Ferramentas para comparação genomica

Orientador : João Carlos SetubalTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de ComputaçãoResumo: Com o crescente número de genomas seqüenciados e publicados, surge a necessidade de se analisar as seqüências geradas, com o objetivo de se entender melhor caracterizações funcionais dos organismos estudados, assim como aspectos evolutivos. Um projeto genoma de um organismo, em especial de um procarioto, consiste essencialmente de três grandes fases: o seqüenciamento, a anotação e a análise. A última etapa, por sua vez, consiste na tentativa de se obter uma visão global do genoma a partir da anotação e a partir de outras análises, como por exemplo a comparação com outros genomas. E é nesse contexto, comparação de genomas, que esta tese se insere. Nosso trabalho propõe metodologias para comparação detalhada de dois genomas, tanto no nível de DNA, quanto no de seus genes, assim como a implementação dessas metodologias. O principal objetivo é fornecer ao usuário um conjunto de ferramentas para caracterização funcional do organismo estudado, servindo também como ferramental auxiliar na anotaçãoAbstract: With increasing availability of published genome sequences, we need to analyse them in order to understand functional and evolutionary issues of the organisms. A genome project, in particular for prokaryotes, consists of three main phases: sequencing, annotation and analysis. The last phase consists of getting an overview of the genome from the annotation and other analysis, like comparison to other genomes, for example. This thesis is about genome comparison. We propose methodologies for detailed comparison of two genomes, at the DNA and their genes levels. The main goal is to provide a set of tools for functional characterization of organisms, serving also as an auxiliar tool for annotationDoutoradoDoutor em Ciência da Computaçã

Montagem, anotação e análise comparativa do genoma da bactéria Herbaspirillum lusitanum P6-12

Orientador : Prof. Dr. Leonardo Magalhães CruzCo-orientador : Prof. Dr. Roberto Tadeu RaittzTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/03/2014Inclui referênciasResumo: O Herbaspirillum lusitanum P6-12 foi isolado de nódulos de raiz da planta Phaseolus vulgaris (feijão) em Portugal. O genoma foi obtido através do programa CLCWorkbench utilizando a combinação de leituras de sequências SOLiD e Illumina. Utilizando o programa RAST e posterior revisão manual, a anotação do genoma obteve 4488 genes, cobrindo 87% do genoma, 51 tRNA e um operon ribosomal na ordem 16S rRNA-23S rRNA-5S rRNA. O H. lusitanum P6-12 possui as vias metabólicas Entner-Doudoroff, pentoses fosfato, ácidos tricarboxílicos Embden Meyerhof-Parnas, com exceção da enzima 6-fosfofrutoquinase (EC 2.7.1.11). Não foram encontrados os genes responsáveis pela fixação de nitrogênio, mas foi encontrado o gene que codifica a 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase, relacionada ao desenvolvimento da planta sob condições de estresse. Também foi encontrada a sequência parcial do gene que codifica para a proteína Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (RuBisCO), ligada a fixação do carbono, embora os outros genes desta via não tenham sido identificados. Análises na diferença de cobertura global em relação à cobertura na região do operon, sinalizaram a presença de mais um operon ribosomal. Foram desenvolvidos métodos de tratamento das regiões de gap que permitiram a finalização do draft em 30 supercontigs, totalizando 4.919.496 pb. A análise do gene 16S rRNA confirmou que a espécie de Herbaspirillum sequenciada foi a de H. lusitanum estirpe P6-12. Foram utilizadas duas metodologias de agrupamento para as proteínas, a ligação simples e a ligação completa. Os grupos de genes ortólogos foram determinados como a intersecção entre os três métodos empregados nas análises OrthoMCL, INPARANOID e BBH, identificando 5218 grupos de genes ortólogos entre as 12 espécies estudas: Herbaspirillum sp. JC206, CF444, GW103, YR522, H. seropedicae SmR1, Os45, Os34, AU14040, H. rubrisubalbicans M1, H. frisingense GSF30 e H. huttiense subsp putei 7-2. Dentro dos 5218 grupos de ortólogos, 768 estiveram presentes em todos os genomas e foram definidos como core genoma. As análises filogenéticas baseadas nos grupos ortólogos sinalizaram uma possível classificação das estirpes Herbaspirillum sp. CF444 como Herbaspirillum lusitanum CF444 e Herbaspirillum sp. GW103 como H. huttiense subsp. putei GW103. Palavras-chave: Herbaspirillum lusitanum P6-12, anotação, grupos ortólogos, bioinformática, genômica.Abstract: The Herbaspirillum lusitanum P6 -12 was isolated from root nodules of the Phaseolus vulgaris plant (beans) in Portugal. The genome was assembled in CLCWorkbench program using the combination of SOLiD and Illumina reads. Using the RAST program and subsequent manual review, the genome annotation obtained 4.488 genes, covering 87 % of the genome, 51 tRNA and one ribosomal operon 16S rRNA-23S rRNA-5S rRNA. H. lusitanum P6-12 has the Entner- Doudoroff, pentose phosphate, citric acid and Embden Meyerhof-Parnas metabolic pathways, with the exception of the enzyme 6-phosphofructokinase (EC 2.7.1.11). The presence of genes responsible for nitrogen fixation have not been found, but the gene encoding 1- aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase was present. This gene is related with plant development under stress conditions. Another finding was the partial sequence from the carbon fixation protein, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco). Analysis of the difference in overall genome coverage compared to the operon coverage, showed the presence of another ribosomal operon. Methods of treating regions of gap were developed and allowed the completion of the draft in 30 super-contigs and 4.919.496 bp. The analysis confirmed that the 16S rRNA gene of the species Herbaspirillum lusitanum was sequenced strain P6-12. Orthologous analysis showed the difference in prediction between three methods evaluated, OrthoMCL, INPARANOID and BBH. Two methods of clustering, simple and complet link were used. Groups of orthologous genes were determined as the intersection between the three methods identifying 5218 clusters of orthologous genes among the 12 species studied: Herbaspirillum sp. JC206, CF444, GW103, YR522, H. seropedicae SMR1, Os45, Os34, AU14040, H. rubrisubalbicans M1, H. frisingense GSF30 and H. huttiense subsp. putei 7-2. Within the groups of orthologous, 768 were present in all genomes being defined as core genome. Phylogenetic analysis based on orthologous groups showed a possible classification of Herbaspirillum CF444 as Herbaspirillum lusitanum CF444 and Herbaspirillum GW103 as H. huttiense subsp. putei GW103. Keywords: Herbaspirillum lusitanum P6-12, annotation, orthologous clustering, bioinformatics, genomics

