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Ensuring Access to Safe and Nutritious Food for All Through the Transformation of Food Systems
Building body identities - exploring the world of female bodybuilders
This thesis explores how female bodybuilders seek to develop and maintain a viable sense of self despite being stigmatized by the gendered foundations of what Erving Goffman (1983) refers to as the 'interaction order'; the unavoidable presentational context in which identities are forged during the course of social life. Placed in the context of an overview of the historical treatment of women's bodies, and a concern with the development of bodybuilding as a specific form of body modification, the research draws upon a unique two year ethnographic study based in the South of England, complemented by interviews with twenty-six female bodybuilders, all of whom live in the U.K. By mapping these extraordinary women's lives, the research illuminates the pivotal spaces and essential lived experiences that make up the female bodybuilder. Whilst the women appear to be embarking on an 'empowering' radical body project for themselves, the consequences of their activity remains culturally ambivalent. This research exposes the 'Janus-faced' nature of female bodybuilding, exploring the ways in which the women negotiate, accommodate and resist pressures to engage in more orthodox and feminine activities and appearances
Towards a more just refuge regime: quotas, markets and a fair share
The international refugee regime is beset by two problems: Responsibility for refuge falls
disproportionately on a few states and many owed refuge do not get it. In this work, I explore
remedies to these problems. One is a quota distribution wherein states are distributed
responsibilities via allotment. Another is a marketized quota system wherein states are free to buy
and sell their allotments with others. I explore these in three parts. In Part 1, I develop the prime
principles upon which a just regime is built and with which alternatives can be adjudicated. The
first and most important principle – ‘Justice for Refugees’ – stipulates that a just regime provides
refuge for all who have a basic interest in it. The second principle – ‘Justice for States’ – stipulates
that a just distribution of refuge responsibilities among states is one that is capacity considerate. In
Part 2, I take up several vexing questions regarding the distribution of refuge responsibilities
among states in a collective effort. First, what is a state’s ‘fair share’? The answer requires the
determination of some logic – some metric – with which a distribution is determined. I argue that
one popular method in the political theory literature – a GDP-based distribution – is normatively
unsatisfactory. In its place, I posit several alternative metrics that are more attuned with the
principles of justice but absent in the political theory literature: GDP adjusted for Purchasing
Power Parity and the Human Development Index. I offer an exploration of both these. Second,
are states required to ‘take up the slack’ left by defaulting peers? Here, I argue that duties of help
remain intact in cases of partial compliance among states in the refuge regime, but that political
concerns may require that such duties be applied with caution. I submit that a market instrument
offers one practical solution to this problem, as well as other advantages. In Part 3, I take aim at
marketization and grapple with its many pitfalls: That marketization is commodifying, that it is
corrupting, and that it offers little advantage in providing quality protection for refugees. In
addition to these, I apply a framework of moral markets developed by Debra Satz. I argue that a
refuge market may satisfy Justice Among States, but that it is violative of the refugees’ welfare
interest in remaining free of degrading and discriminatory treatment
Development and evaluation of a treatment package for men with an intellectual disability who sexually offend
Sex offending in the general population has been a focus of interest for some time due to the damaging nature of the behaviour, and the need to reduce recidivism. Theoretical and clinical advances (Finke1hor, 1986; HM Prison Service, 1996; Marshall, Anderson, & Fernandez, 1999; Serran & Marshall, 2010) in treatment for sex offenders in the general population have been extended to men with an intellectual disability at risk of sexual offending (Lindsay, 2009). The purpose of this project is to develop and evaluate the SOTSEC-ID version cftrus model. Participants are adult males from 15 different locations across England and Wales, with an intellectual disability or borderline cognitive functioning and who have committed sexual offences. A pilot study clarified assessments and procedures, and individual data over several years is presented. A qualitative study using Interpretive Phenomenological Analysis (JP A) illustrates the 'meaning making' of participants' treatment experience through six major themes. A reliability and validity study assesses the four main quantitative measures, QACSO, SAKA, SOSAS, and VESA, finding limited support for criterion validity for the SOSAS and SAKA, excellent inter-rater reli"ability for all four main measures, and good to excellent inter-rater reliability on all but the SAKA Finally, a quantitative study, in collaboration with the wider SOTSEC-ID group, uses a repeated measures design to compare the QACSO, SOSAS and SAKA across pre-group, post-group and follow. up. Significant main effects and post-hoc comparisons were in the predicted direction for all measures. A range of information on demographic, clinical and criminogenic factors including offending during treatment or follow-up are also presented. A recidivism rate of 12.3% over a year was calculated for the sample. The treatment model and collaborative framework is recommended for wider adoption
Intervening on hypertension in Zambia: development of a culturally sensitized lifestyle programme to reduce disease incidence in urban areas
Background/purpose:
Hypertension, like other non-communicable diseases, is becoming a major public health problem for Sub-Saharan Africa (SSA). Its increasing prevalence is driven by an epidemiological transition with more people leading unhealthy lifestyles, including poor diet and physical inactivity. This project aimed to explore the use of participatory methods with an urban community in Zambia in co-developing a culturally sensitized hypertension prevention intervention.
Methods:
The intervention development study was divided into four phases. I scoped and synthesized existing literature on risk factors (non-modifiable and modifiable) for hypertension in SSA in Phase One. The identified risk factors and their drivers informed Phase Two community members focus group discussions and stakeholder interviews to explore the local context in the study site to clarify the problem, identify which hypertension risk factors were malleable (potential factors to target), the mechanism of change, and how to deliver this. The findings informed the development of the causal pathway, the intervention theory of change and the Phase Three co-development of the intervention core components and small-scale evaluation. Five co-development workshops (four with local residents and one with local stakeholders) iteratively informed identification of priority risk factors, the delivery format and setting, and finalization of intervention core components. The pilot intervention was then tested with volunteer participants (N=34) to assess feasibility, acceptability and potential effectiveness in Phase four.
