Probing entry inhibitors' activity on HIV and development of new fusion inhibitors : integrating evolutionary biology with virology

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011The general aims of this thesis were: 1) to examine the C2, V3 and C3 envelope regions ofHIV-1 and HIV-2 at the molecular, evolutionary and structural levels; 2) to compare HIV-1and HIV-2 susceptibility to entry inhibitors and assess their potential value in HIV-2therapy; 3) to produce a new fusion inhibitor peptide using evolutionary biology basedstrategies.In the first study (Chapter 2), HIV-1 and HIV-2 were compared at the molecular,evolutionary and structural levels in the C2, V3 and C3 envelope regions. We identifiedsignificant structural and functional constrains to the diversification and evolution of C2,V3 and C3 in the HIV-2 envelope but not in HIV-1. In particular, we found that V3 in HIV-2is less exposed and more conserved than in HIV-1, suggesting fundamental differences inthe biology and infection of these viruses as well as in their susceptibility to entryinhibitors.In the second study (Chapter 3) we measured the baseline susceptibility of HIV-1 and HIV-2primary isolates to different fusion inhibitors and coreceptor antagonists, includingenfuvirtide (T-20) and maraviroc (MVC). MVC inhibited HIV-2 R5 variants at significantlyhigher IC90 concentrations than HIV-1 variants. Moreover, as previously found in HIV-1,susceptibility of HIV-2 R5 variants to MVC was inversely related with CD4+ T cell counts attime of virus isolation. These results suggest that the structure of the envelope complex ofR5 variants changes along the course of infection. More importantly, the results call fornew clinical studies to evaluate the efficacy of MVC in HIV-2 infection and to determine itsbest therapeutic dosage in early and late stage disease. We also provide definitiveevidence demonstrating that T-20 is not useful for HIV-2 therapy.In the final study (Chapter 4), we designed a new HIV fusion inhibitor peptide (P3) basedon the ancestral sequences of the HIV-2 and SIV envelope genes. P3 has an a-helixstructure as demonstrated by circular dichroism. It has broad antiviral activity at thenanomolar range against HIV-1 and HIV-2 primary isolates, including HIV-1 variantsresistant to T-20. Binding ELISA assays and selection of resistant mutants suggest that P3prevents viral fusion by binding to the transmembrane protein in the HR1 region. Thesestudies provide proof of concept that viable antiviral peptides can be constructed usingevolutionary biology strategies. Such strategies should be explored to enhance theproduction of peptide drugs and vaccines.O Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1 e do tipo 2 (VIH-1 e VIH-2) são os agentes etiológicos do Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Embora sejam semelhantes na sua organização estrutural e genómica, estes lentivírus humanos apresentam características antigénicas distintas e partilham uma semelhança genética de apenas 50%. Enquanto o VIH-1 é responsável pela pandemia mundial, a infecção pelo VIH-2 localiza-se sobretudo na África Ocidental, em alguns países europeus como Portugal e França, e na Índia. A infecção pelo VIH-2 tem melhor prognóstico, a progressão para a doença é mais lenta e há melhor controlo imunológico do que na infecção pelo VIH-1. Ao contrário do VIH-1, o arsenal terapêutico actualmente disponível para tratar a infecção por VIH-2 é reduzido. Os fármacos antiretrovirais em uso foram especificamente desenvolvidos para o VIH-1 e, consequentemente, a sua actividade pode ser reduzida ou nula no VIH-2. Este é o caso concreto dos inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa e de alguns inibidores da protease. Neste contexto, os inibidores de entrada poderão ser úteis para tratar a infecção por VIH-2. Contudo, a susceptibilidade dos isolados primários de VIH-2 aos inibidores de entrada é actualmente desconhecida. A susceptibilidade do VIH aos inibidores de entrada é determinada pela qualidade da interacção do vírus com os receptores celulares. O VIH-1 e VIH-2 são substancialmente diferentes a este nível. Por exemplo, o VIH-2 pode ligar-se ao co-receptor CCR5 independentemente do receptor CD4 e da região V3 do invólucro. Por outro lado, as regiões C2, V3 e C3 do VIH-2 são substancialmente diferentes do VIH-1 a nível antigénico. Colectivamente, estes dados indicam que a estrutura e conformação das glicoproteínas de superfície do VIH-1 e VIH-2 são substancialmente diferentes e sugerem que a susceptibilidade e resistência dos dois tipos de vírus aos inibidores de entrada podem também ser diferentes. Os principais objectivos desta tese foram: 1) analisar as características moleculares, estruturais e evolutivas das regiões C2, V3 e C3 no VIH-1 e VIH-2; 2) comparar a susceptibilidade do VIH-1 e VIH-2 aos inibidores de entrada e avaliar o seu potencial terapêutico na infecção por VIH-2; 3) produzir um novo inibidor de fusão para o VIH-2. Para melhor compreender as potenciais diferenças destes dois vírus na resposta aos inibidores de entrada começámos por analisar as características moleculares, estruturais e evolutivas da região V3 e as regiões circundantes C2 e C3, num número significativo de vírus VIH-1 e VIH-2 isolados em Portugal e noutras regiões do globo, com recurso a diferentes metodologias de biologia evolutiva e computacional (Capitulo 2). Apesar da menor variabilidade das 3 regiões no VIH-2, verificámos que a região C3 está sob forte selecção positiva e encontra-se exposta à superfície sugerindo que, tal como no VIH-1, esta região poderá constituir um domínio neutralizante. No entanto, ao contrário do VIH-1, a maioria das mutações adaptativas no VIH-2 são prejudiciais e levam à extinção das linhagens virais pelo que o efeito final é um forte constrangimento à variabilidade das regiões analisadas. Ao contrário do VIH-1, verificámos que a ansa V3 do VIH-2 se encontra oclusa no complexo glicoproteico do invólucro, numa conformação que parece ser estabilizada por interacções que mantém com alguns