious and often prove ineffectual in cases of weak dimers, where observation of intermolecular NOEs is rare. Here, we present an efficient procedure for weak dimer structure determination based on residual dipolar couplings (RDCs), chemical shift changes upon dilution, and paramagnetic surface perturbations. This procedure is applied to the Northeast Structural Genomics Consortium protein target, SeR13, a negatively charged Staphylococcus epidermidis dimeric protein (Kd 3.4 ± 1.4 mM) composed of 86 amino acids. A structure determination for the monomeric form using traditional NMR methods is presented, followed by a dimer structure determination using docking under orientation constraints from RDCs data, and scoring under residue pair potentials and shape-based predictions of RDCs. Validation using paramagnetic surface perturbation and chemical shift perturbation data acquired on sample dilution is also presented. The general utility of the dimer structure determination procedure and the possible relevance of SeR13 dimer formation are discussed. Published by Wiley-Blackwell. © 2010 The Protein Society

Solution structural analysis of the single-domain parvulin TbPin1

10.1371/journal.pone.0043017PLoS ONE78

\u3cem\u3eIn Vitro\u3c/em\u3e Biosynthesis and Chemical Identification of UDP-\u3cem\u3eN\u3c/em\u3e-acetyl-d-quinovosamine (UDP-d-QuiNAc)

N-acetyl-d-quinovosamine (2-acetamido-2,6-dideoxy-d-glucose, QuiNAc) occurs in the polysaccharide structures of many Gram-negative bacteria. In the biosynthesis of QuiNAc-containing polysaccharides, UDP-QuiNAc is the hypothetical donor of the QuiNAc residue. Biosynthesis of UDP-QuiNAc has been proposed to occur by 4,6-dehydration of UDP-N-acetyl-d-glucosamine (UDP-GlcNAc) to UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-d-xylo-4-hexulose followed by reduction of this 4-keto intermediate to UDP-QuiNAc. Several specific dehydratases are known to catalyze the first proposed step. A specific reductase for the last step has not been demonstrated in vitro, but previous mutant analysis suggested that Rhizobium etli gene wreQ might encode this reductase. Therefore, this gene was cloned and expressed in Escherichia coli, and the resulting His6-tagged WreQ protein was purified. It was tested for 4-reductase activity by adding it and NAD(P)H to reaction mixtures in which 4,6-dehydratase WbpM had acted on the precursor substrate UDP-GlcNAc. Thin layer chromatography of the nucleotide sugars in the mixture at various stages of the reaction showed that WbpM converted UDP-GlcNAc completely to what was shown to be its 4-keto-6-deoxy derivative by NMR and that addition of WreQ and NADH led to formation of a third compound. Combined gas chromatography-mass spectrometry analysis of acid hydrolysates of the final reaction mixture showed that a quinovosamine moiety had been synthesized after WreQ addition. The two-step reaction progress also was monitored in real time by NMR. The final UDP-sugar product after WreQ addition was purified and determined to be UDP-d-QuiNAc by one-dimensional and two-dimensional NMR experiments. These results confirmed that WreQ has UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-d-xylo-4-hexulose 4-reductase activity, completing a pathway for UDP-d-QuiNAc synthesis in vitro

Fluorescence and NMR Studies of the Role of Metal Ions in HIV-1 Genomic RNA Dimerization and Maturation

The dimerization initiation site (DIS) is an essential RNA element responsible for dimerization of HIV-1 genomic RNA through a kissing loop interaction. The DIS loop contains six auto-complementary nucleotides stabilized by 5'- and 3'-flanking purines. NCp7 chaperone protein catalyzes conversion of an intermediate DIS kissing dimer to a more thermodynamically stable extended duplex dimer in the presence of Mg2+. Sequence constructs intended to model the extended duplex, (DIS 21), and the kissing dimer, DIS23(GA)*DIS23(HxUC), were designed to examine the structural information and biochemical behaviors during maturation. We introduced the fluorescent labeling, 2-aminopurine (2-AP) into these RNA constructs, to finely probe structural transition and local dynamics accompanied by the formation of the DIS dimer. The 2-AP nucleotides were inserted either in the DIS loop or junction to study loop-loop interaction or purine base stacking conformation at the junction responding to the metal ion effect. High resolution NMR methods were then used to probe structural changes associated with mono versus divalent cation binding to the DIS dimers and also determine the Mg2+ binding sites. Significant chemical shift perturbations (CSP) were found upon Mg2+ binding and used to map structural changes. Further Mn2+ paramagnetic relaxation enhancement (PRE) experiments provided evidence for specific Mg2+ ion binding are localized around the 5' purine bases in both the extended duplex and kissing dimers with profound line broadening effects. Mapping the CSP and PRE data onto the available X-ray crystal and NMR solution structures allowed localization of specific Mg2+ ions at binding sites on the DIS dimers created by the unpaired flanking DIS loop purine nucleotides. Our data indicates that the conformations that are metal cation dependent. These findings are consistent with previous results that suggested a role for divalent metal cations in stabilizing the DIS kissing dimer structure and influencing its maturation to an extended duplex form through interactions with the DIS loop