Results:
The scoping review identified the most common risk factors for hypertension in SSA. Residents FGDs and key stakeholder interviews, informed by the scoping review findings, identified a number of potentially malleable hypertension risk factors at individual and interpersonal levels, including high salt intake and other dietary factors, low physical activity, excess body weight, central obesity, high alcohol intake and smoking. From these, the workshops prioritised intervening on salt intake, other dietary factors, and physical inactivity. Using these suggestions, an 8-week group-based intervention (CHiPI) was codeveloped. Stakeholders proposed evaluation of the CHiPI on a small scale and delivery through churches: “nearly all residents belong to a church”. Stakeholders also identified community health workers and church leaders as delivery facilitators. The intervention core components were agreed and refined in close consultation with residents. These included linguistic and cultural adaptations of SMART goal setting and self-monitoring tools, which were iteratively tested and refined to reflect the local socio-cultural context. The small-scale evaluation of the intervention showed high acceptability, feasibility and potential effectiveness in improving health literacy, adoption of healthier diets (less salt added during cooking [p=0.014], reduction in added salt to the plate at mealtimes [p=0.001], increased fruit intake [p=0.001], reduced fried meals [p = 0.001]), increased physical activity [p=0.01] and reduced sedentary lifestyle [p = 0.001]. Reductions in body weight [p = 0.002], BMI [p = 0.001], WC [p = 0.001], SBP [-3mmHg, p=0.003] and DBP [-4mmHg, p = 0.001] were also observed.
Conclusions and implications:
Participatory methods succeeded in engaging local residents and stakeholders in the development of a potentially effective culturally sensitized, 8-week, group-based hypertension prevention lifestyle intervention for delivery through churches in Zambia. Having demonstrated high feasibility, acceptability and potential effectiveness, taking this intervention to a larger evaluation to obtain evidence of effectiveness can inform hypertension prevention intervention development in Zambia and other SSA countries
Solving the Rubik’s cube of Indian sport: exploring impactful factors and alternative ways to facilitate success
The heavy investment of nations in high-performance sport seems justified by the belief that high-performance sporting success can lead to national pride and mass participation. This would then provide a larger pool of talent for selection of future successful athletes, whilst also promoting participation and greater physical activity for others. Although India too seems to follow a similar philosophy, and has consistently been investing in sport, its performance at international sport, especially the Olympic Games has not been impressive. This is particularly distressing when considered against the country’s large population. Given that India sees worth in investing in high-performance sport, potential ways to facilitate sporting success need to be explored.
Consequently, this thesis adopted a pragmatic approach to explore sport development in India. Specifically, potential factors contributing to the limited success were explored and potential alternatives to facilitate India’s ongoing efforts of achieving sporting success on the international stage were proposed. The first step involved exploring Indian sport from a policy viewpoint to gain deeper knowledge about potential reasons that might be limiting the impact of numerous policies implemented so far. A long-standing issue with policy implementation and a potential lack of policy learning were concluded as two of the main reasons impacting sporting success. A potential for India to adopt bottom-up and top-down approaches to policy implementation and policy transfer were proposed as alternative ways for India to overcome the policy issues.
There was, however, a need to gather a rich picture of the current scenario of Indian sport. Therefore, perceptions of high-level key stakeholders were explored through a semi structured interview to gain in-depth knowledge about Indian sport. Reflecting the challenges of size and scope, and the consequent need to triangulate and generalise the conclusions, further exploration was completed through a quantitative survey. Significant findings from these empirically driven studies included: i) a lack of sporting culture; ii) a need to develop quality Indian coaches and a coaching system; and iii) a need to increase use and knowledge of sport science support.
