Insights into the Mechanism of Ligand Binding to Octopine Dehydrogenase from Pecten maximus by NMR and Crystallography

Octopine dehydrogenase (OcDH) from the adductor muscle of the great scallop, Pecten maximus, catalyzes the NADH dependent, reductive condensation of L-arginine and pyruvate to octopine, NAD+, and water during escape swimming and/or subsequent recovery. The structure of OcDH was recently solved and a reaction mechanism was proposed which implied an ordered binding of NADH, L-arginine and finally pyruvate. Here, the order of substrate binding as well as the underlying conformational changes were investigated by NMR confirming the model derived from the crystal structures. Furthermore, the crystal structure of the OcDH/NADH/agmatine complex was determined which suggests a key role of the side chain of L-arginine in protein cataylsis. Thus, the order of substrate binding to OcDH as well as the molecular signals involved in octopine formation can now be described in molecular detail

Correlated Prompt Fission Data in Transport Simulations

Detailed information on the fission process can be inferred from the observation, modeling and theoretical understanding of prompt fission neutron and $\gamma$-ray~observables. Beyond simple average quantities, the study of distributions and correlations in prompt data, e.g., multiplicity-dependent neutron and \gray~spectra, angular distributions of the emitted particles, $n$-$n$, $n$-$\gamma$, and $\gamma$-$\gamma$~correlations, can place stringent constraints on fission models and parameters that would otherwise be free to be tuned separately to represent individual fission observables. The FREYA~and CGMF~codes have been developed to follow the sequential emissions of prompt neutrons and $\gamma$-rays~from the initial excited fission fragments produced right after scission. Both codes implement Monte Carlo techniques to sample initial fission fragment configurations in mass, charge and kinetic energy and sample probabilities of neutron and $\gamma$~emission at each stage of the decay. This approach naturally leads to using simple but powerful statistical techniques to infer distributions and correlations among many observables and model parameters. The comparison of model calculations with experimental data provides a rich arena for testing various nuclear physics models such as those related to the nuclear structure and level densities of neutron-rich nuclei, the $\gamma$-ray~strength functions of dipole and quadrupole transitions, the mechanism for dividing the excitation energy between the two nascent fragments near scission, and the mechanisms behind the production of angular momentum in the fragments, etc. Beyond the obvious interest from a fundamental physics point of view, such studies are also important for addressing data needs in various nuclear applications. (See text for full abstract.)Comment: 39 pages, 57 figure files, published in Eur. Phys. J. A, reference added this versio

M. tuberculosis Transcription Machinery: A Review on the Mycobacterial RNA Polymerase and Drug Discovery Efforts

Mycobacterium tuberculosis (MTB) is the main source of tuberculosis (TB), one of the oldest known diseases in the human population. Despite the drug discovery efforts of past decades, TB is still one of the leading causes of mortality and claimed more than 1.5 million lives worldwide in 2020. Due to the emergence of drug-resistant strains and patient non-compliance during treatments, there is a pressing need to find alternative therapeutic agents for TB. One of the important areas for developing new treatments is in the inhibition of the transcription step of gene expression; it is the first step to synthesize a copy of the genetic material in the form of mRNA. This further translates to functional protein synthesis, which is crucial for the bacteria living processes. MTB contains a bacterial DNA-dependent RNA polymerase (RNAP), which is the key enzyme for the transcription process. MTB RNAP has been targeted for designing and developing antitubercular agents because gene transcription is essential for the mycobacteria survival. Initiation, elongation, and termination are the three important sequential steps in the transcription process. Each step is complex and highly regulated, involving multiple transcription factors. This review is focused on the MTB transcription machinery, especially in the nature of MTB RNAP as the main enzyme that is regulated by transcription factors. The mechanism and conformational dynamics that occur during transcription are discussed and summarized. Finally, the current progress on MTB transcription inhibition and possible drug target in mycobacterial RNAP are also described to provide insight for future antitubercular drug design and development

Wnt signaling and hepatocarcinogenesis: Molecular targets for the development of innovative anticancer drugs

SummaryHepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common causes of cancer death worldwide. HCC can be cured by radical therapies if early diagnosis is done while the tumor has remained of small size. Unfortunately, diagnosis is commonly late when the tumor has grown and spread. Thus, palliative approaches are usually applied such as transarterial intrahepatic chemoembolization and sorafenib, an anti-angiogenic agent and MAP kinase inhibitor. This latter is the only targeted therapy that has shown significant, although moderate, efficiency in some individuals with advanced HCC. This highlights the need to develop other targeted therapies, and to this goal, to identify more and more pathways as potential targets. The Wnt pathway is a key component of a physiological process involved in embryonic development and tissue homeostasis. Activation of this pathway occurs when a Wnt ligand binds to a Frizzled (FZD) receptor at the cell membrane. Two different Wnt signaling cascades have been identified, called non-canonical and canonical pathways, the latter involving the β-catenin protein. Deregulation of the Wnt pathway is an early event in hepatocarcinogenesis and has been associated with an aggressive HCC phenotype, since it is implicated both in cell survival, proliferation, migration and invasion. Thus, component proteins identified in this pathway are potential candidates of pharmacological intervention. This review focuses on the characteristics and functions of the molecular targets of the Wnt signaling cascade and how they may be manipulated to achieve anti-tumor effects

