The functional role of octopaminergic Neurones during locomotion of migrating locusts

Titelblatt und Inhalt 1. Einleitung 1 2. Material und Methoden 14 > 2.1. Versuchstiere 14 > 2.2. Elektrophysiologie 14   2.3. Stimulationsexperimente zur Untersuchung der Wirkung von DUM Neuronen auf den Muskelstoffwechsel 27 > 2.4. Stimulationsexperimente zur Ermittlung des Einflusses von neuronaler Aktivität auf das erneute Auswachsen persistierender Motoneurone während der Larvalentwicklung von Manduca sexta 31 > 2.5. Konfokale Mikroskopie 34 > 2.6. Lösungen und Chemikalien 35 3.   Ergebnisse 36 > 3.1. Die Aktivität von DUM Neuronen während des Laufens 36 > 3.2. Aktivität von DUM Neuronen während eines nicht pharmakologisch induzierten motorischen Musters im isolierten Mesothorakalganglion 51 > 3.3. Stimulationsexperimente zur Untersuchung der Wirkung von DUM Neuronen auf den Energiestoffwechsel des Muskels 73 > 3.4. Stimulationsexperimente zur Ermittlung des Einflusses von neuronaler Aktivität auf das Auswachsen persistierender Motoneurone während der Larvalentwicklung von Manduca sexta 81 4.   Diskussion 103 > 4.1. Die Aktivität von DUM Neuronen während des Laufens 103 > 4.2. Die Aktivität von DUM Neuronen unterschiedlichen Typs während eines nicht pharmakologisch induzierten Rhythmus 106 > 4.3. Stimulationsexperimente zur Untersuchung der Wirkung von DUM Neuronen aus den Energiestoffwechsel des Muskels 115 > 4.4. Stimulationsexperimente zur Ermittlung des Einflusses neuronaler Aktivität auf das Auswachsen persistierender Motoneurone während der Larvalentwicklung von Manduca sexta 125 5.   Zusammenfassung 131 6.   Summary 133 7.   Literatur 135 8.   Anhang 151 > 8.1. Curriculum vitae 151 > 8.2. Curriculum vitae (engl.) 152 > 8.3. Danksagung 153 > 8.4. Erklärung 154In dieser Arbeit sollte die funktionelle Rolle der octopaminergen efferenten DUM Neurone während der Lokomotion der Wanderheuschrecke Locusta migratoria ermittelt und beschrieben werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde im Rahmen der Doktorarbeit eine neue Arbeitstechnik entwickelt, die es erlaubt mit Hilfe von Implantationselektroden über einen längeren Zeitraum chronisch von Nerven abzuleiten. Diese Arbeitstechnik wurde in einer Kooperation mit der AG Duch dazu genutzt, die Aktivitätsmuster identifizierter Motoneurone während der späten Larval-Entwicklung von Manduca sexta zu ermitteln. A) Um einen genauen Aufschluß über die Aktivität der efferenten DUM Neurone während unterschiedlicher Verhaltensweisen zu erlangen, wurde versucht die Aktivität dieser Neurone mit Hilfe chronisch implantierter Elektroden zu ermitteln, während das intakte Tier läuft. Diese Aufgabe konnte mit den zur Verfügung stehenden Mittel im Rahmen der Arbeit nicht gelöst werden. Es gelang zwar Implantationselektroden für chronische Ableitungen zu entwickeln, doch war es trotz unterschiedlicher Versuchsansätze nicht möglich, die sehr kleinen Signale der efferenten DUM Neurone in den Ableitungen zu ermitteln. Da die Qualität der Ableitungen, die man mit diesen Implantationselektroden erreicht, sehr gut ist, sollte diese Technik zukünftige Arbeiten methodisch bereichern. B) In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivität der DUM Neurone während eines zentral generierten motorischen Rhythmus ermittelt. Dieser neuronale Rhythmus wurde in den Tieren durch das Durchtrennen der posterioren und anterioren Konnektive des Mesothorakalganglions induziert. Es konnte gezeigt werden, daß die verschiedenen Untergruppen von DUM Neuronen während dieses nicht pharmakologisch induzierten Rhythmus unterschiedlich aktiviert werden. Die DUM Neurone, die Beinmuskeln innervieren wurden rhythmisch depolarisiert. Diese Aktivierung korrelierte stark mit einer bestimmten Phase des Rhythmus, der `Levatorphase´. Alle anderen DUM Neurone zeigten entweder keine Änderung in ihrer Aktivität oder erhielten rhythmische inhibitorische Eingänge. C) Im Rahmen der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von DUM Neuronen Einfluss auf den Energiestoffwechsel von Flugmuskeln hat. Antidrome Stimulation von DUM Neuronen führte zu einer signifikanten Erhöhung von Fructose 2,6-Bisphosphat im Flugmuskel M119. Es konnte ferner gezeigt werden, daß dieser durch Oktopamin-Ausschüttung hervorgerufene Effekt über den PKA- Signalweg vermittelt wird. Dieser ist zwar notwendig um diesen Effekt hervorzurufen; er ist jedoch nicht ausreichend. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, das zentrale modulatorische Neurone in der Lage sind, den Energiestoffwechsel eines Flugmuskels zu beeinflussen. D) In einer Kooperation mit der AG Duch wurden die Aktivitätsmuster persistierender Motoneurone während der Larval-Entwicklung von Manduca sexta ermittelt. Die Aktivität der Motoneurone während definierter Abschnitte der Larval-Entwicklung ist stadienspezifisch. Es wurde gezeigt, daß die stereotypen Entladungsmuster der Motoneurone einen Einfluß auf ihre strukturellen Änderungen haben. Manipulationsexperimente, in denen diese Zellen in einem Zeitraum elektrisch stimuliert wurden, in dem sie normalerweise nur sehr geringe bzw. keine Aktivität zeigen, führten zu einem vorzeitigen, erneuten Auswachsen dieser Neurone. Die Stimulationsprotokolle wurden so gewählt, daß sie die zuvor ermittelte Aktivität der Neurone während der Häutung simulierten. Nur die Stimulation in Form dieser Aktivitätsmuster führte zu einem erneuten Auswachsen der Neurone. Bei tonischer Stimulation blieb ein erneutes Auswachsen dieser Neurone aus. Es konnte somit gezeigt werden, daß die postembryonale Modifikation neuromuskulärer Systeme nicht ausschließlich durch Hormone vermittelt wird, sondern daß es sich vielmehr um eine Wechselwirkung zwischen Hormonen und aktivitätsabhängigen Mechanismen handelt.The aim of this work was to investigate and describe the functional role of octopaminergic dorsal unpaired median (DUM) neurons during locomotion of the locust locusta migratoria. A new technique was developed to make chronic recordings from nerves of the ventral nerve cord without disturbing the freely moving animal. In a cooperation with the research group of Dr. Duch this technique was used to investigate the activity patterns of identified motoneurons during the late larval life of the hawkworm of manduca sexta. A) To investigate the activity patterns of efferent DUM neurons during locomotion under in vivo conditions electrodes were implanted chronically into locusts. Due to the very small amplitude of the action potentials caused by the small diameter of the axons, it was not possible to separate the signals of DUM neurons from background activity in extracellular recordings. Using different experimental designs and analytic methods it was not possible to extract DUM cell activity from the recordings. The high signal quality of the chronically implantable electrodes makes this new technique a useful tool for further investigations. B) The activity of DUM neurons during a central generated rhythm was investigated. The rhythm was induced by cutting the anterior and posterior connectives of the mesothoracic ganglion. In this preparation no pharmacological substances were applied and local sensory feedback in the segment stayed intact. It was shown that the different subtypes of DUM neurons were activated differently during central rhythmic activity. Leg innervating DUM neurons showed rhythmic depolarizations. This activity correlated strongly with the activity of motoneurons of the levator tibiae. All other subtypes of DUM neurons did not show any changes in activity or received inhibitory inputs, which were also correlated with the activity of the motoneurons of the levator. C) This work shows that the DUM neuron activity has a strong influence on flight muscle metabolism in the locust. Due to antidromic stimulation of DUM neurons, the level of the potent glycolytic activator fructose 2,6-bisphosphate (f2,6bp) was increased in the flight muscle M119. The level of f2,6bp was not increased in the contralateral muscle M119 which was used as an internal control. It was also shown that the cAMP-dependent protein kinase A is necessary, but not sufficient for signal transduction of this octopamin mediated effect. D) In cooperation with the workgroup of Dr. Carsten Duch activity patterns of motoneurons persisting during late larval life of manduca sexta were investigated. These activity patterns are specific for the developmental stages of the larvae. They correlate with stereotypic changes in behavior that occur prior to pupal ecdysis. The types of motoneurons recruited, the number of motor spikes, and the duration of bursts changed stereotypically with different stages. Inducing activity by stimulating these motoneurons selectively with ecdysis-like patterns resulted in a significant outgrowth of their terminal arborizations. In contrast, tonic stimulation with the same number of spikes did not result in a new outgrowth. This suggests that postembryonic modifications of the neuromuscular systems are affected by activity-dependent mechanisms and that they are not regulated by hormones only

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