Produção de celulose bacteriana: identificação do Operon bcs e produção de biofilme celulósico por Chromobacterium violaceum

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química.Exopolissacarídeos (EPS) são os principais constituintes de biofilme bacteriano. Esses polímeros, componentes da matriz extracelular bacteriana, têm despertado grande interesse em aplicações industriais e na área médica. Entretanto, têm sido associado com mecanismos de combate bacteriano. A celulose tem sido identificada como um dos EPS da matriz extracelular produzido por várias espécies de bactérias durante a formação de biofilmes. A bactéria Gram-negativa Chromobacterium violaceum, linhagem ATCC 12472, teve seu genoma recentemente seqüenciado pelo Brazilian National Genome Project Consortion. A análise do genoma da C. violaceum mostrou a presença de genes relacionados à biossíntese de celulose, até então desconhecidos. Neste trabalho, analisou-se a estrutura e organização dos genes diretamente envolvidos na biossíntese de celulose, e buscou-se evidências experimentais da presença de celulose na matriz extracelular do biofilme formado por esta bactéria. A metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que exploram informações do seu genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulação, domínios e motivos conservados. Ensaios laboratoriais foram utilizados para se obter evidências experimentais das informações genômicas. Estas estratégias permitiram determinar a existência de um operon que compreende cinco genes estruturais codificando as proteínas e enzimas do complexo celulose sintase, como também propor uma via metabólica de biossíntese de celulose a partir de glicose. Identificaram-se ainda 43 ORFs (open reading frames) com domínio GGDEF normalmente associado à atividade de síntese de diguanilmonofosfato cíclico (c-di-GMP) a partir de duas moléculas de guanosina trifosfato (GTP). A molécula c-di-GMP funciona como um componente regulatório de diversas atividades celulares, entre elas a ativação da síntese de celulose. Experimentalmente foi analisado o produto do biofilme formado durante o cultivo de C. violaceum em meio Luria Bertani (LB), culturas estática e agitada. Os resultados obtidos sugerem a presença de celulose como componente do biofilme