Simultaneous fluorescence-interference detection for dissecting 2-dimensional protein-protein interactions on membranes

Protein-protein interactions within the plane of cellular membranes play a key role for many biological processes and in particular for transmembrane signaling. A prominent example is the ligand-induced crosslinking of cytokine receptors, where 3- dimensional cytokine binding followed by 2-dimensional interaction between the receptor subunits have been recognized to be important for regulating signaling specificity. The fundamental importance of such coupled interactions for cell-surface receptor activation has stimulated numerous theoretical studies, which have hardly been confirmed experimentally. An experimental approach to measure interactions and real time kinetics of type I interferon (IFN) induced assembly between interferon receptor subunits ifnar2 and ifnar1 on membrane was developed and determinants of the 2-dimensional interactions, such as dimensionality, size, valency, orientation, membrane fluidity and receptor density were quantitatively addressed The C-terminal decahistidine tagged extracellular domains (EC) of ifnar1 and ifnar2 were site- specifically tethered onto solid-supported fluid lipid membrane, which carried covalently attached chelator bis-nitrilotriacetic acid (bis-NTA) groups. Interactions on the lipid bilayer were detected with a novel solid phase detection technique, which allows simultaneous detection of ligand binding to a membrane anchored receptors and lateral interaction between them in the real time. This was achieved by combining two optical techniques: label-free reflectance interferometry (RIf) and total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). Fluorescence signals, in the order of 10 fluorophores/µm2, were detected without substantial photobleaching. The sensitivity of the label-free interferometric detection was in the range of 10 pg/mm2. The crosstalk between the two signals was eliminated by means of spectral separation. Fluorescence was detected in the visible region and RIf was performed at 800 nm in the near infrared. Flow through conditions allowed to automate experiments and measure binding events as fast as ~ 5 s-1. Using this technique we have dissected the interactions involved in IFN-induced ifnar crosslinking. 2-dimensional association and dissociation rate constants were independently determined by tethering high stoichiometric excess of one of the receptor subunits and comparing dissociation of the labelled ligand away from the membrane in the absence and presence of the non-labelled high affinity competitor. Dissociation traces were fitted with the two-step dissociation model: the first step being the 2-dimensional separation of the ternary complex followed by the 3- dimensional ligand dissociation into solution. Label-free RIf detection allowed absolute parameterization of the 2-dimensional concentrations of the ifnar subunits on the membrane. The TIRFS signal provided high sensitivity of the ligand dissociation and was correlated against the RIf signal before fitting. These features of the detection system allowed us to parameterize the model, and the 2-dimensional association or dissociation rate constants were the only variables during the fitting. Another FRET based binding assay was developed to determine the 2- dimensional dissociation rate constant using a pulse-chase approach. The donor fluorescence from ifnar2-EC was quenched upon the ternary complex formation with the acceptor-labelled IFN and the nonlabelled ifnar1-EC. The equilibrium was perturbed by rapid tethering of substantial excess of the nonlabelled ifnar2-EC onto the membrane. The exchange of the labelled ifnar2-EC with the nonlabelled one was monitored as the decrease in the FRET signal with the 2-dimensional dissociation of ifnar2-EC from the ternary complex being the rate limiting step. Based on the several mutants and variants of the interacting proteins, the effect of different rate constants and receptor orientation on the 2-dimensional crosslinking dynamics was studied. We have identified several critical features of the 2- dimensional interactions on membranes, which cannot be readily concluded from the solution binding assays. The restricted rotation and the increased lifetime of the encounter complex due to high membrane viscosity are the main determinants of the 2-dimensional association. Tethering ifnar1-EC to the membrane via N-terminal decahistidine tag decreased the 2-dimensional association rate constant 4-5 fold. Electrostatic attraction and steering, the important mechanism to enhance association rate constant between the soluble proteins, are not pronounced for interactions on the membrane. Protein orientation due to membrane anchoring dominates over electrostatic effects and together with the increased lifetime of the encounter complex consequence