resíduos da regiões C2 e C3. Estes resultados são consistentes com o facto de a V3 não ser imunodominante no VIH-2, ficando assim mais protegida da resposta imunitária e das eventuais mutações que dela resultam. A forte conservação da V3, da C2 e da C3 também é consistente com a sua potencialmente importante actividade imunosupressora. Em conclusão, este primeiro estudo permitiu caracterizar algumas das características estruturais e funcionais que distinguem as glicoproteínas do invólucro do VIH-1 e do VIH-2 e que estão associadas às diferentes características biológicas e fenotípicas destes dois vírus. Estes dados podem ter impacto na resposta dos dois vírus aos inibidores de entrada (analisado no Capítulo 3) e no desenvolvimento de novas vacinas. No segundo estudo (Capítulo 3) comparámos a actividade antiviral dos antagonistas dos coreceptores (AMD3100, TAK-779 e maraviroc) e dos inibidores de fusão (T-20 e T-1249) entre um grupo de 20 isolados de VIH-2 (19 isolados primários + um isolado laboratorial) e nove isolados de VIH-1 (sete isolados primários + dois isolados laboratoriais). Verificámos que a sensibilidade ao AMD3100 e ao TAK-779 é semelhante no VIH-1 e o VIH-2. No entanto, o perfil da curva dose-resposta do maraviroc (MVC) obtido para os isolados R5 foi diferente nos dois tipos de vírus. No VIH-2 os valores de IC90 foram significativamente mais elevados do que no VIH-1; por outro lado, os declives da curva dose-resposta foram mais baixos no VIH-2 do que no VIH-1. Colectivamente, estes resultados sugerem que poderão ser necessárias concentrações mais elevadas de MVC para tratar os doentes infectados pelo VIH-2. Adicionalmente, encontrámos uma correlação forte e de sentido inverso entre as susceptibilidade do VIH-2 ao MVC e o número de células T CD4+ dos doentes quando os vírus foram isolados. Vírus isolados em doentes em fase de SIDA foram menos susceptíveis ao MVC do que os vírus isolados em doentes com uma contagem de células T CD4+ superior a 200 células/ul. Ao contrário do VIH-1 não encontrámos qualquer correlação entre a carga da V3 e a susceptibilidade dos isolados R5 de VIH-2 ao MVC. De um modo geral, os nossos resultados sugerem que são necessários ensaios clínicos para avaliar a efectividade do MVC na infecção pelo VIH-2, determinar a dose terapêutica mais adequada e esclarecer se é necessário fazer um ajuste de dose de acordo com a fase da doença. Adicionalmente, e uma vez que isolados VIH-2 X4 e populações duplas/mistas são totalmente ou parcialmente resistentes ao MVC, é de extrema importância o desenvolvimento de um ensaio de tropismo (genotípico e/ou fenotípico) para o VIH-2 de modo a determinar o tropismo antes do início da terapia com MVC. Sem o conhecimento prévio do tropismo viral, o tratamento com MVC poderá seleccionar espécies X4 minoritárias que estão associadas a maior resistência à neutralização e uma progressão mais rápida da doença. No que diz respeito aos inibidores de fusão, verificámos que o T-20 tem actividade reduzida no VIH-2, confirmando estudos anteriores realizados com dois isolados laboratoriais. Por outro lado, observámos uma elevada susceptibilidade deste vírus ao T- 1249, indicando que os inibidores de fusão são potencialmente eficazes na infecção pelo VIH-2. Assim, o desenvolvimento de um novo inibidor de fusão do VIH-2 foi o objectivo do último estudo desta tese (Capítulo 4). No Capítulo 4, desenvolvemos novos péptidos inibidores de fusão a partir da reconstrução de sequências ancestrais da glicoproteína gp36 do invólucro de VIH-2 e de Vírus de Imunodeficiência dos Símios (VIS). Com esta abordagem inovadora pretendemos incorporar a história evolutiva dos vírus na sequência dos péptidos e desta forma melhorar a tolerância destas moléculas aos polimorfismos naturais da sua região alvo bem como às mutações de resistência seleccionadas na sua presença. Obteve-se um péptido ancestral (P3) constituído por 34 aminoácidos, cuja sequência corresponde às posições homólogas 628 – 661 da proteína Env do isolado VIH-1 HXB2 (ou 623 – 656 do isolado VIH-2 ROD). A sequência do P3 difere em 21 aminoácidos da sequência consenso de VIH-1, 14 aminoácidos da sequência do T-20 e 6 aminoácidos da sequência consenso de VIH-2. Ao contrário da natureza não-estruturada do T-20, o P3 tem uma conformação típica em hélice-a, o que lhe poderá conferir maior a estabilidade contra a degradação proteolítica, bem como maior afinidade para a região alvo. Por outro lado, o P3 foi facilmente solúvel em soluções aquosas o que é uma vantagem num futuro desenvolvimento de uma fórmula farmacêutica. O P3 demonstrou ter uma forte actividade antiviral contra isolados primários e laboratoriais de VIH-1 e VIH-2 (IC50 médio, 11 nM para o HIV-1 e 63.8 nM para o HIV-2), incluindo variantes resistentes ao T-20 (IC50, 0.15 – 11.8 nM). Através da passagem consecutiva de vírus em cultura na presença do péptido, foi seleccionada uma mutação de resistência na região HR1 da gp41 (VIH-1), a qual é responsável pela redução da susceptibilidade do VIH-1 ao P3 em 120x. Nas mesmas condições, e após 60 dias em cultura, não foi possível seleccionar mutações de resistência ao P3 no VIH-2. Estes resultado, em conjugação com a sua forte ligação à glicoproteína transmembranar de um isolado de VIH-2, indicam que, tal como outros péptidos baseados na região HR2 (T-20, T- 1249), o P3 inibe a entrada do VIH pela interacção com a região HR1 da gp41 e sugerem que a barreira genética para a resistência ao P3 é significativamente superior no VIH-2 do que no VIH-1. Neste estudo demonstrámos ainda que o P3 é significativamente menos antigénico do que o T-20 nos doentes infectados pelo VIH-1 o que poderá traduzir-se numa maior duração da eficácia clínica do P3 em comparação com o T-20. Os resultados obtidos com o P3 demonstram pela primeira vez que é possível desenvolver péptidos com actividade antiviral significativa utilizando metodologias de biologia evolutiva, pelo que esta abordagem poderá ser explorada no futuro para a produção de medicamentos peptídicos e, eventualmente, de vacinas