NMR STUDIES OF THE GLYCOPROTEIN CYTOPLASMIC TAILS OF HANTAVIRUS AND CRIMEAN CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS

The Bunyaviridae family of viruses is a diverse grouping of approximately 350 members that is present throughout the world. Viruses range from the innocuous to the severely pathogenic and impact not only public health, but crop production and the live-stock industry as well. Collectively, Bunyaviruses represent a serious health and economic risk to not only the United States, but also to Europe, Asia, and Africa. Humans infected by the most pathogenic Bunyaviruses, such as Hantaviruses and Nairoviruses, can have a collection of symptoms that include hemorrhagic fevers, pulmonary edema, severe ecchymosis of the extremities, and in the most serious cases, respiratory failure. Outbreaks of the Hantavirus in the U.S. in 1993 and the Crimean Congo Hemorrhagic Fever virus in Turkey in 2005 have had mortality rates as high as 40%. Bunyaviruses are enveloped anti-sense RNA viruses that contain three genomic segments (Small, Medium, and Large). The M segment produces a glycoprotein precursor that is post-translationally cleaved into a Gn and Gc glycoproteins. Gn and Gc form a heterodimer with the ectodomain representing the surface spike proteins, and the a cytoplasmic domain that extends into the interior of the assembled virus. The Gn cytoplasmic tail in particular is present in a variety of lengths in different Bunyaviruses. Recent studies strongly suggest the Gn tail participates in assembly of the mature virion. Prior to this dissertation, the atomic structure for a Bunyaviridae Gn tail was unknown. This work describes the solution structures of two such cytoplasmic domains in the Andes (Hantavirus) and the Crimean Congo Hemorrhagic Fever virus (Nairovirus), as well as characterize the structure of a third domain from the non-pathogenic Prospect Hill Virus (Hantavirus). As it turns out, a conserved repeating CCHC motif in these domains folds into a unique arrangement of back-to-back ββα type zinc fingers. Whereas classical ββα zinc fingers typically form an extended "beads on a string" arrangement, the Bunyavirus-type zinc fingers form a compact domain in which each zinc finger folds interdependently. Furthermore, while the core zinc finger fold is conserved in different Bunyaviruses, the distribution in the conserved surface electrostatics can vary between genera. Lastly, this work contains preliminary electrophoretic mobility shift assays that suggest that these cytoplasmic zinc finger domains of the Bunyaivurs Gn cytoplasmic tails may contribute to a protein-RNA interaction, thus providing further evidence for a role in binding the ribonucleocapsid complex during assembly. The work presented in this dissertation has expanded our knowledge of the Bunyavirus life cycle by bringing attention to the structure and the function of these conserved Gn cytoplasmic domains. Understanding the behavior of these domains sheds light on critical assembly events that until know have remained largely unknown

Quality assessment of protein NMR structures

Biomolecular NMR structures are now routinely used in biology, chemistry, and bioinformatics. Methods and metrics for assessing the accuracy and precision of protein NMR structures are beginning to be standardized across the biological NMR community. These include both knowledge-based assessment metrics, parameterized from the database of protein structures, and model versus data assessment metrics. On line servers are available that provide comprehensive protein structure quality assessment reports, and efforts are in progress by the world-wide Protein Data Bank (wwPDB) to develop a biomolecular NMR structure quality assessment pipeline as part of the structure deposition process. These quality assessment metrics and standards will aid NMR spectroscopists in determining more accurate structures, and increase the value and utility of these structures for the broad scientific community