Estudo metabólico da proteína PDP3 de Saccharomyces cerevisiae, cujo domínio PWWP se assemelha ao do oncogene humano NSD3

entre as mulheres. A amplificação da região cromossômica 8p11-12 está presente em 15% dos tumores de mama e desempenha um importante papel na patogênese desta doença. O gene WHSC1L1/NSD3 destaca-se como o principal candidato a oncogene líder dessa região. NSD3 sofre um splicing alternativo, resultando em uma isoforma curta (NSD3c), que possui apenas um domínio PWWP, e uma isoforma longa, que possui um domínio com atividade histona metil transferásica. A superexpressão de NSD3c é capaz de transformar células saudáveis em tumorais. O domínio PWWP está envolvido diretamente na interação com histonas e DNA, estando envolvido na regulação transcricional do DNA. Por identidade de sequência, foi identificada a proteína YLR455W/Pdp3 em Saccharomyces cerevisiae, cujo domínio PWWP é similar ao da NSD3c. A Pdp3 faz parte de um complexo de acetilação de histonas envolvido na regulação da transcrição gênica em levedura. O objetivo deste trabalho foi analisar a semelhança metabólica funcional entre a proteína Pdp3 de S. cerevisiae, produto da ORF YLR455W, e a proteína humana NSD3c através do estudo de características fenotípicas como velocidade de crescimento, perfil respiratório/fermentativo e sensibilidade a espécies reativas de oxigênio. A deleção da Pdp3 causou diminuição da taxa de crescimento acompanhada de um aumento do perfil respiratório e maior resistência a espécies reativas de oxigênio. A cepa de levedura deficiente em Pdp3 mas que superexpressa Pdp3 contendo o domínio PWWP mutado (mutação W21A), apresentou taxa de crescimento, níveis de peroxidação lipídica e consumo de glicose semelhantes aos da cepa deletada, sugerindo que tal domínio é essencial para a função metabólica desempenhada pela Pdp3. Por outro lado, a superexpressão da NSD3c aumentou a taxa de proliferação celular, levando a diminuição do metabolismo oxidativo e aumento da sensibilidade a espécies reativas de oxigênio. Um fenótipo similar foi observado para as mutantes que superexpressam Pdp3 selvagem ou a quimera Pdp3 contendo o domínio PWWP da NSD3c humana. Os resultados indicam que as proteínas Pdp3 de levedura e NSD3c de humanos parecem desempenhar funções semelhantes no metabolismo celular. O resultado obtido com a quimera de Pdp3 mostrou que o domínio PWWP de NSD3 humana substitui funcionalmente o domínio PWWP da proteína de levedura

Exportação de mRNAs do núcleo para o Citoplasma : análise do papel da proteína sub2 em Trypanosoma cruzi e Toxoplasma gondii