Recent transmission clustering of HIV-1 C and CRF17_BF strains characterized by NNRTI-related mutations among newly diagnosed men in central Italy

Increased evidence of relevant HIV-1 epidemic transmission in European countries is being reported, with an increased circulation of non-B-subtypes. Here, we present two recent HIV-1 non-B transmission clusters characterized by NNRTI-related amino-acidic mutations among newly diagnosed HIV-1 infected men, living in Rome (Central-Italy)

Characterization of the longitudinal HIV-1 quasispecies evolution in HIV-1 infected individuals co-infected with Mycobacterium tuberculosis

One of the earliest and most striking observations made about HIV is the extensive genetic variation that the virus has within individual hosts, particularly in the hypervariable regions of the env gene which is divided into 5 variable regions (V1-V5) and 5 more constant (C1-C5) regions. HIV evolves at any time over the course of an individual’s infection and infected individuals harbours a population of genetically related but non-identical viruses that are under constant change and ready to adapt to changes in their environment. These genetically heterogeneous populations of closely related genomes are called quasispecies [65]. Tuberculosis or tubercle forming disease is an acute and/or chronic bacterial infection that primarily attacks the lungs, but which may also affect the kidneys, bones, lymph nodes, and brain. The disease is caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB), a slow growing rod-shaped, acid fast bacterium. It is transmitted from person to person through inhalation of bacteria-carrying air droplets. Worldwide, one person out of three is infected with Mycobacterium tuberculosis – two billion people in total. TB currently holds the seventh place in the global ranking of causes of death [73]. In 2008, there were an estimated 9.4 (range, 8.9–9.9 million) million incident cases (equivalent to 139 cases per 100 000 population) of TB globally [75]. A complex biological interplay occurs between M. tuberculosis and HIV in coinfected host that results in the worsening of both pathologies. HIV promotes progression of M. tuberculosis either by endogenous reactivation or exogenous reinfection [77, 78] and, the course of HIV-1 infection is accelerated subsequent to the development of TB [80]. Active TB is associated with an increase in intra-patient HIV-1 diversity both systemically and at the infected lung sites [64,122]. The sustainability or reversal of the HIV-1 quasispecies heterogeneity after TB treatment is not known. Tetanus toxoid vaccinated HIV-1 infected patients developed a transient increase in HIV-1 heterogeneity which was reversed after few weeks [121]. Emergence of a heterogeneous HIV-1 population within a patient may be one of the mechanisms to escape strong immune or drug pressure [65,128]. The existence of better fitting and/or immune escape HIV-variants can lead to an increase in HIV-1 replication [129,130]. It might be that TB favourably selected HIV-1 variants which are sources for consistent HIV-1 replication. Understanding the mechanisms underlying the impacts of TB on HIV-1 is essential for the development of effective measures to reduce TB related morbidity and mortality in HIV-1 infected individuals. In the present study we studied whether the increase in HIV-1 quasispecies diversity during active TB is reversed or preserved throughout the course of antituberculous chemotherapy. For this purpose Two time point HIV-1 quasispecies were evaluated by comparing HIV-1 infected patients with active tuberculosis (HIV-1/TB) and HIV-1 infected patients without tuberculosis (HIV-1/non TB). Plasma samples were obtained from the Frankfurt HIV cohort and HIV-1 RNA was isolated. C2V5 env was amplified by PCR and molecular cloning was performed. Eight to twenty five clones were sequenced from each patient. Various phylogenetic analyses were performed including tree inferences, intra-patient viral diversity and divergence, selective pressure, co-receptor usage prediction and two time point identity of quasispecies comparison using Mantel’s test. We found out from this study that: 1) Active TB sustains HIV-1 quasispecies diversity for longer period 2. Active TB increases the rate of HIV-1 divergence 3) TB might slow down evolution of X4 variants And we concluded that active TB has an impact on HIV-1 viral diversity and divergence over time. The influence of active TB on longitudinal evolution of HIV- 1 may be predominant for R5 viruses. The use of CCR5-coreceptor inhibitors for HIV-1/TB patients as therapeutic approach needs further investigation.Eine der ersten und überraschenden Beobachtungen, welche bei der Analyse des HI-Virus gemacht wurden ist seine ausgeprägte Genetische Variabilität besonders die hypervariable Region des env Genes betreffen. Dieses wird in 5 variable Regionen (V1-V5) sowie 5 stärker konservierte Regionen (C1-C5) unterteilt. HIV wandelt sich zu jedem Zeitpunkt im Verlauf der Infektion und jedes infizierte Individuum ist Träger einer Population von genetisch verwandten jedoch nicht identischen Viren, welche sich kontinuierlich verändern und an die Erfordernisse innerhalb der Umgebung anpassen. Diese genetisch heterogenen, jedoch eng verwandten Populationen werden Quasispecies genannt. Tuberkulose ist eine mykobakterielle Infektion, welche sowohl akute als auch chronische Verläufe zeigt. Neben den Lungen als primärem Manifestationsort können auch die Nieren, Knochen und andere Organe befallen sein. Eine von drei Personen weltweit ist mit Mycobacterium tuberculosis infiziert, insgesamt 2 Milliarden Menschen. In HIV/TB Co-Inifzierten Menschen entsteht ein komplexes Zusammenspiel zwischen HIV und M. tuberculosis, welches zu einer Verschlechterung beider Krankheitsbilder führt. HIV führt durch endogene Rekativierung oder exogene Re-Infektion zu einer Progression der Tuberkulose, welche im weiteren Verlauf die Krankheitsprogression von HIV beschleunigt. Sowohl Morbidität als auch Mortalität sind in HIV-1/TB Co-Infizierten Menschen erhöht. Aktive Lungentuberkulose und Miliartuberkulose gehen mit dem Anstieg der Diversifität der HIV Viren innerhalb eines Wirtes einher. Wie lange diese erhöhte Heterogenität der HIV Quasispecies nach der erfolgreichen Behandlung einer Tuberkulose bestehen bleibt ist bisher noch unklar. Das Verständnis des dem Zusammenspiel von HIV und TB zugrundeliegenden Mechanismus ist essentiell für die Entwicklung von effektiven Massnahmen zur Senkung der Morbidität und Mortalität in HIV/TB Co-infizierten Menschen. Die gegenwärtige Forschungsarbeit folgte daher der Frage, ob wärend einer aktiven TB Infektion eine Zunahme der Diversität der HIV-1 Quasispecies zu beobachten ist und ob diese Diversität während einer TB Therapie erhalten bleibt oder sich zurück bildet. Hierfür wurden die HIV-1 Quasispecies zu zwei Zeitpunkten untersucht, wobei Proben von HIV-1 infizierten Patienten mit aktiver Tuberkulose (HIV-1/TB) und HIV infizierte Patienten ohne Tuberkulose (HIV-1/non TB) verglichen wurden. Aus Plasmaproben der Frankfurter HIV Cohorte wurde HIV-1 RNA isoliert. C2V5 env wurde durch PCR amplifiziert und molekular cloniert. Acht bis fünfundzwanzig Clone wurden für jeden Patienten sequenziert. Mehrere phylogenetische Analysen wurden durchgeführt, welche tree inferences, Intra-Patienten- und virale Diversität und Divergenz, Selektionsdruckanalysen, Vorhersage der Co-Rezeptornutzung sowie Zweipunktanalysen der Identität von Quasispecies mit Hilfe des Mantel’s Test miteinschlossen. Die Analysen ergaben die folgenden Ergebnisse: 1) Eine aktive TB erhält die Diversität von HIV-1 Quasispecies über einen längeren Zeitraum. 2. Eine aktive TB verstärkt die HIV -1 Divergenz 3) TB könnte zu einer langsameren Evolution von X4 Varianten führen. Schlussfolgerung: eine aktive TB beeinflusst die Entwicklung der viralen Diversität und Divergenz von HIV-1 im Verlauf der Krankheit. Der Einfluss der aktiven TB auf die longitudinale Evolution von HIV-1 könnte insbesondere R5 Viren betreffen. Der Einsatz von CCR5-Corezeptor Inhibitoren in HIV-1/TB coinifizerten Patienten sollte daher in Langzeitstudien untersucht werden