Of these conclusions, coach development was prioritised for three main reasons, its significance in the wider literature, the fact that India lacked a coaching system and Indian coaches being criticised for their relatively poor knowledge (including misconceptions and limited use of sport sciences). Therefore, an India-specific model aimed at developing quality Indian coaches and a coaching system was proposed. Given the policy implementation issues, however, the feasibility of the model was tested through another empirically driven study. Finally, a revised model for coach development was offered that might contribute to India’s efforts of succeeding at international sports
Smart-antenna techniques for energy-efficient wireless sensor networks used in bridge structural health monitoring
Abstract: It is well known that wireless sensor networks differ from other computing platforms in that 1- they typically require a minimal amount of computing power at the nodes; 2- it is often desirable for sensor nodes to have drastically low power consumption. The main benefit of the this work is a substantial network life before batteries need to be replaced or, alternatively, the capacity to function off of modest environmental energy sources (energy harvesting). In the context of Structural Health Monitoring (SHM), battery replacement is particularly problematic since nodes can be in difficult to access locations. Furthermore, any intervention on a bridge may disrupt normal bridge operation, e.g. traffic may need to be halted. In this regard, switchbeam smart antennas in combination with wireless sensor networks (WSNs) have shown great potential in reducing implementation and maintenance costs of SHM systems. The main goal of implementing switch-beam smart antennas in our application is to reduce power consumption, by focusing the radiated energy only where it is needed. SHM systems capture the dynamic vibration information of a bridge structure in real-time in order to assess the health of the structure and to predict failures. Current SHM systems are based on piezoelectric patch sensors. In addition, the collection of data from the plurality of sensors distributed over the span of the bridge is typically performed through an expensive and bulky set of shielded wires which routes the information to a data sink at one end of the structure. The installation, maintenance and operational costs of such systems are extremely high due to high power consumption and the need for periodic maintenance. Wireless sensor networks represent an attractive alternative, in terms of cost, ease of maintenance, and power consumption. However, network lifetime in terms of node battery life must be very long (ideally 5–10 years) given the cost and hassle of manual intervention. In this context, the focus of this project is to reduce the global power consumption of the SHM system by implementing switched-beam smart antennas jointly with an optimized MAC layer. In the first part of the thesis, a sensor network platform for bridge SHM incorporating switched-beam antennas is modelled and simulated. where the main consideration is the joint optimization of beamforming parameters, MAC layer, and energy consumption. The simulation model, built within the Omnet++ network simulation framework, incorporates the energy consumption profiles of actual selected components (microcontroller, radio interface chip). The energy consumption and packet delivery ratio (PDR) of the network with switched-beam antennas is compared with an equivalent network based on omnidirectional antennas. In the second part of the thesis, this system model is leveraged to examine two distinct but interrelated aspects: Gallium Arsenide (GaAs) based solar energy harvesting and switched-beam antenna strategies. The main consideration here is the joint optimization of solar energy harvesting and switchedbeam directional antennas, where an equivalent network based on omnidirectional antennas acts as a baseline reference for comparison purposes.Il est bien connu que les réseaux de capteurs sans fils diffèrent des autres plateformes informatiques
étant donné 1- qu’ils requièrent typiquement une puissance de calcul minimale aux
noeuds du réseau ; 2- qu’il est souvent désirable que les noeuds capteurs aient une consommation
d’énergie dramatiquement faible. La principale retombée de ce travail réside en la durée
de vie allongée du réseau avant que les piles ne doivent être remplacées ou, alternativement,
la capacité de fonctionner indéfiniment à partir de modestes sources d’énergie ambiente (glânage
d’énergie). Dans le contexte du contrôle de la santé structurale (CSS), le remplacement de
piles est particulièrement problématique puisque les noeuds peuvent se trouver en des endroits
difficiles d’accès. De plus, toute intervention sur un pont implique une perturbation de l’opération
normale de la structure, par exemple un arrêt du traffic. Dans ce contexte, les antennes
intelligentes à commutation de faisceau en combinaison avec les réseaux de capteurs sans fils
ont démontré un grand potentiel pour réduire les coûts de réalisation et d’entretien de systèmes
de CSS. L’objectif principal de l’intégration d’antennes à commutation de faisceau dans notre
application réside dans la réduction de la consommation énergétique, réalisée en concentrant
l’énergie radiée uniquement là où elle est nécessaire. Les systèmes de CSS capturent l’information
dynamique de vibration d’une structure de pont en temps réel de manière à évaluer la santé
de la structure et prédire les failles. Les systèmes courants de CSS sont basés sur des senseurs
piézoélectriques planaires. De plus, la collecte de données à partir de la pluralité de senseurs
distribués sur l’étendue du pont est typiquement effectuée par le biais d’un ensemble coûteux
et encombrant de câbles blindés qui véhiculent l’information jusqu’à un point de collecte à une
extremité de la structure. L’installation, l’entretien, et les coûts opérationnels de tels systèmes
sont extrêmement élevés étant donné la consommation de puissance élevée et le besoin d’entretien
régulier. Les réseaux de capteurs sans fils représentent une alternative attrayante, en termes
de coût, facilité d’entretien et consommation énergétique. Toutefois, la vie de réseau en termes
de la durée de vie des piles doit être très longue (idéalement de 5 à 10 ans) étant donné le coût
et les problèmes liés à l’intervention manuelle. Dans ce contexte, ce projet se concentre sur la
réduction de la consommation de puissance globale d’un système de CSS en y intégrant des
antennes intelligentes à commutation de faisceau conjointement avec une couche d’accès au
médium (couche MAC) optimisée. Dans la première partie de la thèse, une plateforme de réseau
de capteurs sans fils pour le CSS d’un pont incorporant des antennes à commutation de faisceaux
est modélisé et simulé, avec pour considération principale l’optimisation des paramètres
de sélection de faisceau, de la couche MAC et de la consommation d’énergie. Le modèle de
simulation, construit dans le logiciel de simulation de réseaux Omnet++, incorpore les profils
de consommation d’énergie de composants réels sélectionnés (microcontrôleur, puce d’interface
radio). La consommation d’énergie et le taux de livraison de paquets du réseau avec antennes
à commutation de faisceau est comparé avec un réseau équivalent basé sur des antennes omnidirectionnelles.