New methods for automated NMD data analysis and protein structure determination

Die Ermittlung von Proteinstukturen mittels NMR-Spektroskopie ist ein komplexer Prozess, wobei die Resonanzfrequenzen und die Signalintensitäten den Atomen des Proteins zugeordnet werden. Zur Bestimmung der räumlichen Proteinstruktur sind folgende Schritte erforderlich: die Präparation der Probe und 15N/13C Isotopenanreicherung, Durchführung der NMR Experimente, Prozessierung der Spektren, Bestimmung der Signalresonanzen ('Peak-picking'), Zuordnung der chemischen Verschiebungen, Zuordnung der NOESY-Spektren und das Sammeln von konformationellen Strukturparametern, Strukturrechnung und Strukturverfeinerung. Aktuelle Methoden zur automatischen Strukturrechnung nutzen eine Reihe von Computeralgorithmen, welche Zuordnungen der NOESY-Spektren und die Strukturrechnung durch einen iterativen Prozess verbinden. Obwohl neue Arten von Strukturparametern wie dipolare Kopplungen, Orientierungsinformationen aus kreuzkorrelierten Relaxationsraten oder Strukturinformationen, die sich in Gegenwart paramagnetischer Zentren in Proteinen ergeben, wichtige Neuerungen für die Proteinstrukturrechnung darstellen, sind die Abstandsinformationen aus NOESY-Spektren weiterhin die wichtigste Basis für die NMR-Strukturbestimmung. Der hohe zeitliche Aufwand des 'peak-picking' in NOESY-Spektren ist hauptsächlich bedingt durch spektrale Überlagerung, Rauschsignale und Artefakte in NOESY-Spektren. Daher werden für das effizientere automatische 'Peak-picking' zuverlässige Filter benötigt, um die relevanten Signale auszuwählen. In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Algorithmus für die automatische Proteinstrukturrechnung beschrieben, der automatisches 'Peak-picking' von NOESY-Spektren beinhaltet, die mit Hilfe von Wavelets entrauscht wurden. Der kritische Punkt dieses Algorithmus ist die Erzeugung inkrementeller Peaklisten aus NOESY-Spektren, die mit verschiedenen auf Wavelets basierenden Entrauschungsprozeduren prozessiert wurden. Mit Hilfe entrauschter NOESY-Spektren erhält man Signallisten mit verschiedenen Konfidenzbereichen, die in unterschiedlichen Schritten der kombinierten NOE-Zuordnung/Strukturrechnung eingesetzt werden. Das erste Strukturmodell beruht auf stark entrauschten Spektren, die die konservativste Signalliste mit als weitgehend sicher anzunehmenden Signalen ergeben. In späteren Stadien werden Signallisten aus weniger stark entrauschten Spektren mit einer größeren Anzahl von Signalen verwendet. Die Auswirkung der verschiedenen Entrauschungsprozeduren auf Vollständigkeit und Richtigkeit der NOESY Peaklisten wurde im Detail untersucht. Durch die Kombination von Wavelet-Entrauschung mit einem neuen Algorithmus zur Integration der Signale in Verbindung mit zusätzlichen Filtern, die die Konsistenz der Peakliste prüfen ('Network-anchoring' der Spinsysteme und Symmetrisierung der Peakliste), wird eine schnelle Konvergenz der automatischen Strukturrechnung erreicht. Der neue Algorithmus wurde in ARIA integriert, einem weit verbreiteten Computerprogramm für die automatische NOE-Zuordnung und Strukturrechnung. Der Algorithmus wurde an der Monomereinheit der Polysulfid-Schwefel-Transferase (Sud) aus Wolinella succinogenes verifiziert, deren hochaufgelöste Lösungsstruktur vorher auf konventionelle Weise bestimmt wurde. Neben der Möglichkeit zur Bestimmung von Proteinlösungsstrukturen bietet sich die NMR-Spektroskopie auch als wirkungsvolles Werkzeug zur Untersuchung von Protein-Ligand- und Protein-Protein-Wechselwirkungen an. Sowohl NMR Spektren von isotopenmarkierten Proteinen, als auch die Spektren von Liganden können für das 'Screening' nach