Orientadora : Profa. Dra. Andréa Rodrigues ÁvilaCo-orientador : Prof. Dr.Stenio Perdigão FragosoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/04/2014Inclui referênciasÁrea de concentração : Biologia celular e molecularResumo: A doença de Chagas e toxoplasmose são problemas de saúde pública no Brasil e entender com detalhes a biologia dos agentes causais, T. cruzi e T. gondii respectivamente, pode ser um ponto crucial para gerar informações relevantes voltadas para o desenvolvimento de tratamento efetivo no combate a estas doenças. No entanto, a busca de novos alvos para quimioterapia de algumas doenças parasitárias esbarra, por exemplo, na ausência de ferramentas que possibilitem o estudo da função de genes essenciais para a sobrevivência do organismo. Dentro desta problemática, o objetivo central deste estudo é a identificação de proteínas envolvidas no transporte nucleocitoplasmático de RNAs, mais especificamente a exportação de mRNAs, com a utilização de ferramentas de genética reversa para análise de proteínas essenciais envolvidas nestas vias em T. cruzi e T. gondii. Além disso, T. gondii tem sido o modelo de estudo escolhido por diversos grupos, uma vez que dispõe de várias ferramentas de genética reversa consideradas inviáveis ou laboriosas em outros parasitas (como Plasmodium ou Trypanosoma). A escolha do tema foi baseada em dois fatos principais: a) dentro do contexto de eventos moleculares essenciais, o transporte de RNA mensageiro (mRNA) ao local de tradução é uma etapa essencial e crucial na seleção de genes a serem expressos em uma célula eucariótica; b) escassez de publicações envolvendo diversos grupos de parasitas, demonstrando ser um tema da pesquisa básica em parasitologia que necessita ser explorado. Os dados gerados neste estudo permitiram identificar que a maioria das proteínas relacionadas com a exportação de mRNAs não são tão conservadas ao longo da filogenia de eucariotos, principalmente em relação aos protozoários que divergiram na base da árvore filogenética. A exceção encontrada foi Sub2/UAP56, uma proteína relacionada com exportação de mRNAs em fungos e humanos, respectivamente, que se encontra altamente conservada ao longo da filogenia de eucariotos. Em T. cruzi foi observado que TcSub2 é uma proteína nuclear, relacionada com alguns sítios de transcrição por RNA Polimerase II e essencial, não sendo possível obter o nocaute duplo do respectivo gene. Em T. brucei e T. gondii foi observado que a diminuição gradual das proteínas em questão, TbSub2 e TgUAP56 respectivamente, resulta em acúmulo de mRNAs poliadenilados nos núcleos afetando a exportação dos mRNAs e resultando em morte celular. A partir da observação da participação de proteínas ortólogas de Sub2 na exportação de mRNAs em parasitas, a outra parte deste estudo foi identificar proteínas associadas a TcSub2 para iniciar o entendimento sobre esta via bem como verificar a presença de proteínas específicas e provavelmente essenciais de parasitas para futuros estudos funcionais.Abstract: Chagas disease and toxoplasmosis are public health issues in Brazil and understanding in detail the biology of its causative agents, T. cruzi and T. gondii respectively, could generate relevant information to develop effective treatment(s) against these diseases. The search for new chemotherapy targets against parasitic disease faces a number of challenges as the lack of tools that enable the study of essential gene function in parasites. Taking this into consideration, the aim of this study was to develop reverse genetic tools to identify and analyse essential proteins in T. cruzi and T. gondii, in particular those involved in nucleocytoplasmic transport of RNAs, specifically in mRNA export. T. gondii has served as model organism because it has an ample wide repertoire of reverse genetic tools. However, transferring these tools to other parasites, i.e. Plasmodium or Trypanosoma, has not been a straightforward task. The hypothesis of this study was based on two main facts: a) the transport of mRNA to the site of translation, within the context of key molecular events, is an essential step in the selection of genes to be expressed in an eukaryotic cell and b) the lack of publications in this topic in parasites proving to be a subject of basic research in parasitology that needs to be explored. The data obtained in this study showed that most proteins related to the export of mRNAs are not well conserved throughout eukaryotic phylogeny, especially eukaryotes that diverged at the base of the phylogenetic tree, the parasites. An exception to this observation was Sub2/UAP56, a protein directly related to export of mRNAs in yeast and human respectively, which is highly conserved throughout eukaryotic phylogeny. In T. cruzi, TcSub2 is an essential nuclear protein, associated with a number of sites of RNA polymerase II transcription and, a double knockout of the gene is lethal. It has been observed in T. brucei and T. gondii that the knockdown of TbSub2 and TgUAP56 respectively, results in nuclear accumulation of polyadenylated mRNAs, effectively reducing mRNA export and leading to cell death. Extending these observations that highlight the important role of Sub2 orthologues in mRNA export, we aim to identify proteins partners of TcSub2 to better understand this pathway in T. cruzi and verify the presence of specific and likely essential proteins for future studies in this parasite

Estudos estruturais e funcionais da fenilalanina hidroxilase humana

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e TecnologiaA fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) é uma enzima dependente de ferro não-hémico que catalisa a hidroxilação do aminoácido aromático essencial fenilalanina (L-Phe) a tirosina, na presença do cofactor pterínico tetrahidrobiopterina e do oxigénio molecular. Esta enzima faz parte da via metabólica de degradação catabólica da L-Phe proveniente da dieta e é responsável por 75% da sua utilização. A hPAH assume particular importância na saúde humana uma vez que uma deficiente actividade ou expressão proteica, como consequência de mutações no gene que a codifica, é responsável pela doença hereditária conhecida como fenilcetonúria (PKU), a doença mais frequente no metabolismo dos aminoácidos e que apresenta uma incidência na população Caucasiana de 1:10000. O tratamento universalmente aceite e aconselhado consiste numa restrição dietética da L-Phe, o qual deve ser instaurado logo após o nascimento, de modo a evitar o atraso mental severo. No entanto, e devido à dificuldade em aderir ao tratamento dietético novas abordagens terapêuticas, menos restritivas, estão em estudo, nomeadamente a terapia enzimática de reposição. Presentemente, são apenas conhecidas as estruturas cristalinas de formas truncadas da PAH humana e de rato, as quais têm contribuído significativamente para a elucidação do mecanismo catalítico da PAH e para a identificação das bases moleculares da PKU. No entanto, e em parte devido à instabilidade da hPAH, ainda não foi obtida a estrutura tri-dimensional da forma intacta. Neste trabalho, com o objectivo de obter a estrutura completa da hPAH, expressaram-se e purificaram-se duas proteínas quiméricas variantes, hPAH C29S e hPAH E360K, uma vez que apresentam um nível de expressão superior ao da forma selvagem (hPAHwt) o que sugere uma maior estabilidade proteica. A existência destas formas mutantes permitiu ter material de partida para os ensaios de cristalização e estudos de difracção de raios-X. Foram obtidas condições de cristalização para ambos os mutantes que originaram resultados preliminares promissores, importantes para a determinação da estrutura tri-dimensional da forma intacta da hPAH. Procedeu-se ainda à caracterização enzimática das proteínas quiméricas. Curiosamente, apenas a hPAH C29S apresentou um aumento da velocidade máxima da reação (Vmax) e da temperatura de desnaturação (Tm), relativamente à hPAHwt. O conhecimento da estrutura 3D será fundamental para a identificação dos determinantes moleculares dos fenótipos PKU e para uma melhor compreensão do mecanismo catalítico. Adicionalmente, a proteína quimérica C29S mostrou ser uma forte candidata para formulação e utilização no tratamento da PKU por terapia enzimática de reposição