Evolutionary and Structural Features of the C2, V3 and C3 Envelope Regions Underlying the Differences in HIV-1 and HIV-2 Biology and Infection

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Users must also make clear the license terms under which the work was published.Background: Unlike in HIV-1 infection, the majority of HIV-2 patients produce broadly reactive neutralizing antibodies, control viral replication and survive as elite controllers. The identification of the molecular, structural and evolutionary footprints underlying these very distinct immunological and clinical outcomes may lead to the development of new strategies for the prevention and treatment of HIV infection.Methodology/Principal Findings: We performed a side-by-side molecular, evolutionary and structural comparison of the C2, V3 and C3 envelope regions from HIV-1 and HIV-2. These regions contain major antigenic targets and are important for receptor binding. In HIV-2, these regions also have immune modulatory properties. We found that these regions are significantly more variable in HIV-1 than in HIV-2. Within each virus, C3 is the most entropic region followed by either C2 (HIV-2) or V3 (HIV-1). The C3 region is well exposed in the HIV-2 envelope and is under strong diversifying selection suggesting that, like in HIV-1, it may harbour neutralizing epitopes. Notably, however, extreme diversification of C2 and C3 seems to be deleterious for HIV-2 and prevent its transmission. Computer modelling simulations showed that in HIV-2 the V3 loop is much less exposed than C2 and C3 and has a retractile conformation due to a physical interaction with both C2 and C3. The concealed and conserved nature of V3 in the HIV-2 is consistent with its lack of immunodominancy in vivo and with its role in preventing immune activation. In contrast, HIV-1 had an extended and accessible V3 loop that is consistent with its immunodominant and neutralizing nature.Conclusions/Significance: We identify significant structural and functional constrains to the diversification and evolution of C2, V3 and C3 in the HIV-2 envelope but not in HIV-1. These studies highlight fundamental differences in the biology and infection of HIV-1 and HIV-2 and in their mode of interaction with the human immune system and may inform new vaccine and therapeutic interventions against these viruses.Fundo para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Collaborative HIV and Anti-HIV Drug Resistance Network, European Union. PB and IB supported by PhD grants from Fundo para a Ciência e Tecnologia

Molecular characteristics of HIV-1 subtype C and its impact on therapeutic outcome in Ethiopia

HIV-1 is characterized by a high genetic diversity which poses several challenges and implications with regard to disease progression, drug resistance and outcome of antiretroviral therapy (ART). HIV-1 subtype C (HIV-1C) is the most rapidly expanding subtype accounting for half of the global disease and nearly all infections in Ethiopia, Southern Africa and India which are the regions with the highest burden of HIV-1 infection. Molecular characteristics of the virus in such epidemic success need to be explored to better understand this subtype. In the thesis, we analysed plasma samples and patient data collected during 2009-2011 in a large country-wide cohort, Advanced Clinical Monitoring of ART (ACM) which was established to evaluate the longitudinal effectiveness of ART as practiced in real life in Ethiopia. The overall aim was to investigate the molecular characteristics of HIV-1C and its impact on first line ART outcome in Ethiopia. Both genotypic and phenotypic molecular techniques were employed to characterize different regions of the viral genome. In papers I and II, population sequencing (PBSS) of the V3 loop of the HIV-1 envelope from therapy naïve, patients failing therapy, as well as HIV-1C sequences from Ethiopia dated 1984-2003 was used to assess the molecular epidemiology of HIV-1C in different geographic regions and the trend of viral tropism over the last decades. We also investigated the utility of different genotypic tropism prediction tools and the impact of the predicted viral co-receptor tropism on the outcome of standard first line ART. Our results showed that the Ethiopian epidemic is still monophylogenetic, exclusively dominated by HIV-1C, CCR5 tropic viruses. Furthermore, baseline tropism had an impact on outcome of standard first line ART. While each tool predicted tropism with comparable frequency, there was yet a large discordance between the tools. We elucidated this discordance further in paper III by employing an in-house phenotypic tropism method compared with the prediction by bioinformatics tools used in paper II as well as in vitro sensitivity of HIV-1CEth strains for the co-receptor antagonist maraviroc. The results showed underestimation of R5 co-receptor usage by bioinformatics tools and effectiveness of maraviroc in HIV-1C. Expanding the exploration further to pol gene, we employed PBSS and next generation sequencing (NGS) to assess the prevalence of surveillance drug resistance mutations (sDRM) to reverse transcriptase- and protease-inhibitors as well as occurrence of DRM by NGS to the novel category of integrase strand inhibitors. The results in paper IV showed that NGS detected sDRM associated with RT- and PI- inhibitors more often than PBSS and major INSTI DRMs were found in minor viral variants. Furthermore, DRM identified before treatment was associated with a poorer treatment outcome. In conclusion, viral tropism and drug resistance mutations at baseline have an impact on subsequent treatment outcome. Currently available genotypic tropism prediction tools need further improvement for use in HIV-1C. The Ethiopian epidemic remains uniquely dominated by R5 tropic HIV-1C since its introduction. Further investigations should be done to delineate associated molecular and epidemiological factors contributing to its uniqueness