Dans la deuxième partie de la thèse, le modèle système proposé est mis à
contribution pour examiner deux aspects distrincts mais interreliés : le glânage d’énergie à partir
de cellules solaire à base d’arséniure de Gallium (GaAs) et les stratégies liées aux antennes
à commutation de faisceau. La considération principale ici est l’optimisation conjointe du glânage d’énergie et des antennes à commutation de faisceau, en ayant pour base de comparaison
un réseau équivalent à base d’antennes omnidirectionnelles
Evolutionary ecology of biological rhythms in malaria parasites
Biological rhythms are a ubiquitous feature of life and are assumed to allow organisms coordinate their
activities with daily rhythms in the abiotic environment resulting from the rotation of the Earth every 24
hours. The genes and molecular mechanisms underpinning circadian clocks in multicellular organisms
are relatively well understood in contrast to the evolution and ecology of circadian rhythms. Circadian
rhythms mediate interactions between organisms; from predators and prey, to mating behaviours
between males and females, to hosts and parasites. The role of daily rhythms in infections is gaining
traction because explaining the regulatory mechanisms and fitness consequences of biological rhythms
exhibited by parasites and hosts offers new avenues to treat infections. Here, I explore how periodicity
in parasite traits is generated and why daily rhythms matter for parasite fitness. My work focuses on
malaria (Plasmodium) parasites which exhibit developmental rhythms during replication in the
mammalian host’s blood and during transmission to insect vectors. Rhythmic in-host parasite replication
is responsible for eliciting inflammatory responses, severe anaemia, fuels transmission, and can confer
tolerance to anti-parasite drugs. Thus, understanding both how and why the timing and synchrony of
parasites are connected to the daily rhythms of hosts and vectors may make treatment more effective
and less toxic to hosts.
My papers integrate an evolutionary ecology approach with chronobiology and parasitology to
investigate how host-parasite-vector interactions shape the evolution of rhythmicity in parasites traits. I
have used a rodent malaria parasite model system (Plasmodium chabaudi) for my experiments,
capitalising on the tractability of this model for the human malaria, P. falciparum. P. chabaudi exhibits a
24-hour rhythm in replication, facilitates ecologically realistic studies because experiments can be
carried out in vivo (compared to the in vitro limitations on studying human parasites), and perturbations
to the timing of the in-host and in-vector environments are straightforward. My findings include:
1) Perturbing the timing of parasite rhythms with respect to the timing of host rhythms (analogous
to giving the parasites “jet lag”), results in a fitness cost to the parasites, evident by a 50%
reduction in both asexually replicating and transmission stage parasites.
2) The consequences of temporal mismatch to the host manifest very early in the infection (within
48 hours, i.e. the first 1-2 cycles of replication) and are dependent on the parasite stage by
which infections are initiated (0-12 hour old parasites suffer a cost, whereas 12-24 hour
parasites benefit).
3) The timing of the parasite replication cycle is independent of the canonical ‘core’ host clock (i.e.
transcription translation feedback loop) and instead depends on the timing of feeding-fasting
rhythms of the host.
4) If perturbed, the timing of the parasite’s rhythm reschedules to regain synchrony with the
timing of the host’s rhythm within 7 replication cycles. Specifically, parasites achieve this by
speeding up the replication rhythm by 2-3 hours per cycle, and the rate of rescheduling is
independent of parasite density.
5) Naturally asynchronous Plasmodium species are ‘resistant’ to conditions that lead to alignment
with host rhythms in synchronously replicating species. This suggests that unknown ecological
differences between these parasite species selects for vastly different schedules of within-host
replication rather than some species being constrained to replicate asynchronously.
6) In addition to the timing of parasite rhythms impacting directly upon within-host dynamics,
timing also matters – albeit indirectly - for transmission, via impacts on the population dynamics
of the vector. For example, receiving a blood meal in the morning makes mosquitoes more likely
to lay eggs, lay slightly sooner and have a larger clutch size than those feeding at night. Yet,
whilst mosquitoes infected with malaria die sooner, the effects of taking a blood meal at
different times of day do not impact transmission of an asynchronously replicating malaria
parasite.
It is beneficial for parasites to be in synchronization with their host’s feeding-fasting rhythms and
plasticity in the IDC duration facilitates this synchrony by enabling parasites to make small daily changes
to their IDC schedule when necessary. Understanding the extent of, and limits on, plasticity in the IDC
schedule is important as it may reveal targets for novel interventions, such as drugs to disrupt IDC
regulation and preventing IDC dormancy conferring tolerance to existing drugs. More generally, our
results provide a demonstration of the adaptive value of biological rhythms and the utility of using an
evolutionary framework to understand parasite traits
The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis, también conocida como “Bt”, es una bacteria gram positiva que forma endosporas. Se trata de un organismo ubicuo, aunque se encuentra principalmente en el suelo o en ambientes con alta presencia de insectos. Fue aislada por primera vez en 1901 por el bacteriólogo Shigetane Ishiwata en muestras de intestino de gusanos de seda (Bombyx mori) infectados y fue apodada como “Sottokin- Bacillus” (“Bacilo de muerte súbita”) por la muerte que causaba cuando era ingerida por larvas de gusanos de seda. Pocos años después, el biólogo Ernst Berliner aisló B. thuringiensis de crisálidas de polilla mediterránea de la harina (Ephestia kuehniella) infectadas con esta bacteria en la provincia de Thuringia, Alemania, otorgándole el nombre por el que se conoce en la actualidad. Además, Berliner describió la presencia de una especie de cristal dentro de la célula bacteriana, aunque la naturaleza de este elemento era desconocida en ese momento. Fue en 1954 cuando el microbiólogo Thomas A. Angus descubrió que esas inclusiones proteicas con formas de cristal, producidas en la fase de esporulación de Bt, eran responsables de su acción insecticida y las apodó “proteínas Cry” (del inglés crystal). A parte de estas proteínas, se han descrito varios factores de virulencia posteriormente, tal y como la b-exotoxina, la cual puede inhibir ARN polimerasas dependientes de ADN, las hemolisinas, o exoenzimas como las quitinasas. En el año 1996 se descubrió una nueva clase de proteínas, conocidas actualmente como Vip3 (de las siglas en inglés “Proteínas Vegetativas Insecticidas”), producidas durante la fase vegetativa de Bt, las cuales son altamente tóxicas para lepidópteros.