Identificação do complexo exossoma de RNA de Trypanosoma rangeli e caracterização da subunidade associada EAP3

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017.Exossoma de RNA é um complexo multiproteico composto por 12 subunidades, que possui atividade catalítica no sentido 3 ? 5 e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs. As subunidades RRP6 (Ribossomal RNA Processing 6) e RRP44 (Ribossomal RNA Processing 44) são responsáveis pela atividade catalítica e as demais subunidades envolvidas no direcionamento e seleção de transcritos para processamento ou degradação. O Trypanosoma rangeli, juntamente com outros tripanosomatídeos, apresentam deficiência no sistema de regulação de fatores de transcrição, portanto o mecanismo de regulação da expressão gênica nestes organismos ocorre predominantemente a níveis pós-transcricionais através da regulação dos níveis de RNA, sendo esses níveis regulados a partir da degradação dos transcritos. No presente estudo realizamos a caracterização de três subunidades do complexo exossoma de T. rangeli. A subunidade RRP6 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 2.133 pares de base que codifica para um polipeptídio de 710 aminoácidos (± 78,7 kDa). Foram identificados os domínios conservados PMC2NT, DEDD-Y e HRDC, que também se encontram presentes em outros organismos em que o complexo exossoma de RNA está caracterizado. Foi realizado teste de expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém sem sucesso de isolamento. A subunidade RRP44 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 3012 pares de base que codifica para um polipeptídio de 1003 aminoácidos (± 113,2 kDa). Os domínios conservados presentes nesta proteína são PIN, Exoribonuclease R e RNB. Foi realizada a expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém não tivemos sucesso do rendimento da proteína para o posterior etapa de purificação. A subunidade EAP3 (Exosome Associated Protein 3) possui uma janela aberta de leitura de 547 pares de base que codifica para um polipeptídio de 181 aminoácidos (± 20 kDa) e está descrita como uma proteína associada ao exossoma de RNA formando um heterodímero com a subunidade RRP6. Em ensaios de Western blot utilizando o antissoro produzido essa interação in vivo foi comprovada, uma vez que a ligação do anticorpo ocorreu na banda de ±150 kDa. As sequências do complexo exossoma de RNA apresentam porcentagens de identidade altas, demonstrando ser uma maquinaria conservada entre os tripanosomatídeos, porém com sua funcionalidade ainda desconhecida.Abstract : RNA exosome complex is a multiprotein complex composed of 12 subunits, which has 3 '? 5' catalytic activity and is involved in the processing and degradation of several types of RNAs. The subunits RRP6 (Ribosomal RNA Processing 6) and RRP44 (Ribosomal RNA Processing 44) are responsible for the catalytic activity, and the other subunits are involved in the targeting and selection of transcripts for processing or degradation. Trypanosoma rangeli, together with other trypanosomatids, are deficient in the regulation system of transcription factors, so the regulation mechanism of gene expression in these organisms occurs exclusively at post-transcriptional levels through of RNA levels regulation, these levels being regulated from the degradation of the transcripts. In the present study we performed the characterization of subunits of the T. rangeli exosome complex. The RRP6 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 2,133 base pairs coding for a polypeptide of 710 amino acids (± 78.7 kDa). The conserved domains identified was PMC2NT, DEDD-Y and HRDC, which are also present in other organisms in which the RNA exosome complex is characterized, have been identified. A heterologous expression test of this protein was performed in E. coli BL21 CodonPlus, but with no success of isolation. The RRP44 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 3012 base pairs encoding a polypeptide of 1003 amino acids (± 113.2 kDa). The conserved domains present in this protein are PIN, Exoribonuclease R and RNB. The heterologous expression of this protein was performed in E. coli BL21 Codon Plus, but we did not have a success of protein yield for the subsequent protein purification process. The EAP3 (Exosome Associated Protein 3) subunit has an open reading frame of 547 base pairs encoding a polypeptide of 181 amino acid (± 20 kDa) and is described as a protein associated with the RNA exosome forming a heterodimer with the subunit RRP6. In Western Blotting assays using the antiserum produced from purified protein this in vivo interaction was proven, since antibody binding occurred in the ~ 150 kDa band, which corresponds to the sum of the proteins. The sequences of the RNA exosome complex have high identity percentages, demonstrating that it is a conserved machinery among the trypanosomatids, but with its still unknown functionality