Molecular and Functional Properties of Transmitted HIV-1 Envelope Variants: A Dissertation

In 2008 the Nobel Prize in Physiology or Medicine was awarded to the co-discoverers of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1), the causative agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). This award acknowledged the enormous worldwide impact of the HIV-1/AIDS pandemic and the importance of research aimed at halting its spread. Since the syndrome was first recognized, 25 million people have succumbed to AIDS and over 33 million are currently infected with HIV-1 (www.unaids.org). The most effective strategy for ending the pandemic is the creation of a prophylactic vaccine. Yet, to date, all efforts at HIV-1 vaccine design have met with very limited success. The consistent failures of vaccine candidates stem in large part from the unprecedented diversity of HIV-1. Among the novel theories of vaccine design put forward to address this diversity is the targeted vaccine approach. This proposal is based on the finding that mucosal transmission of HIV-1, the most prevalent form, occurs across a selective bottleneck such that typically only a single (or a few) variants of the viral swarm present in a donor are passed to the recipient. While the mechanisms controlling the selection are largely unknown, the targeted vaccine approach postulates that once they are identified, we can utilize this understanding to design vaccines specifically targeted to the characteristics shared by the rare, mucosally transmissible HIV-1 variants. The studies described in this work were conducted to improve our understanding of the factors influencing viral variant selection during mother-to-child-transmission of HIV-1, a route of mucosal transmission which has globally become the leading cause of child infection. A unique panel was generated, consisting of nearly 300 HIV-1 envelope genes cloned from infected mother-infant pairs. Extensive characterization of the genotypes, phenotypes and phylogeny of these clones was then done to identify attributes differentiating early infant from maternal variants. Low genetic diversity of HIV-1 envelope variants was detected in early infant samples, suggesting a bottleneck and active selection of variants for transmission. Transmitted variants did not differ from non-transmitted variants in CD4 and CCR5 use. Infant isolates replicated poorly in macrophages; a cell subtype hypothesized to be important in the establishment of infection. The sensitivity of infant envelope variants to neutralization by a panel of monoclonal antibodies, heterologous and autologous plasmas and HIV-1 entry inhibitors varied. Most intriguingly, envelopes cloned from infants infected during delivery exhibited a faster entry phenotype than maternal isolates. Together, these findings provide further insight into viral variant selection during mother-to-child transmission. Identification of properties shared by mucosally transmitted viral variants may allow them to be selectively targeted, resulting in improved methods for preventing HIV-1 transmission

HIV infection in Angola : Molecular epidemiology, diagnosis and antibody neutralization

The UNAIDS fast-track goals established the need to reduce 75% of new HIV cases and deaths by 2020 and 90% by 2030, compared to 2010 [1]. However, it is estimated that no country in sub-Saharan Africa has reached the target of 75% reduction in new cases of HIV infection [2]. HIV-1 incidence in Angola increased 61.2% from 2010 to 2018 and the prevalence is now stable with 340,000 people living with HIV [2, 3]. Women and children are the most affected populations [3]. The aims of this thesis were: 1) to get a better understanding of the HIV-1 diversity, transmission dynamics and transmitted drug resistance (TDR) in Angola, 2) improve the early infant diagnosis (EID) in Angola and 3) characterize the neutralizing antibody responses against HIV-1 and assess the possible viral and host factors associated with it. The HIV epidemics in Angola is peculiar, since highly divergent forms of the virus circulates in the population. In this context our first objective was to assess HIV-1 diversity, transmission dynamics and prevalence of transmitted drug resistance (TDR) in Angola in 2009, in 139 drug naïve HIV-1 infected individuals and compare the results before ART scale-up (chapter 2). We saw an increase in genetic diversity between 2001 and 2009, with the prevalence of subtype A decreasing significantly while the prevalence of unique recombinant forms (URFs) increased 2-fold. Also, local U/H recombinants were newly identified. TDR mutation K103N was found in one (0.7%) patient. Overall, transmission of drug resistant strains was still negligible in Luanda in 2009 and the emergence of new URFs are consistent with a rising HIV-1 epidemics. Our second objective was to develop and validate a sensitive, simple and cheap qualitative proviral DNA PCR-based assay for early infant diagnosis (EID) in HIV-1-exposed infants (n=139) using dried blood spots (DBS) (chapter 3). We were able to successfully validate the assay, the limit of detection (LOD) using several integrase recombinant plasmids was 14 copies and clinical sensitivity and specificity were high. The percentage of HIV-1 mother-to-child-transmission (MTCT) between January 2012 and October 2014 was only 2.2%. In chapter 4 we performed the first detailed characterization of the neutralizing antibody response in 322 Angolan HIV-1 infected patients and identified its determinants. Remarkably, 56% of the individuals had broad cross-neutralizing activity. Also, cross-clade neutralization was positively associated with subtype C infection and negatively associated with CD4 counts and antibody binding titers against envelope C2V3C3 region was a good indicator of neutralization breadth and potency. In chapter 4 we concluded that development of broad and elite antibody neutralization against HIV-1 requires long-term and low-level envelope V3C3 stimulation from highly diverse subtype C isolates