Inhibitoren benutzt werden. Im ersten Fall wird die Sensitivität der 1H- und 15N-chemischen Verschiebungen des Proteinrückgrats auf kleine geometrische oder elektrostatische Veränderungen bei der Ligandbindung als Indikator benutzt. Als 'Screening'-Verfahren, bei denen Ligandensignale beobachtet werden, stehen verschiedene Methoden zur Verfügung: Transfer-NOEs, Sättigungstransferdifferenzexperimente (STD, 'saturation transfer difference'), ePHOGSY, diffusionseditierte und NOE-basierende Methoden. Die meisten dieser Techniken können zum rationalen Design von inhibitorischen Verbindungen verwendet werden. Für die Evaluierung von Untersuchungen mit einer großen Anzahl von Inhibitoren werden effiziente Verfahren zur Mustererkennung wie etwa die PCA ('Principal Component Analysis') verwendet. Sie eignet sich zur Visualisierung von Ähnlichkeiten bzw. Unterschieden von Spektren, die mit verschiedenen Inhibitoren aufgenommen wurden. Die experimentellen Daten werden zuvor mit einer Serie von Filtern bearbeitet, die u.a. Artefakte reduzieren, die auf nur kleinen Änderungen der chemischen Verschiebungen beruhen. Der am weitesten verbreitete Filter ist das sogenannte 'bucketing', bei welchem benachbarte Punkte zu einen 'bucket' aufsummiert werden. Um typische Nachteile der 'bucketing'-Prozedur zu vermeiden, wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt der Wavelet-Entrauschung zur Vorbereitung der NMR-Daten für PCA am Beispiel vorhandener Serien von HSQC-Spektren von Proteinen mit verschiedenen Liganden untersucht. Die Kombination von Wavelet-Entrauschung und PCA ist am effizientesten, wenn PCA direkt auf die Wavelet-Koeffizienten angewandt wird. Durch die Abgrenzung ('thresholding') der Wavelet-Koeffizienten in einer Multiskalenanalyse wird eine komprimierte Darstellung der Daten erreicht, welche Rauschartefakte minimiert. Die Kompression ist anders als beim 'bucketing' keine 'blinde' Kompression, sondern an die Eigenschaften der Daten angepasst. Der neue Algorithmus kombiniert die Vorteile einer Datenrepresentation im Wavelet-Raum mit einer Datenvisualisierung durch PCA. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PCA im Wavelet- Raum ein optimiertes 'clustering' erlaubt und dabei typische Artefakte eliminiert werden. Darüberhinaus beschreibt die vorliegende Arbeit eine de novo Strukturbestimmung der periplasmatischen Polysulfid-Schwefel-Transferase (Sud) aus dem anaeroben gram-negativen Bakterium Wolinella succinogenes. Das Sud-Protein ist ein polysulfidbindendes und transferierendes Enzym, das bei niedriger Polysulfidkonzentration eine schnelle Polysulfid-Schwefel-Reduktion katalysiert. Sud ist ein 30 kDa schweres Homodimer, welches keine prosthetischen Gruppen oder schwere Metallionen enthält. Jedes Monomer enhält ein Cystein, welches kovalent bis zu zehn Polysulfid-Schwefel (Sn 2-) Ionen bindet. Es wird vermutet, dass Sud die Polysulfidkette auf ein katalytischen Molybdän-Ion transferiert, welches sich im aktiven Zentrum des membranständigen Enzyms Polysulfid-Reduktase (Psr) auf dessen dem Periplasma zugewandten Seite befindet. Dabei wird eine reduktive Spaltung der Kette katalysiert. Die Lösungsstruktur des Homodimeres Sud wurde mit Hilfe heteronuklearer, mehrdimensionaler NMR-Techniken bestimmt. Die Struktur beruht auf von NOESY-Spektren abgeleiteten Distanzbeschränkungen, Rückgratwasserstoffbindungen und Torsionswinkeln, sowie auf residuellen dipolaren Kopplungen, die für die Verfeinerung der Struktur und für die relative Orientierung der Monomereinheiten wichtig waren. In den NMR Spektren der Homodimere haben alle symmetrieverwandte Kerne äquivalente magnetische Umgebungen, weshalb