Estudos sobre o envolvimento de clag9 (cytoadherence linked asexual gene) durante a remodelação do eritrócito infectado com Plasmodium falciparum e sua participação no desenvolvimento da imunidade em malária

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Doutorado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Luiz Hildebrando Pereira da SilvaNo presente estudo foi avaliado possível papel indireto do PfCLAG9 na citoaderência e a participação como alvo imunológico. Foram analisadas amostras de parasitos de P. falciparum isolados de pacientes da região de Porto Velho, Rondônia, Amazônia Ocidental Brasileira, os quais foram submetidos a ciclos sucessivos de panning para os receptores endoteliais. O experimento consistiu de sequenciar, comparar a expressão relativa do gene Pfclag 9 utilizando o método da PCR em tempo real e ensaios de imunodetecção. Foram desenhados peptídeos sintéticos de diferentes regiões da proteína CLAG9, avaliadas a antigenicidade em soros dos pacientes sintomáticos e assintomáticos com Plasmodium sp. Os isolados de pacientes com P. falciparum, P3, P5 e P59 e suas linhagens selecionadas com especificidade para os receptores CHO CSA-K1, CHO CD36, CHO ICAM-1, não demonstraram uma variação na expressão do gene Pfclag9 quando comparados com os genes normalizadores. A região sequenciada demonstrou similaridade de 100%, quando comparadas com a cepa de referência 3D7. Na análise sorológica realizada com os peptídeos sintéticos foi observada uma maior reatividade em soros de portadores assintomáticos e confirmados os estudos realizados Papua-Nova Guiné e na Colômbia. Surpreendentemente, os portadores assintomáticos com parasitos de P. vivax, também demonstraram um elevado grau de reatividade cruzada contra os mesmos peptídeos de P. falciparum. A análise nos bancos de antígenos por bioinformática demonstrou um elevado grau de similaridade entre as sequências de PfCLAG9 e PvCLAG7 (84%). Paralelamente, os anti-soros policlonais de BALB/c interagiram com os parasitos de vivax e falciparum. O resultado reforça a proposta de PvCLAG7 como ortólogo de PfCLAG9 e pode sugerir o mesmo papel funcional para ambas as proteínas. Isso suscita a hipótese de que eles podem estar envolvidos na regulação da densidade populacional durante a infecção mista exercida pela resposta immune do hospedeiro, além de provavelmente desempenhar funções importantes em ambas às espécies do parasito

Estudo dos genes envolvidos na defesa antioxidante de tripanosomatídeos e caracterização molecular e funcional das enzimas tripanotiona redutase e triparedoxina peroxidase em Trypanosoma rangeli