that 2-dimensional association rate constants are quite similar and do not correlate with association rate constants in solution. The 2- dimensional dissociation rate constants were generally 2-5-fold lower compared to the corresponding 3-dimensional dissociation rate constants in solution. Possible explanations for this are that long lifetime of the encounter complex stabilizes the ternary complex or that membrane tethering affects the interaction diagram. In conclusion, combined TIRFS-RIf detection turn to be powerful and versatile technique to characterize protein-protein interactions on membranes.Inter-zelluläre Kommunikation basiert häufig auf Liganden, welche selektiv von Rezeptoren auf der Plasmamembran erkannt werden, und durch Wechselwirkung mit diesen Rezeptoren Signaltransduktion im Zytoplasma aktivieren. Die molekularen Mechanismen der Signalvermittlung durch die Membran sind noch wenig verstanden. Die wichtigen Klassen der Zytokinrezeptoren und der Rezeptortyrosinkinasen werden durch Liganden aktiviert, die zu einer Di- oder Oligomerisierung von Rezeptoruntereinheiten führt, welche offenbar für die Aktivierung zytoplasmatischer Effektoren notwendig ist. Diese laterale Interaktion zwischen Rezeptoruntereinheiten lässt sich aus mehreren Gründen nicht mit der Interaktion der Proteine in Lösung vergleichen. Zum einen handelt es sich um eine Wechselwirkung in 2 anstatt von 3 Dimensionen, d.h. die Interaktionspartner haben durch die Verankerung auf der Membrane weniger Freiheitsgrade als in Lösung. Dabei spielt die eingeschränkte Rotation ein besondere Rolle, da sie zu einer Vor-Orientierung der Interaktionspartner führt. Ein weiterer wichtiger Unterschied ist die dramatisch langsamere Diffusion von Membran-verankerten Proteinen im Vergleich zu Proteinen in Lösung. Über die Einflüsse dieser Faktoren auf die Bildung von Proteinkomplexen an der Membran wurde sehr viel spekuliert, aber es liegen bis dato kaum systematische experimentelle Untersuchungen vor. In der vorliegenden Arbeit sollten Detektionsmethoden und Bindungsassays etabliert werden, mit welchen die Gleichgewichtskonstanten und die Ratenkonstanten von Ligand-Rezeptor Interaktionen auf Membranen in vitro bestimmt werden können. Als biologisches Testsystem wurde der Typ I Interferonrezeptor gewählt. Typ I Interferone (IFN) sind wichtige Zytokine in der angeborenen Immunabwehr von viralen Infektionen, und haben weitere wichtige Funktionen für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Interessanterweise binden verschiedene IFN an den gleichen Rezeptor, aber führen zu unterschiedlichen Wirkungsmustern. Diese Unterschiede müssen in der Wechselwirkung mit den Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 kodiert sein. Intensive Struktur-Funktions-Untersuchungen konnten keine Unterschiede in der Struktur oder Stöchiometrie der Ligand-Rezeptor Komplexen identifizieren, die durch verschiedene IFN rekrutiert werden. Allerdings unterscheiden sich für verschiedene IFN die Bindungskonstanten und die Ratenkonstanten der Wechselwirkung mit den Rezeptoruntereinheiten außerordentlich. Daher sind vermutlich die Effinzienz der Rekrutierung der Rezeptoruntereinheiten und die Dynamik des ternären Komplexes von zentraler Bedeutung für die differentielle Wirkung verschiedener IFN. Da der Ligand die beiden Untereinheiten auf der Membran verbrückt, sind hier 2- dimensionale Wechselwirkungen Membran-verankerter Proteine vermutlich die Grundlage unterschiedlicher Wirkung. Um diese Szenario zu emulieren, wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über Cterminale Histidin-tags an Festkörper-unterstützten Membranen mit Chelatorlipiden angebunden. FRAP-Experimente haben gezeigt, dass die so angebundenen Proteine lateral mit einer Geschwindigkeit von ca. 1 µm²/s diffundieren, also ähnlich der (lokalen) Diffusion auf der Plasmamembran. Zur Untersuchung der Ligand-induzierten Hetero-Dimerisierung von ifnar1-EC und ifnar2-EC auf Festkörper-unterstützten Membranen wurde ein Versuchsaufbau zur simultanen Detektion von Fluoreszenz und von Massenänderungen an Oberflächen implementiert. Dazu wurde die totalinterne Reflexions-Fluoreszenz Spektroskopie (TIRFS) mit der reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIf) kombiniert. TIRFS basiert auf der selektiven Anregung von Oberflächen-nahen Fluorophoren durch das evaneszente Feld, welches bei Totalreflexion an Grenzflächen wenige 100 nm mit dem benachbarten Medium wechselwirkt. Über Faseroptik wurde zusätzlich eine Illuminierung senkrecht zur Transducer-Oberfläche implementiert, über welche die Dicke einer Interferenzschicht reflektometrisch gemessen werden kann. Durch diese Methode können Bindungsereignisse an Oberflächen markierungsfrei quantifiziert werden. Da die Schichtdickenmessung bei 800 nm im NIR Bereich erfolgt, ist sie von der Fluoreszenzmessung im sichtbaren Bereich (500-700 nm) spektral separiert. Die