Desde entonces, una amplia variedad de proteínas de Bt tóxicas para diferentes invertebrados (principalmente insectos y nematodos) han sido identificadas a partir de un gran número de cepas aisladas, y han sido clasificadas en función de la similitud de su secuencia proteica. En la actualidad existen 391 secuencias holotípicas de proteínas Bt, y los principales órdenes de insectos que han mostrado susceptibilidad a algún tipo de proteína son Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e Hymenoptera. Esta tesis se centra en el estudio de dos familias de proteínas, las proteínas Cry de tres dominios (“3D-Cry”) ylas proteínas Vip3 que afectan a lepidópteros. El modo de acción de estas proteínas, así como el ciclo de vida de Bt tras la infección del insecto constan de una serie de pasos, desarrollados en las siguientes páginas.
El primer paso supone la ingestión de Bt por parte del insecto. Tras ello, los cristales que forman las proteínas Cry se solubilizan por la rotura de los puentes disulfuro, liberando las protoxinas presentes en el cristal. Esta solubilización es dependiente tanto del pH como de condiciones reductoras del intestino. En el caso de las proteínas Vip3, no precisan de este paso de solubilización, ya que son secretadas al exterior de la bacteria en forma soluble. Tanto las protoxinas Cry solubilizadas como las protoxinas Vip, son procesadas por enzimas digestivas como las tripsinas y quimotripsinas presentes en los fluidos intestinales, produciendo una toxina activa que en general es resistente a posteriores procesos proteolíticos. Una vez activadas, las toxinas deben atravesar la membrana peritrófica del intestino medio. Esta membrana es una matriz rica en quitina, cuya función principal es la separación entre el alimento y las células epiteliales. Esta separación impide que el alimento pueda tener un efecto abrasivo sobre el intestino y también sirve como primera barrera contra infecciones de tipo bacteriano, vírico o parasítico. Asimismo, el papel protector que ejerce la membrana peritrófica puede verse comprometido por la acción de las quitinasas endógenas o exógenas de Bt (enzimas capaces de degradar la quitina). Tras superar la barrera de la membrana peritrófica, se produce una interacción entre las proteínas Cry o Vip3 y la membrana de borde en cepillo de las células del intestino medio, consideradas como las células diana de las toxinas. Uno de los retos principales en la investigación de Bt durante las últimas décadas ha sido identificar cuáles son las moléculas que se unen de forma específica con las toxinas Cry o Vip3, así como deducir la relevancia de la función de esta interacción, tanto en el modo de acción de las toxinas como en los mecanismos de resistencia.
Actualmente, existen tres tipos de proteínas de membrana que pueden funcionar como receptores putativos para las proteínas Cry en insectos: las aminopeptidasas N (“APN”), las cadherinas y los transportadores “ABC” (del inglés “ATP-Binding Cassette”). Aunque inicialmente la fosfatasa alcalina (“ALP”) también fue propuesta como posible receptor, al estar asociada con la resistencia, no se dispone de evidencias claras de su implicación en la unión. En cuanto a los transportadores ABC, son los receptores que mayor importancia han adquirido en los últimos años. Son proteínas de membrana con capacidad para transportar distintas moléculas de forma activa gracias a la hidrólisis de ATP. Dentro de esta gran superfamilia, el transportador más caracterizado ha sido el ABCC2, tanto por su implicación como receptor de proteínas Cry1, como por haber sido encontrado alterado en distintas especies de lepidópteros resistentes a proteínas Bt.
En cuanto a las toxinas Vip3, los estudios de interacción han demostrado que los sitios de unión no son compartidos con las toxinas Cry. Existen pocos estudios concluyentes sobre los posibles receptores específicos para las toxinas Vip3. Algunos trabajos indican que tanto la proteína ribosomal S2 como el “scavenger” tipo C pueden actuar como receptores de la toxina Vip3A en varias especies del género Spodoptera. Además, este último se encuentra involucrado en la vía endocítica, siendo capaz de mediar la internalización de la toxina.
Existen numerosos estudios que han señalado que la actividad tóxica de las proteínas de Bt se debe principalmente a su habilidad para formar poros en la membrana de las células diana. Este modelo (conocido como modelo de formación de poro) es actualmente el más respaldado por la comunidad científica debido al gran número de trabajos experimentales que lo apoyan tanto para toxinas de tipo Cry como para Vip3. Una vez unidas las toxinas a los receptores específicos, se forma una estructura oligomérica que se inserta en la membrana de las células intestinales constituyendo el poro. De esta forma se pierde la integridad de la membrana, generando un desequilibrio osmótico que provoca un hinchamiento de las células, desembocando en lisis celular. Tras la lisis de las células intestinales se produce una septicemia, causada principalmente por el paso a la hemolinfa no sólo de las propias esporas o formas vegetativas de Bt, sino también de todas aquellas bacterias oportunistas y otros patógenos presentes en el bolo alimentario. Como consecuencia, el insecto acaba muriendo. Por último, Bt puede aprovechar este nicho para continuar creciendo y esporular, favoreciendo su posterior dispersión en el medio.