Bayesian analysis of complex mutations in HBV, HCV, and HIV studies

This article provides a review of the Bayesian-inference-based methods applied to Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis C Virus (HCV), and Human Immunodeficiency Virus (HIV) studies with a focus on the detection of the viral mutations and various problems which are correlated to these mutations. The authors also provide a summary of the Bayesian methods' applications toward these viruses' studies, where several important and useful results have been discovered

Analysis of antibody neutralization specificities in human immunodeficiency virus type 2 infection

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013Dynamics of the neutralizing antibody response and resulting HIV-2 escape during acute and chronic infections and their impact on viral evolution and disease progression remain unknown. The aims of this thesis were: characterize Nab response and molecular and phenotypic evolution of HIV-2 in early infection, investigate Nab responses in HIV-2 chronically infected patients with memory B cell imbalances and characterize the neutralization phenotype of HIV-2 X4-tropic isolates from diverse disease stages. Broad and potent Nabs are elicited very early in HIV-2 infection, the potency of this response being associated with high evolutionary rates. Nab escape was associated with R5-to-X4 switch, increased diversity in V1 and V3 regions and changes in V3 conformation. These findings show that Nabs are the main driver of the rapid molecular and phenotypic evolution of HIV-2 in early infection. Despite the loss of memory B cells observed with disease progression, broad and potent Nabs were elicited throughout HIV-2 infection. Nabs were found to target the C2V3C3 envelope region and, in advanced disease stage, the gp36 ectodomain. These data suggest a role for other B cell subsets in the production and perpetuation of Nabs. HIV-2 X4-tropic viruses were found to be significantly more Nab resistant than R5 viruses (independently of disease stage) and late infection X4 isolates were significantly more Nab resistant than early infection X4 viruses. X4-tropism was associated with sequence changes and significant gain in the V3 loop secondary structure. The results prove that Nab resistance is an intrinsic feature of X4-tropic HIV-2 isolates, acquired through infection period, and is associated with amino acid and conformational changes in the V3 loop that favour R5-to-X4 switch. In conclusion, Nab responses emerge very early in infection, persist despite memory B cells imbalances and drive tropism switch, supporting a major role for Nabs in HIV-2 evolution.O Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 2 (HIV-2) foi identificado pela primeira vez como agente causal da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) em 1986 numa colaboração entre cientistas e clínicos portugueses (Professora Maria Odette Santos Ferreira da Faculdade de Farmácia de Lisboa e Professor José Luís Champalimaud do Hospital Egas Moniz) e franceses (equipe de investigadores liderada pelo Professor Luc Montagnier do Instituto Pasteur em Paris).Embora este vírus seja semelhante ao HIV-1 em termos de organização estrutural e genómica, muitos aspectos distinguem as infecções provocadas por estes dois vírus. O HIV-2 é apenas responsável por pequenas epidemias nos países onde teve origem e em países vizinhos ou com relações históricas com estas regiões, em oposição ao HIV-1 que é responsável pela pandemia mundial. A maioria dos indivíduos infectados com HIV-2 apresenta cargas virais indetectáveis, contagem normais de células T CD4+ e ausência de progressão clínica. A resposta imunitária do hospedeiro ao HIV-2 também parece ser melhor comparativamente ao HIV-1, uma vez que a maioria dos indivíduos mantém fortes respostas celulares e humorais contra o vírus durante a fase crónica da infecção por HIV-2. Conhecer e compreender as interacções vírus-hospedeiro na infecção por HIV-2 poderá ser importante no desenho de vacinas, uma vez que as respostas imunitárias geradas contra o HIV-2 poderão ser mimetizadas na vacinação não só contra este vírus mas também contra o HIV-1. Uma das maiores diferenças entre as duas infecções é a produção de anticorpos neutralizantes de elevado espectro e potência nos indivíduos infectados por HIV-2. Estes anticorpos e outras respostas imunitárias poderão ser fundamentais no controlo da infecção e a base para a progressão mais lenta para SIDA observada nestes doentes. Contudo, muitos aspectos da infecção por HIV-2 permanecem por esclarecer, nomeadamente como é que os anticorpos neutralizantes controlam o vírus e como o vírus reage a estes anticorpos, em particular na infecção aguda. Perante este cenário, o objectivo geral desta tese foi conhecer melhor a resposta dos anticorpos neutralizantes na infecção por HIV-2 e explorar a forma como eles influenciam a evolução genética e fenotípica do vírus. A forma como o hospedeiro reage ao primeiro contacto com um agente infeccioso poderá ser determinante para o controlo e evolução da infecção. Desta forma, estudar a infecção primária por HIV-2 poderá elucidar sobre quais os mecanismos envolvidos no melhor controlo deste vírus comparativamente ao HIV-1. Uma vez que a maioria dos doentes infectados com HIV-2 são apenas diagnosticados na fase crónica da infecção, muito depois da seroconversão, torna-se extremamente difícil estudar a infecção aguda. Devido a este facto, ao contrário do que se passa na infecção por HIV-1, nada se sabe sobre a resposta imunitária e a evolução viral na infecção aguda por HIV-2. Esta lacuna no conhecimento sobre a infecção por HIV-2 levou ao primeiro objectivo desta dissertação: caracterizar a resposta em anticorpos neutralizantes e a evolução molecular e fenotípica do HIV-2 desde as fases iniciais e ao longo da infecção (capítulo 3). Estudar crianças infectadas por transmissão vertical constitui uma oportunidade única para conhecer a infecção aguda por HIV-2. Apesar de ser um evento raro, existem casos documentados de transmissão mãe-filho de HIV-2. Foram colhidas à nascença e ao longo de vários anos amostras de sangue de duas crianças nascidas de mães infectadas com HIV-2. A