Detektion von Fluoreszenz- und Massenänderungen an der Oberfläche wurde über die Fusion von Vesikeln mit Fluoreszenzmarkierten Lipiden charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass in der Tat beide Signale voneinander unabhängig voneinander und ohne detektierbares Übersprechen detektiert wurden. Das massensensitive Interferenzsignal wurde mittels Vesikelfusion kalibriert, da die dabei entstehende Lipiddoppelschicht eine definierte, reproduzierbare Masse auf der Oberfläche abscheidet. Für die massensensitive Interferenzdetektion ergab sich so ein Detektionslimit von etwa 10 pg/mm². Mittels Fluoreszenzdetektion konnten Oberflächenbeladungen von wenigen Molekülen/µm² detektiert werden. Durch Kombination mit einer automatisierten Fluidik konnten schnelle Injektionsschemata realisiert werden, so dass Ratenkonstanten von bis zu 5 s-1 aufgelöst werden konnten. Diese kombinierte Detektionsmethode wurde zunächst eingesetzt, um die einzelnen Interaktionen von Fluoreszenz-markiertem IFNα2 sowie anderen IFN mit ifnar1-EC bzw. ifnar2-EC zu charakterisieren. So konnten die Ratenkonstanten dieser Interaktionen bei sehr geringen Oberflächenkonzentrationen charakterisiert werden, was für eine genaue Bestimmung ohne Einfluss von Massentransport- Effekten notwendig ist. Durch simultane Detektion der Bindung über das Massensignal und das Fluoreszenzsignal wurde die Orts-spezifische Fluoreszenzmarkierung des Liganden IFNα2 untersucht, und gezeigt, dass die Bindung an die Rezeptoruntereinheiten durch die Fluoreszenzmarkierung nicht beeinflusst wurde. Zudem konnte kompetitive Bindung von IFN nicht nur an die hochaffine Untereinheit ifnar2, sondern auch an ifnar1, welche IFN nur mit sehr geringer Affinität erkennt, gezeigt werden. Im nächsten Schritt wurde die Ligand-induzierte Assemblierung des ternären Komplexes mit ifnar1-EC und ifnar2-EC auf fluiden Membranen untersucht. Dabei wurde bei hohen Rezeptorbeladungen sehr langsame Dissoziation des Liganden beobachtet, die bei niedrigen Rezeptorbeladungen deutlich schneller war. Diese Beobachtung deutete auf eine kinetische Stabilisierung des ternären Komplexes hin. Über Chasing-Experimente mit unmarkiertem Liganden konnte diese Vermutung bestätigt werden, da ein deutlich beschleunigter Austausch des Liganden beobachtet wurde. Da über das RIf-Signal die absoluten Oberflächenkonzentrationen von ifnar1-EC und ifnar2-EC bestimmt werden konnten, wurde so auch eine strikte 1:1:1 Stöchiometrie des ternären Komplexes gezeigt: war eine der Untereinheiten im Überschuss, dissozierte der überschüssige Ligand zunächst mit einer Kinetik, die dem entsprechenden 1:1-Komplex entsprach, bis sich ein stabiler 1:1:1-Komplex gebildet hatte. Die Bildung des ternären Komplexes wurde im Folgenden detailliert charakterisiert. Zunächst wurde die Dissoziationskinetik bei verschiedenen Oberflächenkonzentrationen der Rezeptoruntereinheiten in stöchiometrischem Verhältnis vermessen. Diese Kurven konnten durch ein 2-stufiges Assoziations- bzw. Dissoziationsmodell angepasst werden, in dem der Ligand im ersten Schritt an ifnar2-EC bindet und im zweiten Schritt mit ifnar1 auf der Membran einen ternären Komplex bildet. Dadurch, dass die Oberflächenkonzentrationen von ifnar1-EC und ifnar2-EC genau quantifiziert werden konnten, musste nur ein Parameter in diesem Modell angepasst werden, welcher der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante der 2- dimensionalen Interaktion des binären IFN/ifnar2-EC Komplexes mit ifnar1-EC beschreibt. Aus allen Experimenten mit Oberflächenbeladungen, die über einen Konzentrationsbereich von zwei Größenordnungen variierte, konnte reproduzierbar eine Bindungskonstante von ca. 40 Molekülen/µm² bestimmt werden. Erstaunlicherweise liegt diese Bindungskonstante deutlich über der typischen Konzentration von Rezeptoren auf der Zelloberfläche (ca. 1000/Zelle). Damit ist es wahrscheinlich, dass die Bildung des ternären Komplexes auf der Zelloberfläche durch die Bindungsaffinität bzw. die Rezeptorkonzentration limitiert ist. Diese Affinität lässt sich nicht durch Steigerung der Dosis kompensieren. Interessanterweise gibt es zudem IFN mit deutlich höherer Affinität zu ifnar1. Damit könnte diese Interaktion eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Ansprechverhaltens verschiedener Zellen spielen. Weitere Untersuchungen zur Bildung des ternären Komplexes wurden mit IFNα2 Mutanten durchgeführt, welche eine niedrigere Bindungsaffinität zu ifnar2-EC zeigten. Die Dissoziationskinetiken dieser Mutanten aus dem ternären Komplex mit ifnar1-EC und ifnar2-EC ergaben, dass selbst bei stöchiometrischen Konzentrationen der Rezeptoruntereinheiten durchaus auch die Bindung an ifnar1 im ersten Schritt erfolgen kann. Da die Ligandenbindung der Geschwindingkeits-bestimmende Schritte der Rezeptorassembliert darstellt, entscheidet die relative Assoziationswahrscheinlichkeit, inwieweit welcher