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado pertencente à Ordem Kinetoplastea, grupo ancestral de protistas que contém grande diversidade de espécies, entre elas organismos de vida livre e parasitos com distintos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo. Um dos objetivos deste trabalho foi caracterizar in silico enzimas envolvidas direta ou indiretamente na defesa antioxidante de T. rangeli, além de compará-las a suas ortólogas junto a diferentes espécies de Kinetoplastídeos. Dos genes analisados, não foram identificados em T. rangeli: cisteína sintase, ornitina decarboxilase, glutamilespermidina sintase e ascorbato peroxidase, embora o primeiro e o último tenham sido identificados como pseudogenes. Todos os genes foram identificados em Bodo saltans, sugerindo que os mecanismos antioxidantes evoluíram antes do aparecimento do parasitismo nesse grupo. De forma geral, observou-se que a variabilidade de enzimas no sistema antioxidante a nível genômico entre tripanosomatídeos relaciona-se a adaptações específicas ao parasitismo em ampla gama de hospedeiros e sua transmissão pelos vetores e não somente ao isolamento geográfico. Entre as enzimas analisadas, duas destacam-se em relação a infectividade e virulência em tripanosomatídeos patogênicos, a tripanotiona redutase (TRed) e triparedoxina peroxidase em suas isoformas citosólica (TRPxcit) e mitocondrial (TRPxmit). O gene da TrTRed possui uma ORF de 1.473 pb (~490 aa/ 53 kDa) estando presente em cópia única no genoma haploide de T. rangeli. A análise da proteína predita da TrTRed revelou a presença de dois domínios relacionados à ação oxidoredutase. O gene da TrTRPxcit apresentou-se com 549 pb gerando uma proteína com 182 aminoácidos (~ 20 kDa), enquanto para TrTRPxmit a ORF possui 681pb que prediz uma sequência de 266 aminoácidos (~25 kDa). A análise das sequências aminoacídicas deduzidas da TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou a presença dos domínios VCP e ICP, respectivamente, além das cisteínas peroxidásica (Cp) e de resolução (Cr). A análise da expressão gênica e proteíca de TrTREd, TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou ausência de expressão significativa estágio-específica, porém a espressão da TRed é significativamente maior em T. cruzi do que em T. rangeli. O estresse oxidativo gerado pela adição de H2O2 não induziu alterações significativas na expressão de nenhuma proteína analisada. A presença de antioxidantes como N-acetilcisteína (NAC) e glutationa reduzida (GSH) no meio induziu a proliferação de epimastigotas in vitro, mas não alterou o perfil de expressão da TrTRed ao longo do tempo. A síntese de NADPH foi reduzida e a produção endógena de H2O2 é maior em T. rangeli quando comparada a T. cruzi. Estudos enzimáticos em extratos de T. rangeli mostraram maior atividade da TRed em epimastigotas do que em tripomastigotas. A superexpressão da proteína TrTRed não influenciou o crescimento ou o processo de diferenciação em tripomastigotas in vitro e os parasitos transfectados (TRed+) mostraram aumento na resistência ao estresse induzido pelo H2O2. Conclui-se que o T. rangeli apresenta uma maquinaria de defesa antioxidante semelhante ao T. brucei e ao T. cruzi em função de presença/ausência de genes e quanto à similaridade nas sequências, respectivamente. Além disso, a TrTRed parece não ser a principal envolvida na resposta do T. rangeli ao ambiente oxidante em células do hospedeiro vertebrado, mas possui papel crucial durante a infecção do hospedeiro invertebrado.Abstract : Trypanosoma rangeli belongs to the Order Kinetoplastea, an ancestral group of protists containing a variety of free-living and parasitic species with distinct mechanisms of antioxidant defence. In this study we have characterized in silico the enzymes directly or indirectly involved on the T. rangeli response t oxidative stress and to comparatively characterize to its orthologs on other kinetoplastids. Ornithine decarboxylase, glutamyl spermidin synthase were not found on the T. rangeli genome while cysteine synthase and ascorbate peroxidase were found as pseudogenes. Since all genes related to antioxidant defence were found on Bodo saltans we hypothesize that such mechanism has evolved prior the parasitic lifestyle. As a rule, we have observed that genomic variability among the antioxidant system genes from trypanosomatids are related to specific adaptations to a parasitic lifestyle between distinct hosts and vectors instead of geographical isolation. Among the studied enzymes, the trypanotion reductase (TRed) and the cytosolic (TRPxcit) and mitochondrial (TRPxmit) forms of tryparedoxin peroxidase are related to virulence and infectivity. The T. rangeli TRed (TrTRed) is a singe-copy gene and has an ORF of 1.473 bp (~490 aa/ 53 kDa) and the predicted TrTRed proteins revealed two oxidoreductase-related domains. The TrTRPxcit gene is 549 bp long coding to a 182 aa protein (~ 20 kDa) while the TrTRPxmit is 681 bp long, predicting to 266 aa protein (~25 kDa). Both TrTRPxcit and TrTRPxmit proteins revealed the presence of the VCP and ICP domains, respectively, along the peroxidatic cysteine (Cp) and resolving cysteine (Cr). The transcription and expression profiles of TrTREd, TrTRPxcit and TrTRPxmit revealed the no stage-specific differences, but was significatly higher in T. cruzi than T. rangeli. No differences on expression were observed for any of the analyzed genes when parasites were exposed to an H2O2-induced stress. Addition of antioxidants such as NAC and GSH on the culture media induced proliferation of epimastigotes in vitro, not altering the TrTRed expression overtime. NADPH generation is lower and production of endogenous H2O2 is higher in T. rangeli Choachí strain than in T. cruzi Y strain epimastigotes. Enzymatic assays revealed an increased activity of TRed on T. rangeli epimastigotes than trypomastigotes. Overexpression of TrTRed has no influence on the growth or on the in vitro differentiation to trypomastigotes, but transfectants revealed an increased resistance to a H2O2-induced stress. Based on the presence/absence of genes and on the sequence similarity, the T. rangeli antioxidant machinery is related to T. brucei and to T. cruzi, respectively. Also, TrTRed seems not to be the main enzyme involved on the T. rangeli response to the oxidative stress on the mamalian host, but having crucial relevance on the infection of the insect vectors