criança 1, nascida em 1998, foi diagnosticada com HIV-2, por PCR, aos 39 dias de vida e a criança 2, nascida em 1992, aos 27 dias de vida. A criança 1 nasceu com contagens de células T CD4+ normais e ausência de viremia, mas aos cinco anos de idade ocorreu um aumento drástico na carga viral em paralelo com o declínio das células T CD4+. Iniciou-se o tratamento, o que levou à recuperação virológica e imunológica. A criança 2 nasceu com encefalopatia apesar ter contagens de células T CD4+ normais e ausência de viremia. O tratamento foi iniciado de imediato, no entanto as opções terapêuticas existentes nessa altura (1992) eram muito limitadas. A carga viral aumentou e as células T CD4+ diminuíram, acabando a criança por falecer aos 9 anos. Foi extraído DNA de células de final de cultura de ambas as crianças de vários anos de infecção. O gene env foi amplificado, clonado e sequenciado. As sequências geradas foram analisadas em termos de diversidade genética, pressão selectiva, taxa de evolução nucleotídica e locais de glicosilação. Igualmente a partir das sequências geraram-se modelos estruturais da glicoproteina Env por homology modelling. Determinou-se o tropismo viral dos vírus de ambas as crianças à nascença e ao longo da infecção. Efectuaram-se ensaios de neutralização com os plasmas das crianças dos vários anos de infecção contra os seus vírus autólogos e, no caso da criança 1, também contra 5 vírus heterólogos, três R5 e dois X4. A diversidade nucleotídica e aminoacídica e os locais sobre selecção positiva foram significativamente maiores na criança 1 comparativamente à criança 2. Da mesma forma, a taxa de evolução viral na criança 1 foi quase o dobro da criança 2 e semelhante à taxa de evolução viral em indivíduos com infecção crónica por HIV-2 a fazerem tratamento antirretroviral, de onde se conclui que a rápida evolução molecular do HIV-2 começa logo no início da infecção. Ambas as crianças foram infectadas com vírus que utilizavam o coreceptor CCR5 (vírus R5) mas aos 5 anos de idade já possuíam vírus com tropismo para células exprimindo o co-receptor CXCR4 (vírus X4). Este foi o primeiro estudo em que se observou efectivamente uma alteração de tropismo R5 para X4 na infecção por HIV-2. De salientar que a transição de tropismo observada nestas crianças foi extremamente rápida, uma vez que vírus HIV-2 que utilizam o co-receptor X4 são geralmente encontrados em indivíduos infectados há vários anos e em fases avançadas da infecção. Desde o início de vida, a criança 1 apresentou uma forte resposta em anticorpos neutralizantes, tanto autóloga como heteróloga, particularmente contra vírus R5. A resposta contra vírus X4 foi significativamente mais fraca e diminuiu ao longo da infecção concomitantemente com o aparecimento das estirpes utilizadoras do co-receptor X4. A criança 2 desenvolveu uma resposta muito fraca contra vírus X4 autólogos, que decresceu rapidamente com a progressão da doença. Em ambas as crianças, a alteração no tropismo de R5 para X4, a diversificação das regiões V1 e V3 e a conversão da estrutura secundária da região V3 para conformação em β-hairpin foram associadas ao escape aos anticorpos neutralizantes. Os resultados indicam que na presença de uma forte resposta dos anticorpos neutralizantes (criança 1) a diversidade e a taxa de evolução viral são muito elevadas, ao passo que quando a pressão imposta pelos anticorpos neutralizantes é menor (criança 2) estes marcadores de evolução são semelhantes à infecção aguda por HIV-1 (tanto adultos como crianças). Concluindo, estes dados apoiam a hipótese de os anticorpos neutralizantes serem responsáveis pela rápida evolução molecular e fenotípica do HIV-2 logo no início da infecção. A produção de anticorpos neutralizantes está a cargo das células B. Após encontro com um antigénio, as células B naïve sofrem maturação e diferenciação em plasmócitos e células B de memória, capazes de produzir anticorpos específicos contra esse antigénio. Na infecção por HIV-1 e HIV-2 há diminuição acentuada do número de células B de memória. Esta depleção é irreversível mesmo com terapia antirretroviral. No entanto, e contrariamente à infecção por HIV-1, a maioria dos indivíduos infectados com HIV-2 produzem anticorpos neutralizantes durante a fase crónica da infecção. Qual será a relação entre as células B de memória e a produção de anticorpos neutralizantes na infecção por HIV-2? Conhecer, nesta infecção, qual a população de células B responsável pela produção dos elevados níveis de anticorpos neutralizantes poderá ser importante para a produção de uma vacina contra o HIV-1 e o HIV-2. Neste contexto, o segundo objectivo desta tese foi investigar a associação entre a resposta em anticorpos neutralizantes e as células B de memória na infecção por HIV-2 (capítulo 4). Foram estudados 37 indivíduos infectados com HIV-2, 73% dos quais nunca tinham recebido tratamento antiretroviral, 76% tinham carga viral indetectável e 59% tinham contagem de células T CD4+ igual ou superior a 350 células/μl. Os doentes apresentavam níveis variados de depleção das células B de memória sem alteração de classe (CD19+CD27+IgD+) e com alteração de classe (CD19+CD27+IgD-) directamente associada à diminuição do número de células T CD4+. Conhecia-se igualmente a resposta em anticorpos de ligação contra as regiões C2V3C3 e gp36 do invólucro. Os ensaios de neutralização foram efectuados com os plasmas dos indivíduos em estudo contra quatro vírus R5 heterólogos. Verificou-se que todos os doentes produziam anticorpos neutralizantes de elevada potência. Estes anticorpos eram também de largo espectro uma vez que, com duas excepções, todos os plasmas neutralizavam pelo menos dois vírus (55% neutralizavam três ou quatro vírus). O título de anticorpos neutralizantes não estava associado à contagem de células T CD4+, à carga viral ou ao tratamento antirretroviral. Contudo, o título de anticorpos neutralizantes estava associado ao nível de anticorpos de ligação contra a região C2V3C3 nos doentes com contagem de células T CD4+ ≥ a 350 células/μl, e aos anticorpos de ligação contra a região gp36 em doentes em estados mais avançados da doença (células T CD4+ < 350 células/ μl). Além disso, o título de anticorpos neutralizantes estava