dieser beiden Wege populiert ist. Damit ist nicht nur die Assoziationsratenkonstante, sondern auch die relative Konzentration der Rezeptoruntereinheiten für den Assemblierungsmechanismus wichtig. Da unterschiedliche IFN verschiedene Assoziationsratenkonstanten haben, sind durchaus verschiedene Assemblierungssmechanismen für verschiedene IFN denkbar. Um die Dynamik des ternären Ligand-Rezeptor-Komplexes auf der Membran zu charakterisieren wurden Assays etabliert, um die 2-dimensionale Interaktionskinetik direkt zu messen. Hier wurden zwei Strategien verfolgt. Zunächst wurde der Förster- Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Donor-markiertem ifnar2-EC und Akzeptor-markiertem ifnar1-EC eingesetzt, um die Ligand-Rezeptor Interaktion auf der Membran zu verfolgen. Durch schnelles Beladen mit einem Überschuss von unmarkiertem ifnar2-EC auf die Membran wurde ein Austausch von markiertem gegen unmarkierten ifnar2-EC über das Abklingen des FRET gemessen. Dieser Austausch wird bestimmt durch die 2-dimensionale Dissoziazionskinetik des ifnar2- EC/IFNα2 Komplexes die aus der Änderung des FRET-Signals bestimmt werden kann. Interessanterweise war die Dissoziationsratenkonstante, die aus dieser Kinetik bestimmt wurde, um einen Faktor 3-5 höher als die Dissoziationsratenkonstante des ifnar2-EC/IFNα2 Komplexes mit dem freien Liganden. Da die Bindung von ifnar1-EC keinen Einfluss auf die ifnar2-EC/IFNα2 Interaktion hat, müssen diese Unterschiede auf die Verankerung an der Membran zurückgeführt werden. Wahrscheinlich spielt die langsamere Diffusionskinetik hier eine entscheidende Rolle, die zu einer langsameren Separation der dissoziierten Komponenten führt. Diese Beobachtungen wurden bestätigt durch Bindungsassays, in denen die Austauschkinetik des Liganden im ternären Komplex bei Zugabe von unmarkiertem Liganden vermessen wurde. Dazu wurde eine der Rezeptoruntereinheiten im stöchiometrischen Überschuss auf die Membran geladen. Nach Bildung des ternären Komplexes mit Fluoreszenz-markiertem IFNα2 wurde der Überschuss an Rezeptoruntereinheit mit unmarkiertem Liganden in hoher Konzentration beladen. Der nun erfolgende Austausch von markiertem gegen unmarkierten Liganden wurde über das Fluoreszenzsignal verfolgt. Bei Verwendung geeigneter Mutanten ist diese Austauschkinetik wiederum durch die 2-dimensionale Dissoziationskinetik der Ligand-Rezeptor-Interaktion bestimmt. Mit diesen Bindungsassays wurden die Dissoziationskinetiken für ifnar1-EC und ifnar2-EC, sowie verschiedene Mutanten bestimmt. Aus der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante und der Dissoziationsratenkonstante konnte auch die 2-dimensionale Assoziationsratenkonstante berechnet werden. Basierend auf systematischen Untersuchungen konnten einige prinzipielle Eigenschaften von 2-dimensionalen Protein-Protein Interaktionen identifiziert werden. So bestätigte sich für alle Ligand- Rezeptor Interaktionspaare, dass die 2-dimensionale Dissoziationskinetik um einen Faktor 3-5 langsamer war als die entsprechende 3-dimensionale Dissoziation. Weiterhin ist konnte für die Assoziationskinetik beobachtet werden, dass die großen Unterschiede in der Assoziationsratenkonstante in Lösung, die durch elektrostatisches Wechselwirkungen zu erklären sind (electrostatic steering), nicht für die 2-dimensionale Interaktion auf der Membran beobachtet wurde. Weit wichtiger als elektrostatische Steuerung ist dagegen die „richtige“ Orientierung der Proteine an der Oberfläche: Durch Änderung der Orientierung von ifnar1-EC auf der Membran über ein N-terminales Histidin-tag sank die Assoziationratenkonstante um einen Faktor von >5. Dies ist insbesondere überraschend, weil ifnar1-EC eine flexible multi- Domänenstruktur hat und zudem relativ flexibel über das Histidin-tag an der Membrane angebunden ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Membranverankerung, die Flexibilität, die laterale Diffusionskinetik und die Oberflächenkonzentration zentrale Parameter für die Bildung und die Dynamik Zytokin-Rezeptorkomplexen auf Membranen sind. Diese Eigenschaften hängen auch von der lokalen Umgebung auf der Plasmamembran ab, die sich auch durch die Komplexbildung ändern können. Damit lässt sich erwarten, dass Rezeptorassemblierung in Zellen einen noch durchaus komplexeren Verlauf nehmen kann. In dieser Arbeit konnten diese Prozesse unter kontrollierten Bedingungen charakterisiert werden. Dabei erwies sich die neu etablierte Methode der simultanen TIRFS-RIf Detektion als äußerst versatil. Die komplementären Messgrößen dieser Detektionsmethode waren insbesondere nützlich, um die multiplen Parameter (Membran-Assemblierung, Rezeptorkonzentrationen) zu kontrollieren, und gleichzeitig komplexe Bindungsassays mit hoher Zeitauflösung durchzuführen. Eine breite Anwendung dieser Methode, um komplexe Prozesse an Membranen und an nicht-fluiden Oberflächen zu charakterisieren, ist vorauszusehen