Dada su eficacia como insecticida, el ser humano ha utilizado Bt para contener la expansión de distintas plagas. El primer producto basado en Bt se comercializó en 1938, y desde entonces, su uso, ya sea en formato de formulado Bt o plantas con expresión de genes Bt, ha incrementado notablemente. Como ejemplo, las hectáreas de plantas de maíz, algodón o soja Bt aumentaron de 1,1 millones en el año 1996 a 101 millones en 2017. Por ello, no es de extrañar que B. thuringiensis sea el agente microbiano más utilizado entre las soluciones biotecnológicas presentes en la actualidad. Aunque los investigadores han trabajado durante muchos años en descifrar cómo se comportan las proteínas de este excepcional organismo en el ambiente intestinal de los insectos, aún queda mucho por entender. El conocimiento de forma detallada del modo de acción de las proteínas insecticidas de Bt es un punto clave para garantizar su uso a largo plazo por varias razones; nos permite entender en cierta medida, cuáles son los mecanismos alterados en el desarrollo de la resistencia, dónde se localizan y por qué se encuentran alterados. Además, gracias a este conocimiento podemos combinar proteínas Bt con diferentes modos de acción con la finalidad de maximizar su efecto. En la presente tesis, hemos profundizado en el estudio de estas interacciones mediante distintas aproximaciones.
En el primer y segundo capítulo, nos hemos centrado en estudiar las interacciones que ocurren entre las propias proteínas Cry, así como con el transportador ABCC2 de la rosquilla verde, Spodoptera exigua. Dado que esta plaga es de alta relevancia por su impacto en la agricultura, y se encuentra ampliamente distribuida en todo el mundo, conocer cómo las proteínas Cry1 interaccionan con los receptores del intestino es muy importante, ya que los productos basados en Bt y las plantas Bt que contienen proteínas Cry1 son comúnmente utilizadas para controlar esta plaga. En estos dos capítulos, elegimos una aproximación ex vivo, ya que el uso de estos sistemas, como el cultivo de células de insecto o las preparaciones de vesículas de membrana intestinales (“BBMV”, de sus siglas inglés, Brush Border Membrane Vesicles), nos permiten entender y profundizar en interacciones específicas que pueden pasar desapercibidas durante los ensayos in vivo. Para ello, utilizamos una línea de células de insecto que expresa el transportador ABCC2 en su versión completa, denominada “Sf21- FRA”. Además, utilizamos proteínas Cry1A marcadas con yodo para realizar ensayos de unión y no marcadas para ensayos de viabilidad celular. Descubrimos que las proteínas Cry1A unen de forma específica y con alta afinidad a células que expresan el transportador, y que la presencia de éste en células es suficiente para causar toxicidad de las proteínas Cry1A probadas. Estos resultados apoyan que el ABCC2 de S. exigua actúa como receptor funcional de las proteínas Cry1A, tal y como se ha observado en otras especies plaga. A través de los dos capítulos, la falta de competencia de la proteína Cry1C, así como la ausencia de toxicidad en células HEK que expresan el transportador, descartaron al ABCC2 como receptor para esta proteína. Estos resultados indican que la proteína Cry1C pueda poseer distintos sitios de unión en el intestino medio de S. exigua, ya que es altamente efectiva en el control de esta plaga.
Por otra parte, observamos un fenómeno insólito en los ensayos de unión con I125-Cry1Aa, en los que concentraciones bajas de Cry1Aa no marcada y utilizada como competidor, producía una respuesta estimulatoria, causando un incremento de la unión total conseguida por la I125-Cry1Aa a las células expresando el transportador. Dado que a concentraciones altas de competidor, éste competía de una forma habitual, exploramos por qué ocurría este comportamiento bifásico. Pudimos observar también estimulación causada a bajas concentraciones, e incluso más acentuada, al utilizar las proteínas Cry1Ab, Cry1Ac o la proteína híbrida H04 (que contiene los mismos dominios I y II que las proteínas Cry1Ab/c, pero contiene el dominio III de la Cry1C) como competidores contra la I125-Cry1Aa. Sin embargo, no observamos dicho comportamiento bifásico al utilizar la proteína Cry1C o la proteína híbrida H205 (con los mismos dominios I y II que la proteínas Cry1C y mismo dominio III que la Cry1Aa), lo cual indica la importancia de poseer el mismo dominio I, común a estas tres Cry1As, para que se produzca la fase de estimulación de la unión.
Curiosamente, también pudimos observar dicho comportamiento, aunque de forma mucho más discreta, cuando utilizamos I125-Cry1Ac y Cry1Aa como competidor. Para revelar la naturaleza del agente causante de la fase estimulatoria, realizamos electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de la fase insoluble de los ensayos de competencia, así como autoradiografías de la misma. Tanto el tamaño molecular como la intensidad de la banda observada nos permitió determinar que la forma oligomérica de la proteína es la responsable de la respuesta estimulatoria, señalando este hecho la habilidad de las proteínas Cry1A de formar tanto homo- como hetero-oligómeros. Para confirmarlo, utilizamos dos versiones mutantes de Cry1Aa y Cry1Ab, que poseen una sustitución del aminoácido Arg por Glu en la posición 99 del dominio I que impide la oligomerización. La ausencia de fase estimulatoria o banda correspondiente a oligómero en las autoradiografías al usar estos mutantes como competidores, confirman la habilidad de homo- y hetero-oligomerizar de las proteínas en su versión no modificada, a través del dominio I, así como de unir con alta afinidad al transportador ABCC2.