inversamente associado à depleção das células B de memória (sem e com alteração de classe) no grupo de doentes não tratados. Os resultados obtidos sugerem que, apesar da diminuição das células B de memória com a progressão da doença, continuam a ser produzidos anticorpos neutralizantes de elevado espectro e potência ao longo da infecção por HIV-2. Estudos recentes com o HIV-1 mostraram que, apesar de serem raros os doentes que produzem anticorpos neutralizantes, a produção de anticorpos não específicos é mantida pelos plasmócitos, que não necessitam de constante exposição ao antigénio para produzirem anticorpos. Os resultados apresentados nesta tese apontam para que outra população de células B (provavelmente os plasmócitos) seja responsável pela produção e perpetuação dos anticorpos na infecção por HIV-2, com a principal diferença, face ao HIV-1, destes serem neutralizantes. Estes anticorpos são maioritariamente dirigidos contra a região C2V3C3 e, em fases mais avançadas da infecção, contra a gp36. Estudos recentes verificaram que vírus HIV-2 com tropismo para células que expressam o coreceptor CXCR4, isolados de doentes a fases avançadas da infecção, são resistentes aos anticorpos neutralizantes. Foi também descrito no Capítulo 3 que vírus X4 isolados de crianças recentemente infectados são mais resistentes à neutralização. Estes resultados sugerem uma associação entre escape aos anticorpos neutralizantes e alteração de tropismo de R5 para X4. No entanto, permanece a dúvida se os vírus com tropismo para X4 são intrinsecamente resistentes à resposta em anticorpos neutralizantes. O terceiro objective deste trabalho foi caracterizar o fenótipo de neutralização de isolados primários utilizadores do coreceptor X4 isolados de doentes infectados com HIV-2 em várias fases da infecção de forma a determinar se todas as estirpes X4 são resistentes aos anticorpos neutralizantes independentemente do estadio da doença. Foram estudados cinco vírus X4 isolados de doentes em estados avançados de doença (mediana de células T CD4+=78 células/μl) e dois vírus X4 isolados de crianças infectadas por transmissão vertical (ver capítulo 3) em fase inicial da infecção (5 anos) (mediana de células T CD4+=320 células/μl). A sensibilidade dos vírus X4 à neutralização foi comparada com três vírus R5 usados como controlo (mediana de células T CD4+=275 células/μl). Os ensaios de neutralização foram efectuados contra 16 isolados clínicos heterólogos. Observou-se que os vírus X4 eram significativamente mais resistentes à neutralização que os vírus R5, independentemente da fase da infecção em que foram isolados. O facto de os vírus X4 das crianças serem também mais resistentes à neutralização que os vírus R5, demonstra que a resistência aos anticorpos neutralizantes pode surgir muito cedo após a transmissão. Além disso, os vírus X4 de indivíduos em estados avançados de doença eram significativamente mais resistentes aos anticorpos neutralizantes que os vírus X4 isolados das crianças (infecção recente), o que sugere que a resistência aos anticorpos neutralizantes é um processo gradual que vai ocorrendo ao longo da infecção. Ao analisar-se a região V3 dos vírus em estudo, detectou-se que todos os vírus X4 apresentavam as mutações nesta região anteriormente associadas a alteração de tropismo de R5 para X4 (uma mutação na posição 18, a mutação V19K/R, uma inserção na posição 24 e uma carga global igual ou superior a 7). A avaliação das estruturas secundárias desta região revelou igualmente diferenças importantes entre vírus R5 e X4. Os vírus R5 na infecção aguda e crónica são caracterizados por ausência de estrutura secundária regular, ao passo que os vírus X4 de infecção recente apresentam uma estrutura secundária em β-hairpin. Os vírus X4 de indivíduos em fase avançada caracterizam-se pelas conformações β-α-β ou helix-loophelix. Estes dados sugerem um modelo de evolução da estrutura secundária da região V3 no qual, ao longo da infecção, a pressão exercida pelos anticorpos neutralizantes sobre a V3 força o vírus a escapar e a alterar esta região de forma que deixe de ser reconhecida pelos anticorpos neutralizantes. Estas alterações favorecem igualmente a mudança de tropismo para X4 o que por sua vez está associado ao decréscimo das células T CD4+. Estes dados mostram que a resistência aos anticorpos neutralizantes é uma característica intrínseca dos vírus X4, provavelmente determinada por alterações na sequência e conformação da região V3, que dificultam o reconhecimento desta região pelos anticorpos. Em conclusão, este trabalho permitiu demonstrar que a resposta dos anticorpos neutralizantes surge muito cedo na infecção aguda e persiste na fase crónica da infecção mesmo após significativa depleção das células B de memória, e ainda que os Nabs são responsáveis pela evolução viral, por alterações estruturais na região V3 e pela alteração do tropismo que leva à resistência à neutralização. Os resultados constituem também um novo e potencialmente relevante contributo na área das vacinas. Em primeira análise, o escape à acção dos anticorpos neutralizantes existe na infecção por HIV-2 e por conseguinte uma vacina necessita de geral respostas contra estirpes R5 e X4. Os anticorpos são principalmente dirigidos contra a região V3 nas fases inicial e crónica da infecção. Em estádios mais avançados, a resposta contra esta região diminui mas surgem anticorpos cujo alvo é a gp36. Estes resultados confirmam que a V3 é um bom imunogénio a ser usado no desenho de vacinas mas salientam o facto de a gp36 poder conter epitopos importantes a serem incluídos numa vacina. Outra importante contribuição destes estudos foi a descoberta de que é possível manter uma forte resposta em anticorpos neutralizantes através de populações de células B que não as de memória, nomeadamente plasmócitos. Uma vacina contra o HIV-2 e o HIV-1 idealmente estimularia respostas deste tipo de células B. A dificuldade persiste em escolher o imunogénio ou grupo de imunogénios capazes de suscitar estas respostas. Destes estudos conclui-se que imunogénios baseados na região V3 e na gp36 do HIV-2 poderão ser bons candidatos para o desenho de vacinas.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/41328/2007