SNARE assembly and regulation on membranes

Die Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Plasmamembran wird durch sogenannte SNARE-Proteine vermittelt. Die vorliegende Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis des Verhaltens des vesikelständigen SNARE-Proteins Synaptobrevin, sowohl in seiner nativen Organelle als auch in Liposomen rekonstituiert, bei. Die Reaktivität rekonstituierten Synaptobrevins ist bislang umstritten. So legten kürzlich durchgeführte Studien nahe, dass membranständiges Synaptobrevin nicht effizient in SNARE-Komplexe eingebaut wird (Hu et al., 2002; Kweon et al., 2003b). Deshalb habe ich die Bindungseigenschaften und die SNARE-Komplexbildungsreaktion auf Synaptobrevin exponierenden Membranen untersucht. So wie die lösliche Dömane bindet membranassoziiertes Synaptobrevin den SNAP-25/Syntaxin-Akzeptorkomplex, was zur Bildung eines stabilen, tetrahelikalen SNARE-Bündels führt. Kinetiksimulationen und Anpassung experimenteller Daten trugen dazu bei, den Reaktionsweg der SNARE-Komplexbildung auf Membranen aufzuklären. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen weisen darauf hin, dass es sich um eine robuste Reaktion handelt, die von den meisten endogenen und äußeren Faktoren wie Hirnzytosol, Membranfluidität, Chaotropizität, divalenten Ionen und der Lipidkomposition weitgehend unbeeinflusst bleibt, jedoch durch Anwesenheit schwacher Gegenionen signifikant verstärkt wird. In Einklang mit dieser Beobachtung ist auch die Einbaurate von in Liposomen rekonstituiertem Synaptobrevin in SNARE-Komplexe mit der auf synaptischen Vesikeln vergleichbar. Aufgrund ihrer hohen Reaktivität ist die Regulation von SNARE-Proteinen von hoher Bedeutung. Es ist gezeigt worden, dass Synaptobrevin in Membranen assoziiert an das Vesikelprotein Synaptophysin vorliegt, welches potentiell als SNARE-Regulatorprotein fungiert. Hier konnte ich zeigen, dass die Bindung von Syntaxin/SNAP-25 an Synaptobrevin in der Lage ist, dessen Assoziation an Synaptophysin aufzuheben.Drei monoklonale Antikörper, die sich gegen den ternären SNARE-Komplex nicht jedoch gegen die SNARE-Monomere richten, wurden erfolgreich hergestellt und mithilfe von Immunoblotting, Zellinien und Plasmamembran- Sheets charakterisiert. Ihre Bindungsstellen konnten kartiert werden. Desweiteren waren die Antikörper in der Lage, SNARE-Komplex-dissoziation in einem funktionellen Experiment zu inhibieren und können damit Einblick in die Dissoziationsmaschinerie geben. Auch könnte ihr Einsatz in anderen funktionellen Untersuchungen helfen, noch ausstehende Fragen zu beantworten. Außerdem wurden der Zustand sowie die Dynamik von SNARE-Komplexen in präsynaptischen Nervenendigungen untersucht. Dabei konnte ich zeigen, dass die SNARE-Komplexmengen in ruhenden und stimulierten Synaptosomen vergleichbar sind, was darauf hinweist, dass diese schnell wieder dissoziiert werden, sobald Exozytose stattgefunden hat. Einige SNARE-Komplexe konnten jedoch auf isolierten Organellen mittels Mikroskopie und Immunoblotting detektiert werden. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass Komplexdissoziation keine zwingende Vorraussetzung für Endozytose darstellt, wobei nicht ausgeschlossen werden kann, dass es sich bei den detektierten Komplexen um erst in vitro auf isolierten Organellen entstandene Komplexe handelt.The fusion of synaptic vesicles with the pre-synaptic plasma membrane is mediated by SNARE proteins. This work provides key insights into the behaviour of synaptobrevin, the SNARE protein localized to synaptic vesicles, in its native membrane organelle and when it is reconstituted in liposomes. The reactivity of reconstituted synaptobrevin has remained controversial. Recent studies have suggested that synaptobrevin inserted in membranes does not readily engage in SNARE complexes (Hu et al., 2002; Kweon et al., 2003b). I therefore explored the binding characteristics and assembly pathway of the SNAREs on synaptobrevin-bearing membranes. Like its soluble domain, synaptobrevin anchored in membranes binds to the syntaxin/SNAP-25 acceptor complex to form the stable tetra helical coiled coil SNARE bundle. Kinetic simulations and fitting of experimental data helped unravel the SNARE assembly pathway on membranes. Monitoring the effects of endogenous and extraneous factors on SNARE complex assembly suggested that assembly is a robust process, largely unaffected by brain cytosolic factors, membrane fluidity, chaotropicity, divalent ions and lipid composition but is considerably enhanced in the presence of weak counter-ions. In agreement with these observations, SNARE complex assembly rate on liposomes reconstituted with synaptobrevin and on synaptic vesicles was comparable. Being highly reactive molecules, the regulation of SNAREs has considerable importance. Synaptobrevin has been found to be associated in membranes with synaptophysin, an abundant protein localized to the synaptic vesicle and a potential regulator of SNARE complex assembly. I showed here that syntaxin/SNAP-25 binding to synaptobrevin in synaptic vesicles causes its dissociation from synaptophysin.Three monoclonal antibodies recognizing the ternary SNARE complex, but not the monomers, were successfully raised and characterised in immunoblots, cell-lines and plasma-membrane sheets. Their binding sites on the complex were mapped. In a functional assay, the antibodies abolished disassembly of the SNARE complex thus providing insights into the disassembly machinery.The antibodies can be used in other functional assays to answer pertinent questions. The status and dynamics of SNARE complexes was probed in pre-synaptic nerve-terminals. I found that the amount of SNARE complex is comparable in resting and stimulated synaptosomes, suggesting that they rapidly disassemble immediately after exocytosis has occurred. Some amount of complex was, however, found on isolated organelles when monitored by direct imaging or immunoblotting, suggesting that rapid disassembly of the SNARE complex is not a pre-requisite for endocytosis, though it cannot be ruled out that complexes formed on isolated organelles in vitro