ihre chemischen Verschiebungen entartet sind. Die symmetrische Entartung vereinfacht das Problem der Resonanzzuordnung, da nur die Hälfte der Kerne zugeordnet werden müssen. Die NOESY-Zuordnung und die Strukturrechnung werden dadurch erschwert, dass es nicht möglich ist, zwischen den Intra-Monomer-, Inter-Monomer- und Co-Monomer- (gemischten) NOESY-Signalen zu unterscheiden. Um das Problem der Symmetrie-Entartung der NOESY-Daten zu lösen, stehen zwei Möglichkeiten zur Verfügung: (I) asymmetrische Markierungs-Experimente, um die intra- von den intermolekularen NOESY-Signalen zu unterscheiden, (II) spezielle Methoden der Strukturrechnung, die mit mehrdeutigen Distanzbeschränkungen arbeiten können. Die in dieser Arbeit vorgestellte Struktur wurde mit Hilfe der Symmetrie-ADR- ('Ambigous Distance Restraints') Methode in Kombination mit Daten von asymetrisch isotopenmarkierten Dimeren berechnet. Die Koordinaten des Sud-Dimers zusammen mit den NMR-basierten Strukturdaten wur- den in der RCSB-Proteindatenbank unter der PDB-Nummer 1QXN abgelegt. Das Sud-Protein zeigt nur wenig Homologie zur Primärsequenz anderer Proteine mit ähnlicher Funktion und bekannter dreidimensionaler Struktur. Bekannte Proteine sind die Schwefeltransferase oder das Rhodanese-Enzym, welche beide den Transfer von einem Schwefelatom eines passenden Donors auf den nukleophilen Akzeptor (z.B von Thiosulfat auf Cyanid) katalysieren. Die dreidimensionalen Strukturen dieser Proteine zeigen eine typische a=b Topologie und haben eine ähnliche Umgebung im aktiven Zentrum bezüglich der Konformation des Proteinrückgrades. Die Schleife im aktiven Zentrum umgibt das katalytische Cystein, welches in allen Rhodanese-Enzymen vorhanden ist, und scheint im Sud-Protein flexibel zu sein (fehlende Resonanzzuordnung der Aminosäuren 89-94). Das Polysulfidende ragt aus einer positiv geladenen Bindungstasche heraus (Reste: R46, R67, K90, R94), wo Sud wahrscheinlich in Kontakt mit der Polysulfidreduktase tritt. Das strukturelle Ergebnis wurde durch Mutageneseexperimente bestätigt. In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass alle Aminosäurereste im aktiven Zentrum essentiell für die Schwefeltransferase-Aktivität des Sud-Proteins sind. Die Substratbindung wurde früher durch den Vergleich von [15N,1H]-TROSY-HSQC-Spektren des Sud-Proteins in An- und Abwesenheit des Polysulfidliganden untersucht. Bei der Substratbindung scheint sich die lokale Geometrie der Polysulfidbindungsstelle und der Dimerschnittstelle zu verändern. Die konformationellen Änderungen und die langsame Dynamik, hervorgerufen durch die Ligandbindung können die weitere Polysulfid-Schwefel-Aktivität auslösen. Ein zweites Polysulfid-Schwefeltransferaseprotein (Str, 40 kDa) mit einer fünffach höheren nativen Konzentration im Vergleich zu Sud wurde im Bakterienperiplasma von Wolinella succinogenes entdeckt. Es wird angenommen, dass beide Protein einen Polysulfid-Schwefel-Komplex bilden, wobei Str wässriges Polysulfid sammelt und an Sud abgibt, welches den Schwefeltransfer zum katalytischen Molybdän-Ion auf das aktive Zentrum der dem Periplasma zugewandten Seite der Polysulfidreduktase durchführt. Änderungen chemischer Verschiebungen in [15N,1H]-TROSY-HSQC-Spektren zeigen, dass ein Polysulfid-Schwefeltransfer zwischen Str und Sud stattfindet. Eine mögliche Protein-Protein-Wechselwirkungsfläche konnte bestimmt werden. In der Abwesenheit des Polysulfidsubstrates wurden keine Wechselwirkungen zwischen Sud und Str beobachtet, was die Vermutung bestätigt, dass beide Proteine nur dann miteinander wechselwirken und den Polysulfid-Schwefeltransfer ermöglichen, wenn als treibende Kraft Polysulfid präsent ist