Además, las toxicidades observadas con las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac en células expresando el transportador, así como los ensayos de competencia llevados a cabo con I125-Cry1Ac en el primer capítulo, nos permiten concluir que estas dos proteínas comparten un sitio de unión, que tiene poca afinidad por la proteína Cry1Aa. La presencia de este sitio compartido se pudo confirmar con el uso del híbrido H04, lo cual señaló al dominio II de Cry1Ab/c como dominio con mayor afinidad por este sitio. Dado que la proteína Cry1Aa parecía tener un papel menos relevante en la unión a este sitio, pero aún así es tóxica para células expresando el transportador, realizamos experimentos de competencia tanto con I125-Cry1Aa como con I125-Cry1Ac, usando Cry1Aa y el híbrido H205 como competidores. Pudimos concluir que la proteína Cry1Aa debe de tener otro sitio de unión en el transportador, el cual tendría alta afinidad por el dominio III de Cry1Aa. A este sitio de unión, también se podría unir la proteína Cry1Ab con alta afinidad, dado que comparte el mismo dominio III que la Cry1Aa. Por último, a través de distintas combinaciones de proteínas Cry1Aa en ensayos de toxicidad pudimos observar que, la ventaja obtenida al formar mayores concentraciones de hetero-oligómeros que de homo-oligómeros no sólo también se trasladaba a mayores tasas de unión, sino a mayor toxicidad sobre las células. En resumen, el primer capítulo destaca la importancia del ABCC2 como un receptor multivalente para las proteínas Cry1A y el segundo capítulo demuestra la habilidad de formar hetero-oligómeros por las proteínas Cry1Aa para beneficiarse de la multivalencia del transportador.
Hasta ahora, es evidente que el transportador ABCC2 de S. exigua y de otros lepidópteros juega un rol relevante en la unión y toxicidad de al menos las proteínas Cry1A, pero pocos miembros de la familia de este transportador han sido caracterizados. Es muy probable que estemos pasando por alto numerosos transportadores ABC que interaccionen con proteínas insecticidas de B. thuringiensis, ya que hasta ahora se han descrito más de 400 transportadores ABC en artrópodos. Por ello, estudiar nuevas interacciones entre transportadores ABC y proteínas insecticidas es un gran reto en la investigación con Bt. A parte del ABCC2, sólo unos pocos transportadores ABC se han relacionado con proteínas Bt, como el ABCB1 del coleóptero Chrysomela tremulae, receptor de la proteína Cry3Aa, el ABCA2 de los lepidópteros Helicoverpa armigera y B. mori, receptor para las proteínas Cry2A, o el ABCC3 de S. exigua, Spodoptera litura, Plutella xylostella, H. armigera y Spodoptera frugiperda, relacionado con la acción de la proteína Cry1Ac. Curiosamente, ningún otro miembro de la familia ABC (aparte del ABCC2) se ha caracterizado en el gusano bellotero Heliothis virescens, plaga en la que se relacionó por primera vez un transportador ABC con las proteínas de Bt, hace ya más de una década.
En el tercer capítulo de la tesis, hemos realizado una búsqueda de nuevos transportadores ABC en H. virescens para abordar esta falta de conocimiento. Hemos identificado y descrito dos nuevos transportadores, el ABCC3 y ABCC4. El análisis filogenético ha demostrado alta similitud entre el transportador ABCC3 y el ya descrito ABCC2, como se ha observado en otras especies como H. armigera. Sin embargo, el transportador ABCC4 es una proteína más distante atendiendo a su secuencia de aminoácidos. Según los modelos de predicción, ambos transportadores estarían formados por dos dominios transmembrana y seis regiones en la parte exterior que se corresponden con asas extracelulares. Evaluamos la funcionalidad de los nuevos transportadores como posibles receptores para proteínas Bt desarrollando mutantes de deleción para cada uno de los genes HvABCC3 o HvABCC4 mediante la técnica de CRISPR/Cas9. Para ello, microinyectamos huevos y cruzamos los adultos resultantes hasta obtener líneas de homozigotos mutantes. Seguidamente, realizamos bioensayos con Cry1Aa, Cry1Ac y Vip3A. Los resultados preliminares no mostraron reducción en la toxicidad para ninguna línea mutante, en comparación con la colonia de H. virescens usada como control. Sin embargo, sí se observaron mortalidades ligeramente disminuidas en la concentración más baja de Cry1Ac utilizada, especialmente en la línea de mutantes con deleción en el ABCC3, aunque el grado de significación debe de estudiarse en mayor profundidad dado el bajo número de réplicas en los bioensayos. Además, falta por confirmar la correcta deleción de los transportadores en ambas líneas de mutantes mediante la secuenciación del ARN mensajero de los genes. Dado que los ARN guías utilizados se diseñaron en el primer exón de cada gen, podrían haber pautas de lectura alternativas, por lo que debemos de asegurar que no se estén expresando otras versiones funcionales de los transportadores. Por tanto, la posible implicación de los nuevos transportadores ABC con proteínas Bt tendrá que estudiarse en mayor profundidad. Por ahora, se sabe que el ABCC3 de S. exigua, H. armigera S. exigua, H. armigera y S. frugiperda comparte redundancia funcional con el ABCC2 en el modo de acción de las proteínas Cry1A y juega un rol menor y secundario en su toxicidad. Para comprender si este fuera el caso en H. virescens, son necesarios experimentos adicionales como desarrollar líneas de mutantes con deleción del ABCC2 o dobles mutantes con deleción del ABCC2 y ABCC3, así como la evaluación, mediante ensayos con proteínas marcadas, de las capacidades de unión sobre las líneas de los mutantes. Por último, aparte del ABCC2, ABCC3 y ABCC4, aún queda un gran número de transportadores ABC por describir en H. virescens.