Novel inhibitors of the tRNA-dependent amidotransferase of "Helicobacter pylori" : Peptides generated by phage display and dipeptide-like compounds

Cette thèse présente la découverte de nouveaux inhibiteurs de l’amidotranférase ARNt-dépendante (AdT), et résume les connaissances récentes sur la biosynthèse du Gln-ARNtGln et de l’Asn-ARNtAsn par la voie indirecte chez la bactérie Helicobacter pylori. Dans le cytoplasme des eucaryotes, vingt acides aminés sont liés à leur ARNt correspondant par vingt aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs). Ces enzymes sont très spécifiques, et leur fonction est importante pour le décodage correct du code génétique. Cependant, la plupart des bactéries, dont H. pylori, sont dépourvues d’asparaginyl-ARNt synthétase et/ou de glutaminyl-ARNt synthétase. Pour former le Gln-ARNtGln, H. pylori utilise une GluRS noncanonique nommée GluRS2 qui glutamyle spécifiquement l’ARNtGln ; ensuite, une AdT trimérique, la GatCAB corrige le Glu-ARNtGln mésapparié en le transamidant pour former le Gln-ARNtGln, qui lira correctement les codons glutamine pendant la biosynthèse des protéines sur les ribosomes. La formation de l’Asn-ARNtAsn est similaire à celle du Gln-ARNtGln, et utilise la même GatCAB et une AspRS non-discriminatrice. Depuis des années 2000, la GatCAB est considérée comme une cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques, puisqu’elle est absente du cytoplasme de l’être humain, et qu’elle est encodée dans le génome de plusieurs bactéries pathogènes. Dans le chapitre 3, nous présentons la découverte par la technique du « phage display » de peptides cycliques riches en tryptophane et en proline, et qui inhibent l’activité de la GatCAB de H. pylori. Les peptides P10 (CMPVWKPDC) et P9 (CSAHNWPNC) inhibent cette enzyme de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Leur constante d’inhibition (Ki) est 126 μM pour P10, et 392 μM pour P9. Des modèles moléculaires ont montré qu’ils lient le site actif de la réaction de transmidation catalysée par la GatCAB, grâce à la formation d’une interaction π-π entre le résidu Trp de ces peptides et le résidu Tyr81 de la sous-unité GatB, comme fait le A76 3’-terminal de l’ARNt. Dans une autre étude concernant des petits composés contenant un groupe sulfone, et qui mimiquent l’intermédiaire de la réaction de transamidation, nous avons identifié des composés qui inhibent la GatCAB de H. pylori de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Cinq fois plus petits que les peptides cycliques mentionnés plus haut, ces composés inhibent l’activité de la GatCAB avec des Ki de 139 μM pour le composé 7, et de 214 μM pour le composé 4. Ces inhibiteurs de GatCAB pourraient être utiles pour des études mécanistiques, et pourraient être des molécules de base pour le développement de nouvelles classes d’antibiotiques contre des infections causées par H. pylori.This thesis describes the discovery of inhibitors of a tRNA-dependent amidotransferase (AdT) and summarizes the present state of our knowledge about the two-step biosynthesis of Gln-tRNAGln and Asn-tRNAAsn in Helicobacter pylori. In eukaryotic cytoplasm, twenty amino acids (aa) are generally attached to their cognate tRNAs by twenty corresponding aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs). These enzymes have a high specificity, and their function is important to the proper decoding of mRNA. However, in a number of bacteria including H. pylori, GlnRS and/or AsnRS are absent. To synthesize Gln-tRNAGln, H. pylori first uses a noncanonical GluRS2 which is specific for tRNAGln to form Glu-tRNAGln; then the trimeric AdT (GatCAB) transforms Glu-tRNAGln into Gln-tRNAGln which is proper for protein biosynthesis. In a similar manner, the biosynthesis of Asn-tRNAAsn also takes place in H. pylori by using the same GatCAB and a canonical nondiscriminating AspRS. The widespread use of these indirect pathways among prominent human pathogens, and their absence in the mammalian cytoplasm, identify AdT as a promising target for the development of new and highly specific antimicrobial agents. By using phage display, we discovered several cyclic peptides rich in tryptophan and proline that inhibit H. pylori GatCAB. Peptides P10 (CMPVWKPDC) and P9 (CSAHNWPNC) are competitive inhibitors of GatCAB with respect to its substrate Glu-tRNAGln. The inhibition constants (Ki) of P10 and P9 are 126 and 392 μM, respectively. Their docking models revealed that they bind to the transamidation active site of GatB via π-π stacking interactions with Tyr81, as does the 3’-terminal A76 of tRNA. We also discovered two small dipeptide-like sulfone-containing inhibitors of H. pylori GatCAB by mimicking the intermediate of its transamidation reaction. Although they are much smaller than the cyclic peptides mentioned above, they are competitive inhibitors of GatCAB with respect to GlutRNAGln, with Ki values of 139 μM for compound 7 and 214 μM for compound 4. These inhibitors could be useful not only to study the reaction mechanisms of GatCAB, but also could be lead compounds for the development of a new class of antibiotics to treat infections caused by H. pylori