Genômica do X-frágil: elementos de regulação do Gene FMR1

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2008.A Síndrome do X Frágil (SXF) é a forma de retardo mental herdado mais comum encontrada, afetando um entre 4000 homens e uma entre 8000 mulheres. Ela é causada devido a alterações do nível de transcrição e tradução do gene FMR1, que nos humanos e em vários outros mamíferos se encontra na região Xq27.3 do cromossomo X humano. Este gene codifica a proteína FMRP, cuja falta de expressão está associada ao retardo mental e a outros fenótipos característicos da SXF. A função da proteína FMRP no organismo ainda não é totalmente conhecida, porém acredita-se que ela esteja intimamente ligada ao transporte de mRNA do núcleo para o citoplasma dos neurônios e na sua condução até os ribossomos, onde faz parte dos complexos de ribonucleoproteínas (RNP) e controla a tradução de determinados mRNA. Diante deste contexto, este trabalho tem o objetivo de contribuir para a compreensão dos elementos reguladores da expressão do gene FMR1 e também incrementar os estudos sobre as funções desempenhadas pela proteína FMRP. Uma análise da região à montante do códon de início do gene FMR1, utilizando técnicas de genômica comparativa, gel shift e espectrometria de massa mostrou potenciais sítios de interação para proteínas de transcrição. Foram identificadas várias proteínas que interagiram com os segmentos de DNA conservados estudados in vitro, com especial significância para as proteínas Pur-a, Pur-b e as ribonucleoproteínas heterogêneas A2/B1 (hnRNP A2/hnRNP B1). O papel da Pur-a e Pur-b como elemento na regulação da transcrição do gene FMR1 nunca foi demonstrado, sendo esse o primeiro trabalho que propõe esta relação. No estudo sobre a função da proteína FMRP utilizou-se análise de fluxos metabólicos para calcular os fluxos intracelulares dos complexos envolvidos na regulação da tradução de mRNA nos dendritos neuronais, onde a FMRP é uma proteína chave. O uso de modelos estequiométricos das reações ou interações e a aplicação de balanços de massa permitiram a estimativa de alguns fluxos importantes no papel biológico da FMRP em nível celular. Esses resultados poderão auxiliar no diagnóstico e tratamento da Síndrome do X-Frágil e doenças relacionadas.Fragile X Syndrome (FXS) is the most common form of inherited mental retardation with the incidence of 1:4000 in males and 1:8000 in females. The syndrome occurs as an effect of the lack of expression of the fragile X mental retardation protein (FMRP) codified by the FMR1 gene located in the q27.3 region of the X chromosome. Absence of the FMRP results in mental retardation and other characteristics of the Fragile X phenotypes. Some FMRP functions in the organism are still unknown; however, structural evidences of the protein suggest that it is involved in nuclear export, cytoplasmic transport, and/or translation control of target mRNA. In this work, we combined in silico comparative genomics tools with proteomic analysis to investigate regulatory elements in the upstream region of the FMR1 gene transcription start site. We identified proteins that interact with studied DNA conserved sequences, particularly Pur-a, Pur-b and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 (hnRNP A2/hnRNP B1). To our acknowledge this is the first work that correlate those proteins to the FMR1 gene transcription. We used Metabolic Flux Analysis (MFA) to estimate turnovers of molecules and complexes involved in mRNA transport to dendrites and its translation at synapses. Stoichiometric models of biochemical reactions or interactions and mass balances may be useful in diagnosis and future treatment of the Fragile X Syndrome and related diseases