Además de estudiar la interacción entre receptores putativos y proteínas Bt y buscar receptores desconocidos, debemos de tratar de entender cómo y por qué ciertas especies plaga consiguen desarrollar resistencia a proteínas Bt, ya que la resistencia es la principal amenaza para el uso continuado de plantas Bt o bioinsecticidas basados en Bt. Está ampliamente aceptado que la alteración de unión al receptor de membrana es la principal causa de resistencia a proteínas Bt en especies plaga, aunque otros mecanismos pueden estar involucrados. Las alteraciones de unión pueden ocurrir por diferentes razones, tales como la reducción en la expresión de un gen que codifique para una proteína de membrana, deleciones en su secuencia, o mutaciones aminoacídicas que impidan la interacción entre la toxina y el receptor. Por ello, es interesante caracterizar la funcionalidad de los receptores que han sido encontrados alterados en diferentes plagas resistentes. A día de hoy, existen numerosos estudios funcionales con las versiones “wild-type” de transportadores ABC usando diferentes técnicas, tales como silenciamiento con ARN de interferencia, deleción mediante CRISPR, o expresión en un sistema ex vivo, pero pocos estudios han caracterizado la funcionalidad de las versiones alteradas de los transportadores ABC de cepas resistentes. Además, se propuso que el mecanismo de transporte activo de los transportadores tiene que funcionar correctamente para que pueda actuar como receptor de las proteínas Cry. En el cuarto capítulo, caracterizamos la funcionalidad de una versión alterada del ABCC2 de una colonia de S. exigua resistente a XentariTM, un bioinsecticida basado en Bt. Este transportador contiene una deleción en el segundo dominio de unión a nucleótidos (“NBD2”) que fue genéticamente ligada a la resistencia en un estudio previo. Sin embargo, no se han realizado ensayos de funcionalidad del transportador mutado para dilucidar si esta mutación es la causa de la resistencia. Para ello, utilizamos una línea celular de insecto que expresa la versión truncada del transportador denominada Sf21-XenR, así como la línea celular utilizada en los dos primeros capítulos que expresa la versión original del ABCC2 (Sf21-FRA).
A través del estudio de la secuencia de aminoácidos, identificamos cuatro mutaciones adicionales, en forma de sustitución,tres de las cuales se encontraban en los NBD intracelulares y una de ellas en una de las asas extracelulares (asa extracelular número 4). Las primeras caracterizaciones mediante Western blot e inmunohistoquímica mostraron la expresión del transportador truncado y su localización en la membrana de las células Sf21-XenR, lo cual indica que las mutaciones presentes en el transportador no impiden su presencia en la membrana. Tras ello, realizamos ensayos de viabilidad celular con las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac, tanto en células Sf21-XenR como en células Sf21 no transformadas como control. Las tres proteínas ensayadas fueron tóxicas contra células con expresión del transportador truncado, y a un nivel muy similar al encontrado previamente en células que expresan el transportador en su versión original (Capítulo 1). Además, los ensayos de unión con Cry1Ac marcada con I125 revelaron unión específica al transportador truncado, así como un valor similar en la constante de
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Multilevel Assessment of Seagrass Response to Thermal Stress: Stress Memory and Epigenetic Changes
Seagrasses are being threatened globally due to human-induced environmental changes with ocean warming being one of the main players. A better understanding of the interaction between seagrasses and warming is, therefore, crucial to secure a sustainable future for these paramount foundation species.
Through a literature review and a series of ad hoc mesocosm and field experiments using four seagrass species from the northern (i.e. Mediterranean: Posidonia oceanica, Cymodocea nodosa) and southern (i.e. Australia: Posidonia australis and Zostera muelleri) hemisphere and by applying multi- and inter-disciplinary approaches [i.e. photo-physiology, growth, pigments, gene expression (RT-qPCR and RNA-seq), and genome screening (ddRADseq)], here I (i) identify potential commonalities in the effects of warming and the responses of seagrasses across different levels ranging from molecular to planetary [e.g. warming strongly affects seagrasses at all levels while seagrass responses diverge amongst species, populations and over depths]; (ii) demonstrate the existence of thermal stress memory for the first time in seagrasses [e.g. non-primed plants suffered significant reduction in photosynthetic capacity, leaf growth and pigments content, while heat-primed plants were able to cope better with recurrent stressful events]; (iii) reveal the molecular mechanisms that potentially govern the formation (priming phase) and activation (memory phase) of thermal stress memory in seagrasses [e.g. response to warming of non-primed plants required the involvement of several cellular compartments and processes while in heat-primed plants the response focused on a more limited group of processes]; (iv) explore the involvement of epigenetic modifications (DNA methylation and histone modifications in particular) in thermal stress response and thermal stress memory in seagrasses [e.g. results from gene expression analyses demonstrated a high activation of genes related to epigenetic modifications and thermal stress memory during the triggering event in both heat-primed and non-primed plants]; (v) broaden our knowledge in interspecific divergences in response to warming among seagrass species (northern versus southern hemisphere seagrasses and climax versus pioneer species) [e.g. results showed that northern hemisphere Posidonia better dealt with warming than its southern hemisphere counterpart and, in both hemispheres, pioneer seagrasses were more thermal tolerant than climax ones]; (vi) investigate the molecular basis of local adaptation to high temperature condition in seagrasses [e.g. ddRADseq data analysis identified several outlier loci potentially responsible for thermal stress response and epigenetics]; and finally (vii) suggest future directions for seagrass research [e.g. studies involving additional species and populations, investigation of the seagrass holobiont, seagrasses as a solution to mitigate climate change among others].
This thesis provides novel insights into the field of seagrass ecology and yields potential implications for future seagrass conservation and restoration activities in an era of ocean warming
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