How Viruses Hijack and Modify the Secretory Transport Pathway

Eukaryotic cells contain dynamic membrane-bound organelles that are constantly remodeled in response to physiological and environmental cues. Key organelles are the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus and the plasma membrane, which are interconnected by vesicular traffic through the secretory transport route. Numerous viruses, especially enveloped viruses, use and modify compartments of the secretory pathway to promote their replication, assembly and cell egression by hijacking the host cell machinery. In some cases, the subversion mechanism has been uncovered. In this review, we summarize our current understanding of how the secretory pathway is subverted and exploited by viruses belonging to Picornaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Poxviridae, Parvoviridae and Herpesviridae families

Mammalian translation termination intermediates captured using PDMS microfluidics-based time-resolved cryo-EM (TRCEM)

Termination of translation in eukaryotes occurs when a translating ribosome encounters a stop codon (UAA, UAG, or UGA) in its A site. This triggers the recruitment of translation termination factors eRF1, a tRNA-mimicking protein responsible for decoding the stop codon and catalyzing peptide release, and eRF3, a translational GTPase that stimulates peptide release in a GTP-hydrolysis-dependent manner. Upon successful stop codon decoding by eRF1, eRF3 carries out GTP hydrolysis and dissociates from the ribosome. eRF1 subsequently gets accommodated into the peptidyl transferase center (PTC) and catalyzes the release of the nascent peptide. The structures for the pre-accommodated eRF1 with eRF3 trapped on ribosome using non-hydrolysable GTP analogs as well as for the PTC-accommodated eRF1 have been solved using cryogenic electron-microscopy (cryo-EM). The structures reveal the binding mode and interactions between the release factors and the pre-termination complex. However, the mechanism of eRF3 GTPase activation and subsequent eRF1 accommodation into the PTC remains poorly understood. To address this knowledge gap, we used single-particle time-resolved cryo-EM (TRCEM) to capture the structures of intermediates formed during the termination process. For our TRCEM experiments, we first developed a Polydimethylsiloxane (PDMS)-based modular microfluidic mixing-spraying device with a SiO₂ internal coating. The device has a SiO₂-coated PDMS-based 3D splitting-and-recombination (SAR) micro-mixer capable of mixing two fluids within 0.5 ms with more than 90% efficiency. The SiO₂coating strengthens the PDMS channels and acts as a hydrophilic barrier preventing sample adsorption to the PDMS surface. The micro-mixer is connected to a glass microcapillary that acts as the reaction channel. Channels of different lengths can be used to vary the overall reaction time between 10 ms and 1000 ms. The microcapillary is connected to a 3D micro-sprayer for generating a 3D plume of sprayed droplets. A cryo-EM grid is passed through the spray cone to collect droplets and is rapidly plunged into liquid cryogen for vitrification. By using TRCEM as well as the conventional blotting method for cryo-EM sample preparation, we captured the reaction between a pre-termination (pre-TC) mimic and the ternary complex of eRF1, eRF3, and GTP at reaction times of 450 ms, 900 ms, 15 s, and 10 min. Classification of the cryo-EM data resulted in maps for five distinct factor-bound classes. Four maps belonged to intermediates with densities for eRF1 and eRF3 bound to the pre-TC in varying conformations. The fifth map had a density matching the PTC-accommodated eRF1. Population analysis allowed us to arrange the classes chronologically and track the events leading to GTPase activation during the termination process. Atomic model building and refinement allowed us to determine the hydrolysis state of the eRF3-bound GTP and revealed the catalytic mechanism for GTP-hydrolysis. The models revealed a potential mechanism for GDP dissociation post-GTP-hydrolysis